东海养殖大黄鱼细菌多样性分析

东海养殖大黄鱼细菌多样性分析 东海养殖大黄鱼细菌多样性分析 第27卷第3期 2005年08月 海洋渔业 MarineFisheries V0l_27.No.3 Aug.,2005 文章编号:1004—2490(2005)03—0241—05 东海养殖大黄鱼细菌多样性分析 郭全友,许钟,杨宪时 (1.中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业重点开放实验室,上海200090; 2.上海水产大学食品学院,上海200090) 摘要:对2004年9月在闽东三都湾4个养殖场取样的大黄鱼进行了细菌多样性定性和定量分析.新捕获 大黄鱼细菌总数为1.8X10,6.0X10.cfu/g.从养殖密集海区的鱼体分离出135株细菌,对它们形态,生理 生化,营养特征等进行系统鉴定,结果显示革兰氏阴性菌占优势.优势菌群为气单胞菌属(Aerorrumasspp.)和 嗜麦芽寡养单胞菌(Steotromonasmahophilia),比例为34.1%和21.0%,摩氏杆菌属(Moraxellaspp.),不动细 菌属(Acinetobacterspp.)出现比例较少,均为2.2%,出现了较多数量的弗氏柠檬酸杆菌(CitrobacterBeundii) (5,2%),阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)(9.6%). 关键词:养殖大黄鱼;细菌菌丛;优势菌;微生物污染;东海 中图分类号:$917.1文献标识码:A BacterialdiversityinculturedPseudosciaenacrocea fromtheEastChinaSea GUOQuan.you.一,XUZhong,YANGXian.shi (1.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisher3Sciences, KeyandOpenlJ~tboratoryofMarineandEstuarineFisheries,Ministr3"ofAgriculture,Shanghai200090,China; 2.FoodScienceCollegeofShanghaiFisheriesUniversit),Shanghai200090,China) Abstract:Samplesweretakenfromfourfish— farmsinSeptember2004inSanduBay.theeastofFujian province,andthebacterialdiversityofculturedPseudosciaenacroceawasqualitativelyandquantitativelv investigated.Thetotalviablecountofnewly—caughtPseudosciaenacroceareached1.8× 10一6.0×10cfu/g. Atotalof135bacterialstrainswereisolatedfromfishofdenselyculturedwaters, andtheirmorphological, physiological,biochemicalandnutritionalcharacteristicswereanalyzed.TheresuItsindicatedthatGram negativebacteriaweredominated.ThepercentageofAeromonasspp. (34.1%)andSteotromonasmaltophilia (21?0%)werenoted,whileasmallpercentageofMoraxellaspp.(2.2%)andAcinetobacterspp.(2.2%) wereobservedandafewerpercentageofCitrobacterfreundii(5.2%)andCitrobacterfreundii(9.6%)were alsofound. Keywords:CulturedPseudosciaenacrocea;bacterialflora;dominatedbacteria;microbialp011uti0n;theEast ChinaSa 收稿日期:2005—06—16 基金项目:农业部引进国际先进农业科学技术项目资助(2001—478) 作者简介:郭全友(1974一),男,河南遂平人,在读研究生,从事水产品微生物安全研 究. 