不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较

不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较 不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提 取的比较 不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较 方旅平,林元烧,曹文清 (厦门大学海洋与环境学院,福建厦门361005) 摘要:以采自厦门港的中华哲水蚤(Calanussinicus)为对象,研究多种保存条件对中华哲水 蚤基因组DNA提取的影响.结果表明,除5%福尔马林保存的样品没有提取到DNA之外,其 余样品均能成功提取出基因组DNA;以该DNA为通过相应引物成功扩增出线粒体DNA COI基因片段.其中无水乙醇保存样品提取可靠的基因组DNA方法的建立,为野外样品保存 工作提供了一个简便,经济的途径. 关键词:中华哲水蚤(Calanussinicus);基因组DNA提取;保存方法 中图分类号:Q33;Q959,223.31文献标识码:A文章编号:1000—3O96(20o5)O2一 ooO1一o4 进人2O世纪9O年代以来,分子生物学技术引人 浮游动物遗传学的研究已受到广泛关注,此类研究对 DNA质量的要求较高.已有的以DNA为对象的研究 中大多数所采用的样品为活体样品或冷冻样品,但是 在野外工作尤其在海上这两者样品保存很难实现,因 此一种简便可行,且又能满足DNA水平研究分析的 样品保存方法相当重要.针对该问题,作者以中华哲 水蚤(Calanussinicus)为研究对象,采用95%乙醇 (4?),100%乙醇(4?),5%福尔马林(4?),TE溶液 (一8O?)4种保存方法对其进行处理(其中95%乙醇 与100%乙醇保存时间相差约为la),提取基因组 DNA,通过凝胶电泳,EB染色对所提取的基因组DNA 进行检测,探讨了不同样品处理方法及保存时间对 DNA提取的影响.本研究结果对于其它浮游小型甲 壳类动物的分子遗传学的研究奠定了良好基础. 1材料与方法 1.1样品采集 样品采集地点:厦门港,2001年12月,2003年 1月.采集方法:采用浮游生物大型网水平拖取. 1.2样品处理及保存 室内处理:从采集到的海洋动物样品中分选出 中华哲水蚤,置于过滤海水(砂滤)中暂养过夜. 种类鉴定:以形态学为依据,利用解剖镜进行整 体鉴定. 样品保存:首先将中华哲水蚤在解剖镜下清洁体 表附着物,再利用多种方法对样品进行保存.值得注 意的是固定的样品特别是单只冷冻保存的样品,在保 存之前用灭菌纯水进行多次充分的洗涤. 1.3DNA基因组提取 取出保存的样品,若是无水乙醇保存的样品首 先利用梯度稀释浸泡(每个梯度浸泡1h)的方法基本 去除样品中的乙醇,其稀释梯度为60%,30%,10% 和灭菌纯水,4?过夜,再将样品吸干,加入TE溶液 (pH8.0)100ttL;若为福尔马林保存样品,首先通过 梯度稀释浸泡的方法去除样品中的福尔马林,其稀释 梯度同上,再将样品吸干,加人TE溶液(pH8.0)100 ttL;若为直接单只无溶液冷冻的样品,则直接加入TE 溶液(pH8,0)100L;若为单只TE溶液(冷冻)保存 则无需此过程. 收稿日期:2003—09—26;修回日期:2004—02—26 基金项目:国家自然科学基础研究重大课胚资助项目 (G1999043708) 作者简介:方旅平(1978一),女,浙江衢州人,硕士,助理工 程师,研究方向:海洋浮游动物生理生态,海洋分子生态学, 电话:0592—2189433,E—mail:lpfang@xmu.edu.cn MalineSeiences/Vol,29.No,2/2005 破碎样品,加入10%SDS溶液(1:10),蛋白酶K (终浓度为lg/L),55?水浴消化3,4h.用TE溶液补 至总体积至350L,再加入等体积的酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)混合溶液,混匀.11000r/rain离心6rain,吸 取上清.加入等体积异丙醇,1/10体积NaAC,混匀. 一 80?沉淀lh.12000r/min离心15min,倒出上清 ,12000r/rain离心5rain, 液.加入70%乙醇500L 倒出上清液.