红细胞凝集试验

红细胞凝集试验 (二) 间接血凝试验和反向间接血凝试验 1.原理 凝集反应中抗体球蛋白分子与其特异的抗 原相遇时，在一的条件下，便可形成抗原抗体的复合物，由于这种复合物分子团很小，如果抗原抗体的含量过少时，则不够形成肉眼可的凝集。若设法将抗原结合或吸附到比其体积大千万倍的红细胞表面上，则只要少量的抗体就可以使红细胞通过抗原抗体的特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。这就大大地提高了凝集反应的敏感性。于是人们将红细胞经过鞣酸或其他偶联剂处理后，使得多糖抗原或蛋白质抗原被红细胞表面的受体结合或吸附，这种被抗原致敏的红细胞遇到相应的抗体时，在一定的条件下，由于抗原抗体的特异性结合而间接地带动着红细胞的凝集，这一反应称为间血凝反应。若在抗血清中先加入与致敏血球相同的抗原，在一定的条件下，经过一定时间后再加上这种抗原致敏的红细胞就不再发生红细胞的凝集，即抑制了原有的血凝反应，这种现象称为间接血凝抑制反应。同样，如果用抗体球蛋白致敏红细胞上，也能与相应的抗原在一定的条件下起凝集反应，这称为反向间接血凝试验。当在与致敏红细胞的抗体相应的抗原液中，先加入相应的特异性抗体，在一定的条件下，经过一定的时间后再加入这种抗体致敏的红细胞，由于抗原先和特异性抗体结合，这种抗体致敏的红细胞就不能与抗原起反应，呈现血凝抑制现象，这叫反向凝抑制试验。见图2-13、2-14。 一般抗原致敏红细胞比较容易，而用抗体致敏红细胞比较困难，主要原因是抗血清中蛋白质的成分很复杂，其中除了具有抗体活性的免球蛋白之外，还有非抗体活性的免疫球蛋白，这两种免疫球蛋白很难使之分开，而且这两种免疫球蛋白均能同时结合或吸附在红细胞表面，一旦非抗体活性免疫球蛋白在红细胞表面达到一定数量时，致敏的红细胞就不能再与相应的抗原形成可见的凝集。因此，一般实验室均用抗原来致敏红细胞。 2.材料 (1) 红细胞悬液 很多动物的红细胞，如绵羊、家兔、鸡、鸽了、马、猴子及人的O型血都可用来作为间接血凝试验的红细胞载体，实验室多选用绵羊细胞。选择健康的绵羊，无菌自颈静脉采血,并将其注入盛有4倍绵羊血量的阿氏液的三角烧瓶内，不时摇动3-5 min ，置4?过液，次日将保存在阿氏液内的红细胞液经灭菌纱布过滤后用生理盐水洗3-4次，每次2000r/min离心5min，最后一次2000r/min离心10min，用生理盐水配成0.5%-1%的红细胞悬液，4?保存，备用期不超过一周。 (2) 红细胞的醛化 ? 醛化原则 用新鲜红细胞无论是致敏的或未致敏的保存期都很短，临时致敏也不方便，且不同批次或不同动物个体的差异，造成对系统研究工作前后结果不一，影响诊断，故目前都采用醛化红细胞。醛化的方法随醛类的不同 ( 有甲醛、戊二醛及丙酮醛 ) 而异，但醛化的原则是一的，如加醛之前红细胞必须充分洗涤，除净红细胞表面的血浆蛋白;加醛固定过程中红细胞最终浓度为10%;开始加入醛的浓度不宜过浓;醛化作用温度要低，否则红细胞容易变异;在整个醛化过程中要不时地振摇，使醛类与红细胞充分均匀地接触。目前国内都采用戊二醛，因为戊二醛醛化过程简单，在短时期即可完成，且致敏的效果也比较好。 ? 