纺锤体的无创伤性观测在辅助生殖技术中的应用

纺锤体的无创伤性观测在辅助生殖技术中的应用 纺锤体的无创伤性观测在辅助生殖技术中 的应用 ? 194? 15SchrnidtKL,Kryger—BaggesenN,ByskovAG,eta1.Anti—Mullerian hormoneinitiatesgrowthofhumanprimordialfolliclesinvitro.Mol CellEndocrinol2005234(1.2):87-93 16TremellenKP,KoloM,GilmoreA,eta1.Anti—mullerianhormoneasa m~xkerofovarianreserve.AustNZJObstetGynaeeol,2o05,45(1): 20-24 17PiltonenT,Morin—PapunenL,KoivunenR,eta1.Serumanti—Mullerian hormonelevelsremainhishuntillatereproductiveageanddecrease 国外医学计划生育,生殖健康分册2006年25卷第4期 duringmetformintherapyinwomenwithpolycystieovarysyndrome. HamReprod.20o520(7):1820—1826 18vanKasterenY.TreatmentvoileeDtsforprematureovarianfailure.J SocGynecolInvestig,20o1,8(1SupplProceedings):S58—59 19PignyP,MedenE,RobertY,et8lElevatedn?nlevdofanti—mulhrian hormoneinpatientswithpolyeysticovarysyndrome:relationshipto theovarianf0Uicleexcessandtothef?iculararrest.JClin EndocrinolMetab.20o3,88(12):5957—5962 纺锤体的无创伤性观测在辅助生殖技术中的应用 上海交通大学医学院附属瑞金医院妇产科生殖医学中?~z(200025)孙贻娟综述冯 云审校 摘要纺锤体的无创伤性观测在辅助生殖技术(ART)的各个方面得到广泛应用:通 过对纺锤体的有无,位置和 形态结构的观察预测卵的质量;研究卵对培养环境条件的敏感度从而进行培养条 件的质量控制;减少胞浆内单精子 注射(msI)Et程中对纺锤体的损伤从而保证胞浆内单精子注射技术的安全性和有 效性;应用于冷冻技术用以改进卵 子冷冻的方法:另外.纺锤体的无创伤性观测大大提高了在核移植技术的效率.纺 锤体提供了卵子的重要信息以帮 助在辅助生殖技术中获得更好的结果. 关键词纺锤体卵母细胞辅助生殖技术无创伤性观测 在辅助生殖技术(ART)中,为了卵子的高发育 潜能.保持纺锤体和其他细胞器,分子的分布和正常 功能是必要的.纺锤体是微管组装而成的动态细胞 器.卵子自身的异常和体内外环境的变化很容易导 致微管组装的异常.而形成的异常纺锤体最终将导 致助孕失败.近年来一种无创性观测纺锤体的计算 机辅助极性显微镜系统(Polscope,Computer.assisted polarizationmicroscopysystem)在ART领域得到越 来越广泛的应用.现对其作一综述. 纺锤体与卵母细胞发育潜能 卵细胞是有结构,有极性的细胞.线粒体等细胞 器在胞质中的分布不是随机的[tl.细胞骨架的完整 性对于维持细胞的极性十分重要.并且对于周围环 境的变化很敏感.MII期卵母细胞中纺锤体对于染 色体的正常排列和减数分裂中染色体的正常分离至 关重要.纺锤体的破坏可使染色体排列紊乱甚至散 落在胞质中从而导致受精后非整倍体的形成.非整 倍体是人类异常受精最常见的,也是早期胚胎死亡, 自然流产和遗传病的重要原因.其中80%是母源性 的.免疫荧光的方法证实在年龄偏大的妇女中异常 纺锤体的比例明显大于年轻妇女,从而得出纺锤体 异常可能与这个人群非整倍体胚胎形成增多有关. 而其他原因如温度和pH值的改变也可造成哺乳动 物卵母细胞纺锤体异常,当温度稍低于37?时.纺 锤体的结构就受到破坏.异常纺锤体的比例随卵在 收稿13期:2005—10-08修回13期:2006-01—20 体外培养时间增加而增多.所有这些因素都对后续 的受精,胚胎发育,着床和胎儿发育造成影响.所以 在体内,外成熟过程中,体外受精(IVF)中操作卵和 胚胎应控制环境条件.尽量减少对细胞骨架尤其是 纺锤体完整性的破坏. 纺锤体的无创伤性观测方法 传统用固定和免疫荧光方法检测纺锤体形态. 