铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药表型及耐药基因的检测

铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药表型及耐药基因的检测 ，，，，，，，，王 结 珍 孙 各 琴 朱 涛 张 炽 伦 张 秀 明 罗 锡 华 吴 秀 娟 温 羊 城 雷 杰 ,中山大学附属中山市人民医院检验医学中心 ，广 东 中 山 , ,,,,:: ,。摘 要 目 的 了解中山地区铜绿假单胞菌氨基糖苷类药物的耐药表 型和基因表型的分布及其关系 方 法 采 用 ，高级专家系统判定 年 月 株铜绿假单胞菌对 氨基糖苷类药物的耐药表型 并 对 ,,,,,),,:,,,,,:,: ,), ,,, , 其 中 株多药耐药铜绿假单胞菌采用 的 方 法 检 测 种氨基糖苷类修饰酶基因 。结 果 株 铜 绿 假 单 胞 ,,, ,,,,,,菌 及 ,、 株多药耐药铜 绿 假 单 胞 菌 对 氨基糖苷类药物的耐药表型模式均主要为表型模式 ,,,,,,,,,:,,,: ,,,,、、、,，、阳 性 株 分 别 为 株 株多药耐药菌株 全部检出氨基糖苷类耐药基因 :,,,,,,:,,,,,, ′)? ,,,,,,,, ,,,、,,、,,、、、分 别 为 临 床 分离的铜绿假单胞菌以单一耐药表型模式为 ,,,,, ,′,,,,″,,,,″)? )? )? 。株 结 论 ，，。主 推测该地区氨基糖苷类药物耐药的主要原因 是氨基糖苷类修饰酶基因的存在导致 ,,,关 键 词 铜 绿 假 单 胞 菌 氨基糖苷类修饰酶 耐 药 ,,,,,,中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 文 章 编 号 ,,,,,,:,,,:,,,,:,,,:,,,,,,::,))) ,,,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,:,,,,,,:,:,,,,,,,,,:,, ),,,,,, ,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，，，，， ,,:,:,,,,,,,,: ,,,,,:,,:, ,,,,,,,,:,, ,,::,,:,:,,)),)), ，，， ,,: ,,,,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,,,,: ,,,))),,, ,，，，, :,:,,,,,,,,,,,,, ,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,:,,,,,::,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,, ,: ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,:, ,,, ,:,,,,,,,:, :,,,, ,,,,:,,:,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, , ,,,,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,:,, ,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,:,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,:,,, ,,,,,,,,,，,,,,:,,,,:, :,,,:,:,:,,,,:,:,,,, ,,,,,:,,,,,:,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,),,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,, ,,,,,,:,,, ,:,,:,,,, ,,,,,,,:),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，,， , ,,: :,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,:,,,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,，,,，,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,),,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,，, ,,,,,,,′)? , ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,, ，,，，，，,,,,,′,,,,,,,″,,,,,, ″,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,::,,,,,)?,)?,)?, ，，,,:: ,,,,,:,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,:,,,,,,,,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,:,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,, ,,:,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,铜 绿 假 单 胞 菌 是 医 院 感 染 最 常 见 的 了解本地区铜 绿 假单 胞 菌 氨 基糖苷类抗菌药物 的 耐 ,,, 条 ，药表型和基因 表 型的 分 布 及 其 关 系 本 研 究 对 ,:,: ，件 致 病 菌 之 一 尤 其在医院获得性 感染中占重要地 年 月 分 离 的 株 铜 绿 假 单 胞 菌 进 行 耐 药 表 ,),,,, 。