醛化方法 红细胞用0.15mol/L的pH7.2的PBS液配成4%的悬液，在冰浴的条件下加入2.5%的戊二醛，边加边摇，使最终浓度为0.4%(即100ml4%的红细胞悬液内加入16ml2.5% 的戊二醛)，在4?固定1h，摇匀后用生理盐水洗涤4-5次，最后用生理盐水配成10%的红细胞悬液。加1:10 000(终浓度) NaN，4?保存备用。 3 ? 再醛化(双醛化法) 在第二步用了生理盐水洗涤单醛化的红细胞后,将红细胞用0.15mol/L的pH 7.2的PBS液配成4%的悬液,再用丙酮醛(最终浓度1.5%)作第二次醛化,4?固定17h,不断摇晃,洗涤后配成4%的红细胞悬液,加入1:10000(最终浓度)NaN，4?保存备3用。 鞣酸处理红细胞 为了进一步提高间接血凝敏感性,经醛化后的红细胞必须再经鞣(3) 酸处理，因为鞣酸本身也是一种血凝素,其高浓度时会使红细胞凝集,低浓度时使红细胞处于不稳定状态,故经适当浓度的鞣酸处理后,致敏的红细胞能使实验的敏感性大大提高,其操作如下: ? 称取适量优质鞣酸用PH 7.2的PBS液配成1:20 000的溶液,须现用现配。 将4?保存的醛化红细胞,用生理盐水洗2-3次,并用生理盐水配成2.5%的红细胞悬? 液，与等量的1:20 000的鞣酸混合，置于37?水浴10-15min，取出用pH 7.2的PBS液洗一次，再用pH7.2的PBS液配成2.5%的红细胞悬液。 (4) 鞣酸化红细胞的致敏 将抗原(或抗体)结合或吸附于红细胞表面称为致敏，已结合或吸附抗原(或抗体)的红细胞称为致敏红细胞。致敏物质可为糖类或蛋白质。多糖抗原比较容易致敏，可吸附于未经处理的红细胞表面。而蛋白质抗原或抗原体需要有别的成分参与方能致敏红细胞，如常用的鞣酸法、联苯胺法、金属离子法等。 ? 致敏红细胞的最适抗原或抗体用量的测定 致敏红细胞的抗原或抗体的用量过低就不能得到血凝的最高效价，而过高亦不能再提高反应的敏感性，因此在正式试验之前都必须试致敏用的抗原抗体的最适用量。方法是将抗原体作倍比稀释，分别致敏红细胞后,再与相应的抗血清或抗原作血凝反应,出现最高血凝效价的最少抗原(或抗体)称为一个致敏单位，正式实验使用两个致敏单位即可。 ? 致敏方法 取两个单位的致敏抗原 (或抗体)1mL ,加pH 6.4的PBS液4mL ,再与2.5%鞣化红细胞混合均匀后于37?作用30min,经2000 r/min离心5min,沉淀的红细胞用含有1%已灭能的健康兔血清的PBS pH7.2液洗涤2次，充分洗 涤游离的抗原或抗体，再用含1%健康兔血清的pH7.2的PBS液配成2%的致敏红细胞悬液,一般病毒抗原致敏的红细胞应立即使用，4?保存也不超过48小时，为了延长致敏红细胞的保存期，将洗涤后的致敏红细胞用含 4,健康兔血清的PBS pH 7.2液配成10,的致敏红细胞悬液加0.01%的硫柳汞摇匀,分装于灭菌的安瓶,1支1mL,低温真空干燥,冻干以后的致敏红细胞其凝集效价不变,亦无自凝现象,在4-6?可保存6个月，冻干致敏红细胞使用时,每支加pH7.2的PBS液5mL摇匀后使用。 (5) 兔血清稀释液 取5-7只健康的成年兔,心脏采血,分离血清,所得各血清经检查无菌后混合,56?灭能30min ,凉后加等量的2%的戊二醛红细胞悬液摇匀,置37?作用30min之后2000r/min离心15min ，上清液即为2倍稀释的兔血清,分装置后-20? 