通讯作者:杨宪时,Tel:021—65678984,E—mail:yangxianshi@21cn.com 海洋渔业2005往 新捕获的鱼类其身上的细菌组成与生活环境,季节,捕获方法等有关.19世纪初,欧洲,日本,澳大 利亚,印度等国对热,冷,温水海域所产鱼类的微生物组成进行了研究?.许多研究者认为,冷水及温 带海域的鱼类以非发酵革兰氏阴性菌为主要菌群,如假单胞菌属(Pseudomonasspp.),希瓦氏菌属 (Shewanellaspp.),不动杆菌属(Acinetobacterspp.),黄杆菌属(Flavobacteriumspp.),摩氏杆菌属 (Moraxellaspp.)等.热暖水域鱼类中温菌数量比例较大,有些研究者认为,热带鱼的细菌相与温水海 域鱼的细菌相相似'..最近,国内学者对大黄鱼贮藏流通过程中的品质变化进行了研究,但对其 微生物学及变化规律研究较少. 大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)为广温广盐性集群洄游鱼类,食性广,原为我国海洋四大主捕经济鱼 类之一,在太平洋西部海洋渔业中具有相当重要的地位.福建省宁德市是我国养殖大黄鱼主产区,产量 占全国养殖大黄鱼的70%以上,年产量在3,4×10t.本研究对大黄鱼细菌相进行了定性和定量研 究,对细菌种群进行鉴定和分类,为后续加工有效控制微生物腐败和潜在危害提供依据. 1材料与方法 1.1样品 养殖大黄鱼实验样品于2004年9月取自福建省宁德市三都湾养殖场,其时海水温度为27.2,28. 6~C,捕获后立即放人冰水中冷休克.选用大小基本一致的个体(300,400g/ind),加冰保持温度在0, 1?,3h内运到实验室. 1.2海水及鱼体温度测定 将测温计探针放人养殖池中或由鱼肛门插入鱼体腹腔,待温度稳定后读数. 1.3样品处理 随机抽取2ind试样鱼,去头去鳞去内脏洗净,用干净吸纸擦干.沿脊骨剖切,取整个半条鱼肉(带 鱼皮),放人组织捣碎机打碎,用于细菌总数计数. 1.4细菌总数计数和培养基 称取鱼肉浆10.0g,加入90ml0.1%蛋白胨无菌生理盐水,高速振荡后,以10倍稀释将鱼肉浆稀 释,取3个浓度合适的稀释液0.1ml,涂布于标准琼胶培养基(中国科学院上海昆虫科技开发公司康乐 培养基有限公司)平板表面.每个稀释液涂布2个平皿,25?培养48h. 1.5细菌鉴定 挑选菌落数合适的平板,分离1/2平板的所有菌株或整个平板的所有菌株,然后接种到肉汤或在琼 脂培养基平板划线,纯化培养25?,24,48h.参照《常见细菌系统鉴定手册》,,海产鱼类细菌鉴定 图,结合英国SensitireAutomatedMicrobiologySystem对微生物菌落形态学,微生物细胞形态学,生理 生化特征进行鉴定和分类. 2结果 2.1新捕获养殖大黄鱼的品质 大黄鱼样品取自三都湾4个不同养殖场,其中1个养殖场离岸较远,其余3个养殖场离岸较近,网 箱密集.从表1可见,新捕获大黄鱼的细菌数比远洋和深海鱼细菌数高,初始菌数1.8×10,6.0×10 cfu/g,显示鱼体受养殖水域卫生状况的好坏影响,差异较大. 2.2新捕获养殖大黄鱼的细菌相组成 细菌分类方法随着现代生物,化学分析手段采用,DNA的G+C含量测定,16SrDNA序列分析,细菌 属名也发生了变化,重新扩展了许多新种,结果分析中会存在一定差异.例如假单胞菌属从一个属扩展 到10多个属,其中有新建立的属;嗜麦芽寡养单胞菌(Steotromonasmaltophilia)原称为嗜麦芽假单胞菌 (Pseudomonasmahophilia),1983年转入黄单胞菌属(Xanthomonasspp.),1993年根据营养谱及生长因 子的特征不同于假单胞菌属,另归于新属寡养单胞菌属(SteotromonasSpp.)…]. 第3期郭全友等:东海养殖大黄鱼细菌多样性分析243 采用海产鱼类细菌鉴定图分析菌株,均为革兰氏阴性.显微镜镜检发现2,3组呈球杆状,其他 各组均呈杆状,见表2.用SENSITIRE荧光微生物鉴定仪分析,各组的生理生化,营养特征见表3. 表1养殖大黄鱼品质 Tab.1QualityofculturedPseudosciaenacrocea 表2分离菌株主要特性 Tab.2Maincharacteristicsofisolatedstrains 注:r为杆菌;e/r为球杆菌;p为极性鞭毛 Note::Rod;c/r:Coccobacillus;P:Polarflagellum 表3SENSITIRE微生物鉴定仪分析结果 Tab.3IdentifiedresultsbyusingSensitiremicrobialauto-readersystem 组别Group123456组别Group123456 7AMC+赖氨酸7AMC+lysine+一+一一一鸟氨酸Ornithine一一一一一 木糖Xylose一一一一+一蔗糖Sucrose+一一+++ 4MU+磷酸盐4MU一双磷酸盐 