黄芩苷对小鼠t淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响

黄芩苷对小鼠t淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响 ------精品文档!值得拥有～------ 黄芩苷对小鼠T淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响 作者:李林,曾耀英*,黄秀艳,宋兵,杨志,滕菲,姚满林 STRONG【摘要】/STRONG 目的:分析黄芩苷(BA)对小鼠T淋巴细胞体外 探讨其免疫抑制作用的。方法:无菌分离小鼠增殖和细胞周期的影响, 淋巴结,制备淋巴细胞悬液,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA SE)染色,不同终浓度的BA预孵育4h,加入刀豆蛋白(ConA)或佛波醇酯类多克隆刺激剂PDB和离子霉素Ion进行刺激,以流式细胞术(FCM)结合荧光抗体染色技术检测黄芩苷对CD3+T细胞增殖率的影响;以碘化丙锭(PI)染色结合FCM分析其细胞周期分布。结果:BA(10、15、20、25mg/L)对ConA或PDB和Ion诱导的小鼠CD3+T细胞增殖均有明显的抑制作用(P0.05),且呈浓度依赖性。对细胞周期分析明,BA能使ConA或PDB和Ion刺激的小鼠淋巴细胞停滞于G0/G1期、S期,阻止其进入G2/M期,阻止作用随浓度的增加而增强。结论:BA对ConA或PDB和Ion诱导的小鼠CD3+T细胞增殖有明显抑制作用,能够将淋巴细胞阻滞在G0/G1期和S期,表现出明显的周期特异性。本研究提示黄芩苷有fazhan发展成免疫抑制剂的潜力。 STRONG【关键词】/STRONG黄芩苷;T细胞;细胞增殖;细胞周期 中药黄芩取自唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的根,主含黄酮类成分,已分离出40余种黄酮,主要有黄芩苷(Baicalin,BA)、 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 黄芩素、汉黄芩素等,其中以黄芩苷的含量最为丰富。药理研究已证明,黄芩苷有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎和抗变态反应等作用,1,,临床用于Medicine治疗肺炎、高血压、肝炎、感染和先兆流产等疾病。近年来的研究表明BA对免疫系统有一定的调节作用,2,,但是,BA对免疫系统发挥作用的细胞和分子机制尚未完全阐明,尤其是对T细胞所介导的免疫应答的影响鲜有报道。本研究通过分析BA对小鼠淋巴细胞增殖和周期分布的影响,评价其免疫效应并探讨免疫作用机制。 STRONG 1材料和方法/STRONG 1.1材料SPF级BALB/c小鼠(雄性,8,10周龄)购自广东省实验动物中心;黄芩苷购自陕西慧科植物开发有限公司(纯度?98%),刀豆蛋白A(ConA)、佛波醇酯(phorbol12,13 dibutyrate,PDB)、离子霉素(ionomycin,Ion)、碘化丙锭(propidiumiodide,PI)、TritonX 100、Rnase、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑盐溶液(MTT)均购自Sigma公司;羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂 (carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFDA SE)购自MolecularProbes公司,anti mouse CD3 PE(phycoerythrin,藻红蛋白)购自BDPharMingen公司;RPMI1640培养液、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、L 谷氨酰胺、青霉素、链霉素、 巯基乙醇等购自GibcoBRL公司。流式细胞仪(FACSCalibur)为美国BectonDickinson公司产品。 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 1.2方法 无菌分 1.2.1小鼠淋巴细胞悬液的制备将BALB/c小鼠颈椎脱臼处死,离小鼠双侧颌下、锁骨下、腋窝、腹股沟浅淋巴结及肠系膜淋巴结,置于预冷PBS中200目尼龙网研磨过滤,收集细胞,冷PBS离心(250g,5min)洗涤细胞2次,再重悬于RPMI1640完全培养液(25mmol/LL 谷胺酰胺、100IU/mL青霉素、100mg/L链霉素、50mol/L 二巯基乙醇、体积分数90%RPMI1640培养液和100mL/L胎牛血清)。 