以研究影响纺锤体功能的情况.这些方法对卵都有 损伤,不能应用于对临床IVF和纺锤体的动态研 究.Polscope利用细胞内大分子结构的双折射性.将 光学硬件和数字传导结合起来使纺锤体成像.双折 射性是高度有序的大分子,如微管的物理特性.因为 卵中纺锤体是双折射性的,其结构可以通过Polscope 观察到.其与传统极性显微镜相比有两点关键的改 动:?用环形极性光代替了线性极性光.?用两个电 光学调整器代替了机械补偿器.与传统的Hoffman 3O,45w的宽波段光相比,用5O,7Ow的绿色光 (546nm)观察卵,而宽波段光包含有害的红色和紫 色波长,可能影响卵的成熟.目前Polscope已用来研 究鼠和人的卵子,其获取的纺锤体结构信息与传统 固定和荧光免疫方法有高度一致性脚.uu等[31研究 显示用Polseope观察过的和未经Polscope观察过的 小鼠卵子形成囊胚的比率无显着性差异.并且用 Polscope观察过的卵子形成的囊胚发育为个体的比 率与体内形成囊胚发育为个体的比率亦相同.这证 明Polscope对于卵子是安全的. 国外医学计划生育/生殖健康分册2006年25卷第4期 Polscope在临床与研究的应用 一 ,评估卵母细胞的质量 目前胚胎质量完全依赖于形态学.惟一检 测胚胎异常的方法是着床前遗传学诊断.通过极体 或分裂球活检,但是对胚胎造成损伤.多于80%的 非整倍体来源于母方配子,纺锤体的完整性与染色 体的分布密切相关,所以检测纺锤体的方法可以帮 助预测染色体分布并减少在IVF中非整倍体移植 的可能性. 1.纺锤体的有无Wang等研究证实:可观察 到纺锤体的卵在胞浆内单精子注射(ms1)受精率, 卵裂率,囊胚形成率都明显高于无纺锤体的卵,说明 人卵中纺锤体的存在预示着卵的质量.Moon等[51和 Konc等[q也得到相同的结论.无法观察到纺锤体的 卵子可能在发育,成熟或体外培养操作中受到损伤, Windt等17]提出如果患者所有卵子中都无法观测到 纺锤体,可以做为建议患者采取赠卵的依据.但未见 纺锤体的卵并非从本质上预示受精失败或发育停 滞,实际上,有极体但未见纺锤体的卵可能仍处于末 期I或前中期?,延长培养时间后可能有可见的纺 锤体.在前中期?染色体未排列的卵中,早行ICSI 可能是没有纺锤体的中期?卵发育至囊胚数较有 纺锤体者显着减少的重要原因. 2.纺锤体的位置Rienzi等阎对532例行ICSI 卵子的观察发现,纺锤体和第一极体夹角>90.的卵 子其异常受精率显着高于其他卵子,主要表现为第 二极体未释放而导致的三原核受精卵增多.但是受 精后胚胎发育的质量并无显着差异,进一步的研究 发现这种极体与纺锤体关系的变化可能是去除颗粒 细胞的操作造成的.Moon等对体内,外成熟的鼠卵 的纺锤体进行观察发现:体内成熟的卵子有89.1% 纺锤体和第一极体的夹角为0..而体外成熟的卵子 中有83.1%夹角为0,90.,反映了在体内,外胞质成 熟的过程不同.这可能是体外成熟的卵子发育潜能 低的原因.对纺锤体位置和胚胎第一次分裂平面的 关系研究?发现:如果将纺锤体的位置定义为卵子 的一极,那么当胚胎第一次分裂在子午线上时发育 的胚胎质量,优于第一次分裂在赤道线上所发育的 胚胎,说明纺锤体的位置即为卵子动物极的位置. 3.纺锤体的形态结构卵在MII停滞的过程 中,随着时间延长,纺锤体退化,IVF和ICSI中新取 出的卵纺锤体两极距离为(11.2?3.4)m,16,18h后 未受精的卵中纺锤体长为(8.08?O.84)m【"】,从而短 小的纺锤体可能与卵停滞时间过久和过度成熟有关, ? 195? 预示着非整倍体的发生几率增加.除纺锤体变短外, 排卵后时间过长还存在纺锤体的错位和成熟前染色 单体分离和非整倍体.纺锤体的光滞后反映了微管 的高密度和高顺序性,在DeSantis等21研究发现,年 龄大的患者的纺锤体光滞后程度比较低的人胚胎质 量有降低的倾向,但是无统计学显着性差异. 4.对纺锤体以外的卵的结构的观察除了对纺 锤体进行观察外.这种无创伤性分析还可以用于观 察卵和胚胎的透明带厚度,结构参数等来帮助评价 其质量,卵子透明带内层的光后滞的幅度增大预示 着卵子有较好的发育潜能ll3J,并且随着胚胎发育,透 明带尤其是透明带的外层逐渐变薄【41. 二,对卵和胚胎的培养条件进行质量控制 Polscope非损伤性地对纺锤体成像可用来研究 卵对培养环境条件的敏感度,从而进行培养条件的 质量控制.Wang等[15,16]研究发现,卵子在略低于 37~C的环境中就可引起纺锤体结构的破坏,在28? 