4MU+phosphate+,一+++4MUbis-ph.sphate++一一一一 麦芽糖Maltose一+一一+一肌醇lnositol一一一一一一 7AMC+脯氨酸7AMCproline一+一一一七?f苷Aesculin+一一一一+ 阿拉伯糖Arabainose+一一一+一色氨酸T~'plophane一一一一+一 4MU—d—D吡喃半乳糖7AMC+谷氨酸盐 4MU—alpha—D—galact0pyranoside..7AMC+glutaminate+一一++一 丙二酸盐Malonate一一一一一一柠檬酸盐Citrate一一一一+一 尿素Urea一一一一一一山梨醇Sorbitol一一一一一+ 4MU一葡萄糖醛酸化物FR12 +一一+++4MU—beta—D—glucronide一一一一一 海藻糖Truetose+一一一+一甘露醇Mannitol+一一一+一 4MU—d—D一吡喃葡萄糖4MU—p—D吡喃半乳糖... 4MU—alpha—D—gluc.pyran0side4MU—beta—D—galacl0pvranoside 果糖Fructose+一一一+一阿拉伯醇Arabitol一一一一一一 赖氨酸Lysine+一一+一+棉子醇Raffinose一一一一+一 精氨酸Arginine+一一一一+纤维二糖Cellobiose一一一一一一 丙酮氨酸Pyruvate+一一一++胍丁胺Agmatine++一+++ 注:FRI2:4MU-2一乙酰氨基一乙去氧吡喃葡萄糖+4MUct—L一阿拉伯吡喃葡萄糖苷;4MU:4-甲基-7羟基香豆素:7AMC:7-甲基一香豆 素氨基化合物 Note:FRI2:4MU-2一aeetamido-2一deoxyuc.pyranosidplus4MU—alpha—L-arabbin.pyranoside;4MU:4-methylumbelliferone;7AMC:7. methyleoumarinamide. 海洋渔业2005,正 细菌相鉴定结果见表4.气单胞菌属(Aeromonasspp.)属弧菌科,非好盐性,包含有对鱼类和人致 病的种类,最适生长温度20,35?,O~C仍能生长,是淡水鱼的典型菌株.在养殖大黄鱼上气单胞菌属 为优势菌,占34.1%;嗜麦芽寡养单胞菌是非发酵革兰氏阴性杆菌,生长温度4,40~C,占总菌数比例为 21%;阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)在污染的海域出现较多, 低温可以生长,在大黄鱼中占总菌数比例分别为9.6%和5.2%;可能因为大黄鱼养殖场距岸近,海水中 原有细菌与陆上细菌混合在一起,受非原有菌污染的可能性较大.不动细菌和摩氏杆菌与革兰氏阳性 菌近似,呈球状杆菌,对硫或腐败性缺乏有效活性,通常认为是非腐败菌.弧菌属(Vibriospp.)也是海 水典型菌,但在大黄鱼中未检出,主要是所用培养基中盐分较少,培养温度低,不适宜其生长. 表4刚捕获大黄鱼的细菌相组成 Tab.4ThecompositionofbacterialfloraonnewlycaughtPseudosciaenacrocea 3讨论 3.1养殖大黄鱼微生物品质 新捕获的健康海产鱼其肌肉呈无菌状态,来自环境水域的微生物主要分布在鱼鳃,鱼体表面及肠 内.海域,季节不同,细菌总数变化很大,鱼体表面10,10'cfu/g,鱼鳃菌数10,10cfu/g,消化道10 , 10cfu/g.冷水干净海域菌数较低,但在污染的暖水域所捕获鱼的细菌总数可达到10'cfu/gl1.大 黄鱼细菌总数为1.8×10,6.0×10cfu/g,一方面由于捕获时养殖网箱中海水温度达到27.2,28. 6?,适合中温菌增殖,同时养殖场离岸较近,陆上细菌与海洋细菌混合在一起.另一方面表明养殖水域 受微生物污染程度存在差异,部分养殖区受污染程度较大.据宁德市海洋与渔业环境监测站检测.在卫 生状况较差的养殖密集区,海水细菌总数达到10,10cfu/g,粪大肠菌群最高可达540个/lOOml. 3.2细菌多样性来源 鱼类微生物组成受海域,季节影响大,海水平均温度5~C以下,低温细菌数量多;表层水温度接近 30~C,水域中细菌总数较高并且细菌相复杂.因鱼类栖息海域水温等差异,鱼体附着细菌的温度特征也 存在差异.温带水域鱼类细菌根据其生长温度范围被分为好冷菌或嗜冷菌,前者最大生长温度为 20~C,最适温度15~C,后者O~C可以生长,最适温度25~C13].干净未污染的温带水域中革兰氏阴性非发 酵嗜冷菌占优,主要包括假单胞菌属,腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens),摩氏杆菌属,不动细菌 属,产碱杆菌属(Alcaligenesspp.),黄杆菌属(Flavobacteriumspp.),气单胞菌属,弧菌属也是常见水生菌 和鱼类的典型菌.