保存,可长期使用,同时,取pH7.2PBS液98mL,加2倍稀释的兔血清2mL,即为1%兔血清的pH7.2PBS稀释液,现用现配。 (6) 器材 微量振荡器,25μl的连续加液器和25μl的移液器等实验室常用器械。 3.方法(猪的支原体肺炎) (1) 微量血凝板的标记。 ? 取洁净的96孔V型血凝板,数量视试验需要。 ? 在微量板的第一排(横)各孔上边标上血清的稀释度,最后一孔作致敏的红细胞对照。 ? 在微量板的第一行(纵)各孔的外侧边标上被检血清号及对照用的阴性血清、阳性血清。 (2) 微量间接血凝试验的操作 ? 用25μl的连续加液器,每孔加入含1%兔血清pH 7.2PBS稀释液25μl。 ? 用25μl的移液器分别吸取25μl的被检血清,阴性血清、阳性血清加入第一行与标记相应的各也内。 ? 用微量自动稀释器或稀释棒， 插入第一行各孔内,经充分稀释后醮取25μl移至第二行的各孔内,再经充分稀释后醮取25μl至第三行各孔内,依次倍比稀释至倒数第二行为止,并从这一行各孔内弃掉25μl。 ? 各孔分别加入1%的致敏红细胞悬液25μl。 ? 在微型振荡器上振荡2min ,置室温2h后观察结果。见表2-23。 (3) 结果判定 ,:100%红细胞凝集,凝集颗粒均匀地分布在整个孔底,呈薄状。 ，，，:75%红细胞凝集,孔底红细胞呈滴状,凝集边缘不整齐。 ，，:50%红细胞凝集,孔底形成环状,周围有凝集颗粒,但不成膜状。 ，:25%红细胞凝集,孔底形成一个小团，但小团边缘不整齐,周围有少量凝集。 ,:红细胞完全不凝集,红细胞在孔底形成小团 ，小团边缘整齐,周围无凝集颗粒。 若各对照组成立,试验结果可信,被检血清稀释终点以“+ +”应判为阳性。 反向间接血凝试验的操作和判断与间接血凝试验一样,反向间接血凝试验仅仅是用抗体,致敏红细胞来检测组织悬液或细胞培养液中的抗原。 4.间接血凝和反向间接血凝的应用 间接血凝和反向间接血凝试验是以红细胞为载体，根据抗原抗体的特异性结合的原理 ，用已经抗原或抗体来检测未知的抗体或抗原的一种微量、快速、敏感的血清学方法。其用途很广。 (1) 测定非传染性疾病的抗体，如类风温性关节炎的类风温性RF因子及自身抗体、激素抗体等。 (2) 测定传染性疾病的抗体,用于流行病学的调查,如布氏杆菌病、螺旋体病。猪的霉形体肺炎等。 (3) 用间接血凝试验所作某些病毒、细菌的鉴定和分型。 (4) 间接血凝试验可用于血浆中IgG和其他蛋白组分的测定及对免疫球蛋白的基因分析 (5) 间接血凝试验用于进出口动物及其产品的检疫,如用间接血凝试验检疫进口猪的霉形体肺炎。用反向间接血凝试验检查进口肉品中口蹄疫病原体等。 5.影响间接血凝试验结果的因素 (1) 试验者在各个步骤中操作要精确 ，加量要准确 ,所用器材必须洁净,液体试剂要无菌,这是保证实验结果正确的前提。 (2) 作为致敏红细胞的抗原或抗体一定要经过纯化 ，否则会出现非特异性反应，同时要求抗原和抗体 有一定的浓度和效价。 (3) 致敏红细胞对温度、时间和pH值都有一定要求。温度一般在37? ，时间为30min, pH值为6.4。 (4) 不同动物种类和不同个体的动物的红细胞致敏的敏感性亦有差异 ，因此同一批试验一定要用同一批的红细胞。 (5) 健康兔血清稀释液一定要现用现配 ，鞣化的红细胞也应立即致敏。