【doc】高活性乳酸菌发酵剂培养条件优化及活性测定

【doc】高活性乳酸菌发酵剂培养条件优化及活性测定 高活性乳酸菌发酵剂培养条件优化及活性 测定 70微生物学毒志2006年5月第26卷第3期JOURNALOFMICROBIOLOGYMay2006Vo1.26No.3 高活性乳酸菌发酵剂培养条件优化及活性测定 孙翠焕,冀宝营,王艳华,刘晓辉,席晓光,吴英春 (1.辽宁省微生物科学研究院.辽宁朝阳122000;2.朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000) 摘要采用自行分离选育的乳酸茵进行混合培养,对浓缩培养条件进行正交试验,以德氏乳杆茵保加利亚 亚种和嗜热链球菌的茵数及其比值作为考察指标.结果为以改良MRS为基础培养基,以6%番茄汁,0.3%玉 米浆作为生长因素,42?培养,过程采用流加氨水作中和试剂,使培养基酸度控制在pH6.0,浓缩培养液中 茵数可达9.15×10个/mL,球茵与杆茵比例为1.2:1;最佳茵体收集时间为7.5h;一30?下冷冻干燥得到的 乳酸茵发酵剂含活茵数达到8.2×10m个/g,球茵与杆茵比例为1.5:1,发酵剂活性达0.435;0,4?冷藏6 个月,乳酸茵活性没有损失.产品可直接加入到灭茵奶中发酵,具有大众化特点,广泛用于各类乳品厂,饭店, 食堂及家庭. 培养;浓缩培养;茵体收集时间;应用广泛 关键词高活性乳酸茵发酵荆;混合 中图分类号0.939.117文献标识码A文章编号1005—7021(2006)03—0070—04 OptimizationofCulturalConditionandActivityDetermination ofHighlyActiveLactobacillusLeaveningAgent SUNCui—huan,儿Bao—ying,WANGYan—huan,LIUXiao—hui,XIXiao—guang2,WUYing—chun (1.LiaoningAcademyofMicrobiology,Chaoyang122000;2.ChaoyangNormalCollege.Chaoyang122000) AbstractAself.isolatedandbredlactobacillusstrainwasadoptedtOcarryoutmixedc~tureandorthogonaIexperi? mentonconcentratedculturingcondition.ThecellnumberofLactobacillusdelbruckiisubsp.bulgaricusandStrep— tococcu,sthermophilusandtheirratioweresetaSanobservationindexes.TheresuItsshowedthatwhenusingim? provedMRSasabasicmedium,addedwith6%tomatojuiceand0.3%cornsyrupasgrowingfactors,cultureat 4212,duringtheprocessaddingaquaammoniumasneutralizeradoptingflow-addingmethodtOcontrolthemedium acidityatpH6.0,thecellnumberintheconcentratedmediumcouldreachuptO9.15× 10/mL,andtheproportion ofCocCUSandbacillusWas1.2:1.andtheoptimumcellcollectiontimeWas7.5h.Alactobacillus?leaveningagentWas obtainedwith一30?freeze?dr~ngmethod,containing8.2× 1010/mLoflivecell,with1.5:1oftheratioofCOCCUS andbacillus,and0.435ofthevitalityofleaveningagent.Afterstoringat0, 412forsixmonths,novitalitylostof lactobacillusWasfound.TheperformanceofthelactobacillusleaveningagentWasthe8~lmeassimilarimportedone. Itcanbedirectlyaddedintosterilemilkandfermente,haspoPul81"characteristicsandiswidelyusedinvariousdairy factory,restaurant,dining?hallandfamily. Keywordshighlyactivelactobacillusleaveningagent;mixedculture;concentratedculture;cellcollectingtime; deapplication 发酵乳制品质量的好坏主要取决于发酵剂的 品质类型及活性.本文研究的高活性乳酸菌发酵 剂使用过程方便,品质稳定,可直接加入到灭菌乳 中进行发酵,省去了传统方法生产发酵乳制品过 程中菌种活化,扩培等预处理工作,过程易操作控 制,可有效保证发酵乳制品产品质量均一稳定[5_. 