1.2.2MTT法检测BA对小鼠T细胞的药物毒性将2.1中制备的淋巴细胞计数并调整细胞密度为3×109cells/L;接种于96孔板,每孔200μL,设空白组(只加RPMI1640完全培养液)、对照组(淋巴细胞悬液)、实验组(BA终浓度分别为10、20、30、40、50mg/L)。每组5个复孔,48h后,每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑盐溶液20μL,37?避光孵育4h,250g离心5min,弃上清液,加入100μLDMSO溶解结晶,酶联免疫标记分析仪于570nm波长检测各孔的吸光度A值,pc计算各孔细胞的相对存活率。细胞相对存活率=,(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组),×100%。 1.2.3ConA或PDB和Ion诱导小鼠淋巴细胞增殖将1.2.1中洗涤后的淋巴细胞重悬于PBS中,计数并调整细胞密度为1×1010cells/L;CFDA SE染色步骤参照文献,3,,RPMI1640完全培养液重悬细胞并调整细胞密度为 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 3×109cells/L;接种于96孔板,每孔200μL,分别设置空白组、对照组(只加入ConA或PDB+Ion)以及ConA或PDB+Ion刺激下不同浓度BA干预的实验组,每组含5个复孔。实验组先用不同浓度的BA(终浓度为10、15、20、25mg/L)在37?,50mL/LCO2培养箱中预孵育4h,然后在对照组和实验组相应的孔中加入终浓度为5mg/L的ConA或10-7mol/L的PDB和5mg/L的Ion。 1.2.4小鼠T淋巴细胞增殖的检测48h后,取2.3中的培养细胞于流式管中,冷PBS离心(250g,5min)洗涤2次,弃上清,每管加入CD3 PE(1×106cells/μg)单克隆抗体(mAb),振荡混匀,室温避光作用30min,冷PBS离心(300g,5min)洗涤1次,200μLPBS重悬细胞,立即上机检测,CFDA SE为荧光1通道(FL1),PE为荧光2通道(FL2)。 1.2.4PI染色分析细胞周期将1.2.1中制备的淋巴细胞计数并调整细胞密度为3×109cells/L;接种于96孔板,每孔200μL,分别设置空白组、对照组(只加入ConA或PDB)以及ConA或PDB刺激下不同浓度BA干预的实验组,每组含5个复孔。实验组先用不同浓度的BA(终浓度为10、15、20、25mg/L)在37?,50mL/LCO2培养箱中预孵育4h,然后在对照组和实验组相应的孔中加入终浓度为5mg/L的ConA或10-7mol/L的PDB和5mg/L的Ion。48h收获培养细胞,PBS洗涤1次(250g,5min),用体积分数700mL/L乙醇固定30min,再用PBS洗涤细胞2次(250g,5min),PI染液避光染色15min,流式细胞术(FCM)分析细胞周期分布情况。PI为荧光2通道(FL2)。 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 1.2.5FCM检测及分析全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。获得的数据用CELLQuest软件和ModFitTMV310软件分析。 1.2.6统计学分析实验结果用统计学软件包SPSS10.0forWindows进行 ?s表示,多组间采用One wayANOVA分析,两组间的比较用非配处理,以x 对Student’st test,n为样本数。 STRONG 2结果/STRONG 2.1BA对小鼠淋巴细胞存活率的影响MTT法检测BA对小鼠淋巴细胞毒性结果显示,终浓度为10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L的BA与小鼠淋巴细胞作用48h后,细胞存活率分别为0.98?0.01、0.96?0.03、0.95?0.02、0.92?0.02和0.90?0.03。 2.2BA对ConA刺激下小鼠CD3+T细胞增殖的影响CFDA SE标记技术是利用活细胞染料CFDA SE随细胞每增殖1代,CFDA SE荧光强度系列减半的特征,结合FCM,动态追踪淋巴细胞增殖的技术,并可通过Modfit软件进行分析增殖指数(PI,即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比值)和各代细胞所占的百分比(表1)。实验结果表明,空白组细胞组仅见一个亲代峰,无增殖峰。