，位 由 于 其 对 多 种抗菌药物耐药 使得临床用药面 ，型 分 析 并 对 月 连 续 分 离 的 株 多 药 耐 药 菌 :), ,, 。临 严 峻 的 挑 战 其 对抗菌药物耐药主要是由于产生 株进行耐药表 型 分析 和 种 氨基糖苷类修饰酶 基 因, 、、多 种 内 酰 胺 酶 氨 基 糖 苷 类 修 饰 酶 外 膜 孔 蛋 ,, ,),)β，。 ,,、。 检 测 现 报 道 如 下 缺 失 外 排 机 制 等 其 中对氨基糖苷类 :,,,,白 。 耐药 主要 是由于氨 基糖苷类修饰酶基因的存在 为材 料 与 方 法 , ,,, 收 稿 日 期 修 回 日 期 :,,: ::,:,:,,,:,,))))年 月从广东省中 山 市 菌 株 来 源 ,,,,:,: ,), 基 金 项 目 ,中山市科技计划项目 ,, ,::,,,:,,、、、人 民 医 院 患 者 痰 血 液 尿 液 伤 口 分 泌 物 等 标 本 通 讯 作 者 ,孙 各 琴 ，,,,,,,,,,,,,,::,,:,,,,,),,,,, 中 ，分 离 出 株 铜 绿 假 单 胞 菌 并 选 择 株 多 药 耐 ,,,,, ,,表 株铜绿假单胞菌耐药表型检出率 , ,,, 。 ,菌 株 作 检测氨基糖苷类修饰酶 基 因 菌 株 采 ,,, ,, ，,,,,, ,用 ,,,,,,,,,,:,,,,,, 鉴 定 菌 种 并 用 标 准 菌 株 大 ,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,, ,:,,,,), :,,,,,,,,,,,:,,,,,,:,:,,,,,,,,,:,, ,、肠 埃 希 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 ,,,,,,,,,,,,,,:,,, 。耐 药 表 型 株 数 检 出 率 进 行 质 量 控 制 标 准菌株均购自卫生部临床检验中 ,,,,,,,,:。心 ,, ,, ,,: 主要仪器与试剂 全 自 动 细 菌 鉴 定 系 统 ,,,,, ,, ,,, ,, ,, ,,, ,,，法 国 生 物 梅 里 埃 公 司 试 ,,,,,,,:,,,,,,, ),,, ,, ,,, ,,剂 盒混 合 液 缓 ,,, ,,,:, :,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,: , :,, ,,,冲 液 厦门泰京生物技 ,,:,,,,,,,,,,,,,,,,: , ,。术 有 限 公 司 ,, ,,, ,,,, ，细 菌 的 提 取 采 用 煮 沸 法 参 见 文 献 ,,,、、、注 庆 大 霉 素 奈 替 米 星 阿 米 卡 星 妥 布 霉 ,,, ,:, ,,,,,,,,,:, ,,,,、、,,素 庆 大 霉 素 奈 替 米 星 阿 米 卡 星 ,,,,,,,,,:, ,,。 的 方 法 ,,,、,,,庆 大 霉 素 奈 替 米 星 ,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,:, ,,，引 物 序 列 参 照 文 献 用 于 基 因 引 物 设 计 ,,,,,,,,,、、庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 庆 大 霉 素 奈 替 ,,,,,,,,,:,，。。检 测 基 因 由 上 海 生 工 合 成 见 表 ,,, ,,,,,、,, ,米 星 妥 布 霉 素 庆 大 霉 素 ,,,,,,,,,:,,:,,, ,、、,, ,。妥 布 霉 素 奈 替 米 星 阿 米 卡 星 ,,,,:,,,,,,, 表 靶 基 因 引 物 序 列 , ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, , 基 因 引 物 序 列 产 物 长 度 ,,表 株铜绿假单胞菌耐药表型模式分布构成比 , ,,, ,,, ,,,′名 称 ,? ,, ,,:,,,,,,,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,′ ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,′,,,:,,,,,:,,,:,,,,,,,,,,:,,,, ,,)?,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,:,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,′,:, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, )?耐 药 表 型 模 式 株 数 构 成 比 , ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,″),,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ?,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, , :,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,:,,,,″),,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,, , :,, ? ,,,,,,,, , :,: ,,,,: , :,, ,, ,, ,,, 耐 药 基 因 的 扩 增 反 应 体 系 总 体 ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, , :,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ，、、积 为 其 中 反 应 缓 冲 液 混 合 ,,,,,,,:,, ,μ,,,,,,,,,,, , :,, 液 ,,,,,,,, , :,, ，，，上 下 游 引 物 各 标 本 ,,,, ,, ,, ,,,,,,,, , :,, μμμ,: , :,, ,: ,,, ,,, ,,,, 。