在发达国家,高活性的乳酸菌发酵剂由专门生产 发酵剂的企业提供,来满足发酵乳制品企业的要 收稿日期:2006—01—09 作者简介:孙翠焕女.副研究员.从事食品微生物方面的研究. 3期孙翠焕等:高活性乳酸茵发酵剂培养条件优化及活性测定71 求.由于我国乳品工业特别是发酵乳制品起步较 晚,因此对乳酸菌发酵剂的研究较少,具有自主知 识产权的乳酸菌发酵剂的研究和开发几乎是个空 白.目前国内大多数较有实力的乳品企业在使用 进口乳酸菌发酵剂产品,中小型企业由于使用进 口发酵剂成本较高,生产发酵乳制品时大多采用 继代式发酵剂,由于在传代过程中的污染及各种 菌种比例失衡等原因导致产品质量较差.因此应 用上还未普及,而对于食堂,家庭等小规模制作更 是一个空白. 目前研究水平的乳酸菌发酵剂,要首先考虑 顾客的爱好,使发酵乳产品最大限度地符合顾客 和市场的需要.个性化,质量稳定,使用方便,价 格适中,发酵产品温和可口,顺滑稠厚,有益健康 的乳酸菌发酵剂是近年来的发展趋势.采用本研 究室分离选育的优良乳酸菌菌种,进行乳酸菌发 酵剂培养条件优化试验,研究的高活性乳酸菌发 酵剂是一种经济,方便实用型发酵剂,具有大众化 特点,广泛用于各类乳品厂,饭店,食堂及家庭. 本研究为其国产化及普及应用奠定了理论基础. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种本研究室自行分离选育的生产性 能优良的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌 各1株,作为试验用菌株. 1.1.2培养基以本研究室配制的改良MRS 为基础培养基,加入不同生长因素优化浓缩培 养基. 1.1.3冻干保护剂悬浮液(质量分数,%)脱脂 乳粉10,葡萄糖2,维生素C0.5,硫脲0.5, NHdCl0.5【o'. 1.1.4仪器设备超净工作台,恒温培养箱,灭 菌锅,电热恒温干燥箱,高速低温离心机,显微镜, 血球计数板,真空冷冻干燥机. 1.2方法 1.2.1浓缩培养工艺研究采用德氏乳杆菌保 加利亚亚种和嗜热链球菌进行混合培养,接菌量 均为10'个/mL,比例为1:1.按(3)对浓缩培 养条件进行正交实验,改良MRS培养基中生长 因子为番茄汁和玉米浆,培养温度为37,42, 45?,利用磷酸缓冲盐和中和试剂NaOH及氨水 调整培养液中酸度【7J,使培养基酸度控制在 pH6.0,以活菌数及球菌和杆菌的菌数比例作为 考察指标.通过绘制菌体的生长曲线,确定菌体 收集时间. 1.2.2乳酸茵发酵剂的干燥及活性考察浓缩 培养液在12000r/min,15min离心,得到的菌 体用冻干保护剂悬浮液洗涤1次,再用其悬浮菌 体,进行冷冻干燥.根据乳酸菌的生理特性及预 试验结果,设计冻干温度为一(30?2)?【6J,真空 度为10-2Pa,干燥时间为24h,菌粉含水率达到 3%,测定菌体存活率,球菌与杆菌比例及发酵剂 活性. 1.2.3检测方法?酸度:采用0.1tool/L氢氧 化钠溶液中和滴定法;?乳酸菌计数:用自制的死 活菌染液做为稀释液,稀释倍数为25倍,显微镜 下计数;?菌体存活率测定:把干燥菌粉还原为原 液浓度后进行测定,菌体存活率(%)=干燥后乳 酸菌活菌数/干燥前乳酸菌活茵数X100%;?乳 酸菌发酵剂活性测定:把冻干菌粉以0.01%的比 例接入无菌脱脂奶中,37.8?恒温培养3.5h, 测定酸度,如果酸度达到0.4%,则认定活性较 好,并以酸度的数值来表示【8J. 2结果与讨论 2.1浓缩培养条件优化 k(3)正交试验因素水平及实验结果见表 1[1J.从表1看出,当各因素处于A2B】D3水平 时,活菌数在9组实验中最高,为8.7×10个/ mL.预实验结果表明,乳酸菌发酵剂中球菌与杆 菌比例在1,3:1范围内,发酵乳制品在感观状态 及口味方面均较好.从9组实验结果来看,球菌 与杆菌比例均在此范围内,该项指标均符合要 求【9J.分析表1计算结果,从k值看,当番茄汁 用量为6%,玉米浆用量为0.3%时,活菌数最高, 温度以42?为宜,而3种中和方式中以采用氨 水作中和试剂活菌数最高.把这四个因素的最好 水平组合起来,就得到了一个好的浓缩培养条件 A2B2C2D3.从极差R来看,影响浓缩培养液中活 菌数的主次因素为A>D>C>B,考虑到正交实 验的局限性,需要做验证实验以证实并找出最好 的培养工艺,对A2B1C2D3,A2B2C2D3,A2BlC2D3, 微生物学杂志26卷 A2B3C2D3进行验证实验.实验结果与分析结果 相一致,在A2B2C2D3条件下,培养液中活菌数最 高,为9.15×10个/mL,球菌与杆菌比例为 1.2:1,可以确定为最佳浓缩培养条件. 表1浓缩培养条件优化实验结果 Table1Resultsofoptimumconditionsofconcentratedculture 1(0.2) 2(0.3%) 3(0.4%) 1 2 3 1 2 3 19.4 22.7 20.7 6.47 7.57 6.9 1.1 1.4:1 2.0:1 1.4:1 1.8:1 1.5:1 1.8:1 1.7:1 1:1 1.2:1 2.2菌体收集时间的确定 按照正交实验确定的浓缩培养条件,进行德 氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌混合菌种的 液体培养,根据不同培养时间的活菌数绘制菌体 生长曲线[引,见图1. 