而在ConA刺激下细胞出现3个子代峰,加入BA的药物实验组可明显减少子代峰和子代细胞数(图1),随着BA浓度的升高,细胞 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 分裂代数逐渐减少,PI逐渐降低,与ConA对照组相比较具有统计学意义(P0.05)。 2.3BA对PDB和Ion刺激下小鼠CD3+T细胞增殖的影响在PDB+Ion刺激下细胞出现两个子代峰,加入BA的药物实验组明显减少子代峰和子代细 ),即降低了细胞分裂代数。Modfit软件分析表明,随着BA浓胞数(图2 度的升高,药物实验组细胞的PI逐渐降低,与PDB+Ion组相比较具有统计学意义(P0.05,表2)。 表1CFDA SE染色分析BA对ConA诱导的小鼠CD3+T细胞增殖的影响(略) aP0.05,bP0.01vsConA;G1:母代细胞百分率(%);G:各子代细胞百分率(%);PI:增值指数. 图1BA对CFDA SE标记的小鼠CD3+T细胞在ConA刺激下增殖的影响(48h)(略) a:Control;b:ConA;c:ConA+BA10mg/L;d:ConA+BA15mg/L;e:ConA+BA20mg/ L;f:ConA+BA25mg/L. ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 图2BA对CFDA SE标记的小鼠CD3+T细胞在PDB+Ion刺激下增殖的影响(48h)(略) a:Control;b:PDB+Ion;c:PDB+Ion+BA10mg/L;d:PDB+Ion+BA15mg/L;e:PDB +Ion+BA20mg/L;f:PDB+Ion+BA25mg/L. 2.4BA对ConA刺激下小鼠T细胞周期的影响未经ConA刺激的空白组T细胞主要处于G0/G1期;经ConA刺激48h后,与空白组相比较,处于S期和G2/M细胞的比率明显增加,而加入BA的药物实验组与ConA组相比,其G2/M期T细胞的比率明显减少,S期T细胞的比率稍有增加,G0/G1期T细胞显著增加,具有统计学意义(P0.05,表3)。 2.5BA对PDB和Ion刺激下小鼠T细胞周期的影响未经PDB和Ion刺激的空白组T细胞主要处于G0/G1期;经PDB和Ion刺激48h后,与空白组相比较,处于S期和G2/M期细胞的比率明显增加,而加入BA的药物实验组与PDB+Ion组相比,其G2/M期T细胞的比率明显减少,S期T细胞的比率没有显著变化,G0/G1期T细胞显著增加,具有统计学意义(P0.05,表4)。 表2CFDA SE染色分析BA对PDB+Ion诱导的小鼠CD3+T细胞增殖的影响(略) ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ aP0.05,bP0.01vsPDB+Ion;G1:母代细胞百分率(%);G:各子代细胞百分率(%);PI:增值指数. 表3BA对ConA刺激小鼠淋巴细胞48h后的细胞周期分布(略) aP0.05,bP0.01vsConA. 表4BA对PDB+Ion刺激小鼠淋巴细胞48h后的细胞周期分布(略) aP0.05,bP0.01vsPDB+Ion. STRONG 3讨论/STRONG 以往研究中发现,BA能够明显抑制T细胞活化及某些细胞因子的释放(待发表)。T细胞是免疫系统发挥作用的核心,T细胞的活化、增殖与各种炎症性疾病有着密切关系,4,5,,T细胞活化和增殖是一个复杂的动态过程,涉及多种酶和信号转导途径,是执行细胞免疫功能的基础,6,。T细胞接触抗原、经双信号刺激活化,必须经过克隆扩增,进而分化成效应T细胞,才能发挥细胞免疫功能,在此过程中活化的T细胞首先分化成Th效应性细胞,并分泌IFN γ、TNF α和IL 1等炎症性细胞因子,造成瀑布式炎症失控性反应,最终导致组织的损伤,7,,因此,增殖是T细胞发挥作用的关键环节之一,在免疫应答中起着至关重要的作用。T细胞需要经DNA ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 合成、有丝分裂完成整个细胞周期才能实现增殖,细胞周期的变化直接影响T细胞的增殖。所以,抑制T细胞活化、增殖以及其活化后对细胞因子的释放,将成为调控免疫系统、Medicine治疗免疫炎症性疾病的重要策略之一。 在本实验中,分别采用CFDA SE和碘化丙锭染色,结合FCM,分析在ConA或PDB加Ion刺激下,BA对T细胞增殖情况和周期分布的影响。结果表明,各浓度的BA不仅对ConA引起的T细胞增殖有抑制作用,对PDB和Ion刺激T细胞增殖也有抑制作用,而且都呈浓度依赖关系,但从增殖指数看出,BA对ConA诱导增殖的抑制作用强于对PDB和Ion的。这可能是因为ConA与PDB加Ion两者诱导T细胞增殖的机制不同。