晾干,加入30LTE溶液(pH8.0)溶解 DNA,取出5L进行琼脂糖凝胶(0.8%)电泳,EB溶 液染色,凝胶成像系统拍照以确定提取是否成功.提 取的DNA基因组或进行PCR扩增,或置一20?下保 存备用. 1.4目的基因片段(mtDNACOI)的扩增及纯化 引物: 正向:LCO一14905'一GGTCAACAA ATCATAAAGATATTGG一3' 反向:HCO一21985'一TAAACT TCAGGGTGACCAAAAAATCA一3' PCR扩增程序: (1)94oC:5min:(2)94oC:1min;(3)42oC: 2min;(4)72oC:3rain;(5)72oC:10min; 其中(4)至(2)共循环40次 PCR反应体系:总体积为25L,具体如下: 缓冲液(10×):2.5L Mg(25mmol/L):1.0L LCO一1490(60t~mol/L):0.5L HCO一2198(60t~mol/L):0.5L dNTl~(各2.5mmol/L):0.25川 TaqDNA聚合酶(5U/L):0.15L DNA模板:2L(20rig) H20:18.1L PCR产物使用小量胶回收试剂盒(华粤公司)进 行纯化.1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,取象. 2结果 2.1DNA提取结果 图1为不同保存方法中华哲水蚤DNA提取后 其中,取模板母液5L,加入1Lloading 的检测图, buffer(6×).0.8%琼脂糖电泳,EB染色,全自动凝聚 成像分析系统拍照. 从图1中可以明显看出使用福尔马林保存的样 品无法提取出DNA或者极难以提取出DNA,而其它 2 21226bo一 1584bo一 图l不同保存方法中华哲水蚤基因组DNA提取的检测 Fig.1GenomicDNAextractionofCalanussinicuspreserved indifferentways 泳道从左向右:M,DNA标记(LambdaDNA/EcoRl+HindII! Marker,3);1,3.TE溶液(一80aC)保存的样品;4—6.5%福尔马林 (4?)保存的样品;7,9.95%乙醇(4?)保存(2001年l2月固 定);10,12.100%乙醇(4aC)保存(2003年1月固定) 【mesfromlefttoright:LaneMDNAmarker(LambdaDNA/ EcoRl+HindII!Marker.3);lane1—3.samplespreservedin"rEsolution 【一80aC):4—6.preservedin5%offormalinsolution;7,9.pre- servedin95%ethanol(fixedinDec,2001);10,12preservedin100% ethanol(fixedinJan.2003) 保存方法下的中华哲水蚤均可提取出所需DNA只是 提取量有所差异,特别是通过高浓度乙醇固定的样本 虽然固定时间达到一年以上但对DNA提取量的影响 很小. 2.2PCR扩增结果 以提取出DNA的9个个体的基因组DNA为模 板进行PCR扩增,并将其产物进行回收纯化,1.0% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,拍照(图2). 从图2中可看出,以本实验方法所提取出的3种 不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA为模板可成 功扩增出所需的目的基因片段. 3讨论 以本实验的提取方法无法从福尔马林保存的 样品中提取出DNA,结果如图1所示;4,6泳道无法 观察到DNA的条带.这与刘保忠等人的对海湾扇贝 rArKopectenirradians)样品的研究结果相似".影响因 海洋科学/2005年/第29卷/第2期 700bD 400bp 图2PcR扩增产物回收电泳图谱 Fig.2ElectrophoresisdiagramofpurifiedPCRproducts 1泳道:DNA标记(GeneRulerTMlOObpDNALadderPlus):2,4 泳道:TE(一8O?)保存;5,7泳道:95%乙醇(4?)保存(2001年12 月固定);8一10泳道:100%乙醇(4?)