的环境中10min即可引起纺锤体不可逆性的损伤, 在ICSI过程中严格控制环境的温度可以提高受精 率和临床妊娠率,提示在IVF和ICSI操作过程中保 持卵子周围环境的温度是非常必要的.对体外未成 熟卵的研究或其他动物实验中观察纺锤体变化.可 以发现培养系统中对卵子有利或有害的成分,或者 确定环境中影响纺锤体完整性的因素.Shen等用 nocodazole研究纺锤体异常对卵非整倍体的预测价 值.nocodazole是一种使微管解聚的细胞稳定剂.与 微管蛋白有高亲和性,在低浓度时特异影响多聚体 的稳定性,明显影响纺锤体的长度.纺锤体缩短35% 时与非整倍体增加显着相关,缩短15%没有这种 效果;同时Polscope可以发现暴露于40nmol/L的 nocodazole中使22.7%的卵子的染色体无法正常排列 在纺锤体赤道平面上,此比例远远大于对照组的%, 继而导致多于10%的卵子成为非整倍体.此研究说 明任何影响微管解聚平衡的外在因素都可以影响纺 锤体长度从而影响染色体状态和卵的发育潜能. 三,Polscope在ICSI中的应用 在ICSI中为避免由于损伤纺锤体而引起的异 常纺锤体分离,根据极体位置固定卵,但是,极体在 卵周隙中的移位或者纺锤体在胞质中的易位都使两 者的位置关系发生改变,在哺乳动物中极体的位置 并不能精确地判定纺锤体的位置,Wang等对533颗 卵子的观察发现多于10%的卵纺锤体和第一极体 的夹角>90.[51.ICSI中显微注射有可能在一些卵中损 伤了纺锤体而破坏了染色体的分离.用Polscope观 ? 196? 测纺锤体的位置可以精确地避免ICSI过程中对其 损伤,从而保证ICSI技术的安全性和有效性.另外, 卵子纺锤体的出现是卵子成熟最为直接精确的指 标.提示为ICSI的最佳时机.甚至有学者提出在注 射精子前对卵子常规进行纺锤体的观察【堋. 四,Polseope在卵子冷冻中的应用 卵子冷冻做为生殖能力储备的一种手段,同时 避免了冻存胚胎引发的伦理学问题.近年来引起了 国内外学者的广泛关注.但是由于卵母细胞自身的 特点,相对体积较大而表面积较小,对低温敏感,包 括纺锤体在内的细胞骨架易受损伤等,使卵子冷冻 进展一直比较缓慢.研究者致力于摸索出对卵子损 伤最小的冷冻方法,Polseope可应用在冷冻过程中, 观察纺锤体的变化【91.有助于评价冷冻方法的安全 性和有效性.并在复融后选择纺锤体形态完好的卵 子行进一步操作. 五,Polseope在核移植技术中的应用 无论是近年开始进行研究的卵子重构还是争议 颇多的克隆技术,都存在效率低且安全性差的问题. 其中去核是关键一步.安全有效地去除核又最大程 度地保存剩余胞质的活性是技术成功的前提.去核 后剩余胞质的体积对于卵子重建后的发育潜能起着 举足轻重的作用.Liu等翻在Polseope观测下进行小 鼠卵的核的去除已证实可达到100%的效率,而且. 只有5.5%的线粒体在去除核的过程中同时去除.而 在Polseope观测下进行去核后重构的卵子进行电刺 激激活后发育为囊胚的比例与未经操作的对照组无 异.Polseope还可用来观察体细胞核在MII卵母细 胞质内形成纺锤体的过程和时间,以确定最佳刺激 时间,从而减少染色体分离中出现的错误. 总之,纺锤体的完整性和正常功能对于卵的发 育潜能起着重要的作用,而对于纺锤体无创伤性的 观察,可以应用在ART的各个方面,例如评价卵的 质量预测胚胎非整倍体的发生机率,对培养系统进 行质量控制,保证ICSI技术的安全性和有效性.以 及在核移植等基础应用方面的研究.纺锤体提供的 卵子的重要信息对获得正常的受精,胚胎发育和成 功的助孕结果有所帮助. 参考文献 1wM,DaleB,MarinoM,eta1.Mitochondrialageg0npatterns andactivityinhumanoocytesandpreimplantationembryos.Hum Reprod,2001,16(5):909-917 国外医学计划生育,生殖健康分册2006年25卷第4期 2WangWH,KedeDL.Predictionofchromo6omemisaligumentamong invitromaturedhumanoocytesbyspindleimagingwiththe PolScope.FeaflSteril,2002,78(5):1077—1081 3UuL,OldenbourgR,TrimarchiJR,eta1.Areliablenoninvasive techniqueforspindleimpingandenucleationofmammalianooeytes. 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