在日本海小坪港捕获的海产鱼初始细菌相中,革兰氏阴性嗜冷菌假单胞菌Ill/IV—H (36.2%),弧菌属(17.6%)占优?.地中海沙丁鱼初始细菌相以假单胞菌属,好冷菌(Psychrobacter), 不动细菌等革兰氏阴性菌为主?.暖水域鱼嗜温菌被分离的比例高,澳大利亚昆士兰(Queensland)海 域捕获鱼初始细菌相以革兰氏阳性菌微球菌(Micrococcus)占主导(49%),微球菌,杆状菌(Bacill) 在热带水域鱼中占优,但有人研究表明与温带水域鱼相似.捕获于东海三都湾养殖大黄鱼微生物 第3期郭全友等:东海养殖大黄鱼细菌多样性分析245 菌群与温水及暖水水域鱼差异性较大,气单胞菌为 9.6%,5.2%. 34.1%,阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌分别为 致谢:感谢福建省宁德海洋与环境检测站刘家富研究员,闽东水产研究所3'1振勇副研究员,林小金 助理研究员在实验中给予的帮助和协作. 参考文献: [1]奥稹昌世.鲜鱼手,L,.7口一艾'/聍葳}二扣e于6细菌相变化[J].冷冻,1986,61(1):120—130. [2]GillespieNC,MacraeIC.ThebacterialfloraofsomeQueenslandfishanditsabilitytocaus espoilage[J].JapplBact,1975,39:91— 100. [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] SurendranPK,JosephJ,ShenoyAV,eta1.Studiesonspoilageofcommerciallyimportanttrop icalfishesundericedstorage[J].Fish Res,1989,7:1—9. SuretteME,GillTA,LeblancPJ.Biochemicalbasisofpost—morternnucleotidecatabolismincod(GadusmorhIi,a)anditsrelationship tospoilage[J].JAgricFoodChem,1988,36:19—22. GramL,Wedel1.NeergaardC,HussHH-ThebacteriologyofspoilingLakeVictorianNileper ch(Laresniloticus)[J].IntJFood Microbio1.1990.10:303—316. AcuffG,IzatAL,FinneG.Microbialfloraonpond— rearedtilapia(Tilapiaaurea)heldonice[J].JFoodProt,1984,47:778—780. 许钟,蔡作斌,肖琳琳,等.养殖大黄鱼冰藏流通的货架期试验[J].海洋渔 业,2004,26(4):306—311. 姚果琴,何利平.银鲳和大黄鱼冰藏保鲜和货架期[J].上海水产大学,1992,1(1— 2):91—94. 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001. 须山三千三,鸿巢章二.水麈食品学[M].束京:恒星社厚生圈,1987.1ll—ll8. PalleroniNJ.BradburyJF.Stenotrophomonas,anewbacterialgenusforXanthomonasmahophilia(Hugh1980)[J].Swingseta1.Int JSvstBacteriol,1993,43:606—609. ShewanJM.Thebacteriologyoffleshandspoilingfishandthebiochemicalchangesinducedbybacterialaction[A].Proceedingsofthe ConferenceonHandling,ProcessingandMarketingofTropicalFish[M].TropicalProductsInstitute,London,1977.5l一66. MoritaRY.Psychrophilicbacteria『J].BacteriolRev,1975,39:14_4—167. GennariM,TomaselliS,CotronaV.Themicrofloraoffleshandspoiledsardines(Sardinapichardus)caughtinAdriatic(Mediterranean) Seaandstoredinice[J].FoodMicrobiology,1999,16:15—28.