ConA作用于细胞膜上的相应受体,需通过ZAP270、Fyn、Lck等上游的蛋白酪氨酸激酶(PTK)进行信息传递,进一步诱导胞内信号传导,信使Ca2+浓度升高等而导致细胞增殖;而PDB则是二酰基甘油(DAG)的类同物,能绕过活化跨膜传递分子TCR/CD3等直接作用于细胞内的蛋白激酶C(PKC),8,,离子霉素Ion是Ca2+载体,使细胞内Ca2+浓度升高,二者协同作用使细胞增殖。可见,BA很可能是PKC的抑制剂,在PKC通路的上游和下游也都可能存在BA的作用位点,在上游可以作用于T细胞活化早期相关PTK(如Lck、Fyn等),还可以通过作用于下游PTK或其他相关信号转导分子,从而影响T细胞增殖。 对细胞周期分析显示,随着BA浓度增加,与ConA或PDB和Ion刺激的T细胞比较,处于G2/M期的细胞数逐渐减少,S期细胞数基本不变,而处于 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ G0/G1期的细胞数增加,表明,BA可能通过干扰DNA的合成和分裂发挥其免疫抑制作用。有相关文献报道BA能抑制NF κB的活性,9,,NF κB是PKC信号通路下游重要的信号分子,但BA对淋巴细胞增殖的抑制作用是否与对NF κB的活性抑制有关,还需待进一步研究证实。 本研究证明,BA对刺激剂ConA或PDB和Ion诱导的T细胞增殖有明显的抑制作用,并可明显抑制G0/G1期细胞向G2/M期转化,推测BA很可能是PKC的抑制剂,在PKC通路的上游和下游均可能存在BA作用的靶点,BA抑制T细胞DNA合成是其发挥免疫抑制作用的机制之一。本研究结果提示BA可能是一种潜在的免疫抑制剂,值得进一步探索研究。 STRONG【参考文献】/STRONG ,1,GaoZX,HuangKX,XuHB.Progressofstudiesinthebioactivitiesofflavono idsextractedfromScutellariabaicalensis 707. ,J,.ChinPharmJ,1998,33(12):705- ,2,KimHM,MoonEJ,LiE,etal.Thenitricoxide2producingactivitiesofScute llariabaicalensis,J,.Toxicology,1999,135(2-3):109-115. ,3,肇静娴,曾耀英,何贤辉,等.活体染料CFSE在淋巴细胞增殖研究 ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ 中的应用,J,.细胞与分子免疫学杂志,2003,19(2):109-111. ,4,FerencziK,BurackL,PopeM,etal.CD69,HLA DRandtheIL 2RidentifypersistentlyactivatedTcellsinpsoriasisvulgarislesionalskin:bloodandskincomparisonsbyflowcytometry ,J,.Autoimmune,2000,14(1):63. ,5, LeckieMJ,JenkinsGR,KhanJ,etal.SputumTlymphocytesinasthma,COPDandhealthysubjectshavethephenotypeofactivatedintraepithelialTcells(CD69+CD103+),J,.Thorax,2003,58:23-29. 乐,曾耀英,黄秀艳,等.连翘提取物对小鼠T淋巴细胞体外 ,6,尹乐 活化与增殖的影响,J,.细胞与分子免疫学杂志,2008,24(1):10-12. ,7, SzaboSJ,SullivanBM,PengSL,etal.MolecularmechanismsregulatingTh1immuneresponses,J,.AnnuRevImmunol,2003,21:713-758. ,8,SunZ,ArendtCW,EllmerierW,etal.PKC θisrequiredforTCR inducedNF κBactivationinmaturebutnotimmatureTlymphocytes,J,.Nature,2000,404(6776):402-407. ------珍贵文档!值得收藏～----- ------精品文档!值得拥有～------ ,9,KimDH,KimHK,ParkS,etal.Short termfeedingofbaicalininhibitsage associatedNF κBactivation,J,.MechAgeingDev,2006,127(9):719-725. ------珍贵文档!值得收藏～-----