保存(2003年1月固定) Lane1:DNAmarker(GeneRulerTM100bpDNALadderPlus):lane 2,4:samplespreservedinTEsolution(一80?):5,7:preservedin 95%ethanol(fixedinDec,2001);8—10:pmservedin100%ethanol (fixedinJan.2003) 素有以下几种可能:一是没有将样品中的甲醛去除干 净.甲醛抑制了蛋白酶K的活性;二是由于该样品已 被福尔马林固定la以上,固定样品的DNA分子产生 交联作用,DNA抽提时与蛋白质等产生共沉淀进入 酚相;三是甲醛氧化后形成的甲酸对DNA有较强的 降解作用". 采用一般的方法难以有效地提取福尔马林保存 样本的基因组DNA,因此在以后的实验中应针对其干 扰因素改进DNA提取方法特别是固定后样品提取前 的处理方法及破壁消化方法尤为重要.例如徐来祥等 人成功提取了福尔马林保存的动物标本基因组 DNA认为:提取标本基因组DNA之前的预处理,目的 在于去除标本组织中的福尔马林的各种成分,该步骤 是提取标本DNA成败的关键.因此该文作者先取浸 泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量, 用PBS溶液冲洗,放在灭菌的吸水纸上将其揩干,在 超净工作台中用无菌剪刀将材料剪成小块.放人PBS 液浸泡12—24h;然后转入70%的乙醇中处理l2— 24h.依次进行梯度乙醇中处理:80%乙醇,2h,重复一 次;90%乙醇,2h,重复一次;95%乙醇,2h,重复一次; 100%乙醇,lh.重复一次.然后将材料放人1/2倍的 PBS溶液中浸泡12h,其间更换一次溶液.此外在消化 过程中还提到视样品的消化效果可以重复加入 量的1/2倍蛋白酶K进行消化.不过,提高蛋白酶K 的浓度是否有效还有待研究,因为在王义权等对蛇 的研究中曾尝试延长浸泡时间和采用双倍蛋白酶K 的用量,都没有取得满意结果.由于本实验及刘保忠 等,王义权等的实验中在浸泡时所采取的都仅是利用 灭菌纯水浸泡,且只通过将浸泡时间延长等方法,因 此刘来祥等人的实验中所采取的特别的预处理方法 值得注意及采纳应用.通过较好的预处理后,徐来祥 等的基因组DNA的提取方法为参考Sambroock等人 ,的方法的一种改进的酚氯仿抽提法,酚氯仿抽提最 后一次的上清液移人透析袋中透析;一20oC环境中 沉淀DNA基因组20min为宜.但是由于实验对象不 同(如个体大小差异,样品生化组成差异,等等),因 此.刘来祥等人的实验方法还有待于进一步的探索应 用,以达到在海洋浮游动物特别是桡足类研究中获得 满意的实验效果. 此外,另两种固定液保存方法【TE溶液保存,一80? 存放;高浓度乙醇(95%.100%保存),4?存放】如 果单从条带的亮度来判断,通过TE溶液保存和高浓 度乙醇保存后所提取的DNA的量相差不多,但其中 以95%乙醇4oC保存的效果最好.而同种保存方法提 取出来的DNA条带的亮度也并不完全一致,如泳道 l,3为TE溶液浸泡,一80?保存,2号明显比其他 的亮,这是因为样品保存时有多种不确定的干扰因 素,如个体大小,个体是否完整,每单位固定液体中存 有的样本个体数量等等,并且在提取过程中也不可避 免的存在操作上的误差. 再以同种固定液(高浓度乙醇)两种保存时间长 度来看,固定la以上的样本与短期固定的样本所提 取的DNA量相差不多.而且固定一年以上的样本提 取量反而稍多一些.这种结果的出现除了上述的影响 因素以外,95%的乙醇是否较之100%乙醇更适合于 固定样本及后续实验的进行还有待于进一步的实验 证明.高浓度乙醇保存作为野外工作最方便,最常用 的较为经济的保存方法,是适合于本实验的一种保 存方法.刘保忠等人"的实验结果中也提出乙醇固定 的样品完全可以得到质量很好的DNA样品.关键在 MmineSeienees/vol,29.No.2/20053 于固定样品时要小心操作,不要使桡足类个体破损, 保证足够的乙醇用量,并要定期更换固定液.这样有 利于之后DNA的提取. 总的来说,除了福尔马林保存,其余三种保存方 法对DNA基因组的提取影响差异不大,均能通过相 应引物扩增出所需的目的基因片段.有关该基因片 段序列及其分析将另文报道. 参考文献: [1】刘保忠,宋林生,相建海.海湾扇贝样品不同保存条 件下DNA的提取及RAPD扩增比较[J】.海洋科学, 2001.25(3):51—52. 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