一 氟 霞 氟 掘 图1浓缩培养中菌体生长曲线 Table1Growthcurveoflactobacillusof~oncentratedculture 图1显示嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚 亚种在混合培养时,分别经历了延滞期,对数生长 期,平衡期和衰退期的生长过程.德氏乳杆菌保 加利亚亚种平衡期在7,8.5h,文献显示.1, 其最佳菌体收集时间为平衡期早期,初步确定其 菌体收集时间在7,7.5h.嗜热链球菌在对数 生长后期收获的菌体细胞,对冷冻和干燥敏感性 较低,因此7,8h为最佳球菌收集时间.另外, 在培养至7.5h,培养液中活菌数为9.15×10个 /mL,菌数最高,球菌与杆菌比例为1.2:1.因 此,为保证干燥发酵剂中菌体存活率,确定混合培 养最佳菌体收集时间在7.5J. 2.3乳酸菌发酵剂的干燥及活性考察 浓缩培养液离心,洗涤后,用冻干保护剂悬浮 菌体,进行冷冻干燥3,得到的乳酸菌粉的存活 率为89.6%,菌粉含活菌数为8.2×1010个/g,球 菌与杆菌比例为1.5:1.实验结果发现,球菌与 杆菌的菌数比例在冷冻干燥前后发生了变化,球 菌数比例增大,说明在本实验条件下,冻干过程对 德氏乳杆菌保加利亚亚种的细胞损伤程度大于嗜 热链球菌,因此菌体存活率相对低些L4J. 根据测定结果,乳酸菌发酵剂活性达0.435; 7517O8O28 566886587 ,一一,.,.?加?加旧3 ???7?l9f:盯3?,.,.叭? .2233?==??mm?.??,,?123 123456789bR 3期孙翠焕等:高活性乳酸菌发酵剂培养条件优化及活性测定 0,4?冷藏6个月,测定菌数,菌数比例,发酵 剂活力,产品感观指标,结果未发生变化,说明乳 酸菌活性没有损失,发酵剂性能未发生变化. 3结论 目前对乳酸菌发酵剂的研究与生产,多数采 用单菌种培养,干燥,再混合使用的方法.本研究 采用自行分离选育的生产性能优良稳定的乳酸菌 进行混合菌浓缩培养,对培养条件进行了优化试 验,得到了最佳培养条件.经冷冻干燥制备的乳 酸菌粉在菌数,球菌与杆菌比例,发酵活性方面均 达到了预定的,0,4?冷藏6个月,菌体活 性没有损失.在冷冻干燥过程中杆菌所占比例有 所下降,在以后的研究中将对冻干保护剂及冻干 温度等因素进行详细研究,以提高杆菌存活率,保 证球菌与杆菌的最佳菌数比例. 参考文献: [1]ROBINSONRK.MicrobiologyofstarterCulture[J].Dairy Microbiology,1985,113—156. [2]NEIJWC.Determinationofgrowthparametersoflactocoeei inmilkandultrafilterredmilk[J].JournalofScience, 1995,78:17—23. [3]CARVALHOAS.SILVAJ.Protectivedfectofsor~toland monocK)diulllglutamateduringstorageoffreeze-driedhetieacid bacteria[J].Le1..sit,2001,83:203—210. [4]CASTROH,TEIXEIRAPM,KIRBYR.Changesinthe membraneofLoz'tobacillusbulgario~duringstoragefollowing freeze-drying[J].BiotechnologyLetters,1998,18:99—104. [5】丛玉婷.DVS乳酸菌种在我国的应用及其开发研树[J】.中 国乳品工业,2004,10:27—29. [6]郭本恒.乳品徽生物[M].北京:中国轻工业出版社,2001, 230—239. [7](英国)A.Y.泰米迈,R.k.罗宾逊着,姜竹茂主译.酸乳科学 与技术[M].北京:中国农业出版社,2003,449—460. [8]郭本恒.功能性乳制品[M].北京:中国轻工业出版社, 2001,1:74—80. [9]刘飞.罗地亚9001直投型发酵剂发酵特性研究[J].中国乳 品工业,2005,33(1):11—13. [10]李霞.保加利亚乳杆菌超浓缩培养及生化代谢规律的研究 (自然科学版)[J].河南工业大学,2005,26(2):75— 78. [11]郭本恒.益生菌[M].北京:化学工业出版社,2004,176— 187. ----------------堂童堂堂堂堂坐堂堂堂堂 掌? i敬告作者:} i<微生物学杂志>一直被美国<化学文摘(cA)>,<英联邦农业文摘(cAB)>等国内:} i夕I权威检索期刊收录转载,本刊提示广大作者,论文发表后,应经常去各大图书馆查阅:} i论文被转载情况.这将对您的职称晋升,课题申报,业务考核,继续研究等体现学术水:} i编辑部,以便本刊在期刊评比,年检,考核中作为重要依据.:} i本刊开辟转载信息栏目,将作者的反馈信息及时刊登.:} 联系地址:辽宁省朝阳市文化路二段22号t t崔 i邮编:122000l i电话:042卜2914613?ti E—mail:Lnwsuxh@mail.cyptt.Ln.cni} 2本刊编辑部l毒'''.' 崔t