反 应 条 件 ,预 变 性 ，变 ,,,,,, ?, ,,,,, ? ,, ,,: 无μ 性 ，，，, 退 火 延 伸 共 个 循 环 ,:,,, ?,:,:, ?,,,,: 耐 药 表 型 分 析 用 高 级,,, ,,,,,, ,:,,,, ), 株 多 药 耐 药铜绿假单胞菌 基 因 检 测 结 果 ,,,。，,, 延 伸 经 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 电 脑 图 像 分 : ,,,,,，专 家 系 统 判 定 年 月 株 铜 绿 假 单 ,:,: ,), ,,, 胞 ，均 能 检 出 种 氨基糖 苷类修饰酶基因 其 中 、。析 仪 观 察 分 析 电 泳 结 果 并 摄 像 , ,,, ? ， 菌 的 氨 基 糖 苷 类 药 物 耐 药 表 型 将 相应数据以文本 ,,,，,,基 因 检 出 株 占 ,,, ,,,:,,,,,′′)? ) ，。 基 因 格 式 导 出 转 化 成 格式并分析耐药表型 ,，,,,,,,,? 检 出 株 占 基 因 检 ,,,,:,,,,,″)? 结 果 ,，出 株 占 , ,,,，。 基 因 检 出 株 占 ,:,:,,,,,″, ,,,,,)? 铜 绿 假 单 胞 菌 对氨基糖苷类 药物的耐药表型 ,,,见 、。图 ,, 年 月 分 离 的 株 铜绿 假单胞菌对氨基 ,:,:,),,,, 讨 论 , 。、。糖 苷 类 药 物 的 耐 药 表 型 共 种 见 表 ,,, ,,,,,,氨 基 糖 苷 类 修 饰 酶 可 分 为 类 乙 酰 ,,,, 株 多 药 耐 药 铜 绿 假 单 胞菌的耐药表型共 ,,, ，,，转 移 酶 由 基 因 家 族 编 码 核 酸 转 移 酶 由 ,,,,,,,,，种 表 型 株 为 表 型 ,,,,,,,:,,,,, ,:,:, ,,，基 因 家 族 编 码 核 苷 转 移 酶 由 基 因 家 族 编 ,,,,,,,和 表 型 均 为,,,,,,,:,,,,,,,,,,:,,, 。码 ,,,、,、革兰 阴 性 杆 菌 以,,,,′,,,,′,,,)? )? ，，,,，。 株 为 表 型 株 为 ,,,:,,,,,,,,,,,,,,, ,″)? 、能是抗菌药物 在 不 同 国 家 不 同 地 区 的 使 用 不 同 所 。，致 因 此 实 验 室 应 加 强 细 菌 耐 药 性 监 测 指 导 临 床 ，， 合 理 用 药 及时发 现 耐 药菌 株及其流行趋势 为 延 缓，，细菌耐药性产生 有 效 控制 耐药菌株的播散和流行 。以及临床合理 选 用抗 菌 药 物 提供依据 ，整 合子是细菌基因组 中 的 可 移动遗 传 物 质 携 ，带 位点特异性重组系统组分 可 将 许 多 耐 药 基 因 盒 ，。 ，整 合 在 一 起 形 成 多 药 耐 药 整 合 子 是 细 菌 尤 ,,,。 其 是 革兰阴性菌多药耐药迅速 发 展 的 主要 原 因 氨 基糖苷类修饰 酶 基因 常 与 其 他不同的耐药基因 一 ，,,起 组成不同的基 因 盒 被 整 合 子 主 要 为 类 整 合 子 ? ,,,、。 等 捕 获 传 播 引 起 流 行推测此种药物 与 氨 基 糖 ，苷类药物的耐 药 性 由 整 合 子 携 带 并 表 达 有 待 进 。，，一 步 证 实 因 此 要 严 格 控制 临床抗菌药物使用 尤 其 是 预 防 整 合 子 及 其 他 促 进 耐 药 基 因 播 散 的 ，，机 制 入 手 来 控 制 耐 药 菌 的 播 散 以 提高临床抗菌 参 考 文 献 。效果 ,, ，，，,,。， 和 等 基 因 常 见 由 个 亚 类 组 成 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,″,,,, )? ,,,,,,,,,,,,,:,,,,,:,:,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,分 ,,，， ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,:,,::,、。别 在 和 的 位 置 乙 酰 胺 化 表 ,,,,,,,′′′),,,,,:,,,,:,,,,:,) 、、,现 为 对 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 卡 那 霉 素 耐 药 ,,,),, ，，，王 继 东 周 丽 珍 宫 玲 玲 等 铜绿假单胞菌的多药耐 药 基 因 ,, 、、主 要 表 现 为 对 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 卡 那 霉 素 ,,，，,,,,′研 究 中华医院感染学杂志 ,,,,:,,::,,,,,,,) ,, ，，钱 小 毛 赵 仲 农 王 亚 玲 铜 绿 假 单 胞 菌 内 酰 胺 类 抗 菌 药 。,,和 阿 米 卡 星 耐 药 )β,,，，耐药相关基因研究 中华医院感染学杂志 物 :,,::,,,、、、。分 别 在 的 位 置 腺 苷 转 化 ,,,,,,, ″″′,,, ,表 ,,,,、、″)现 为 对 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 卡 那 霉 素 耐 ,,,,,,,) ,, ，，， ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,:,: ,,,,,,,,,,,:,,,,,,药 表 ,,,,′):,,,,:,:,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,:,,,,,:,,,,,,, ,, ,、、现 为 对 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 卡那霉素和阿米卡星耐 ), ,,,,,,,:,,,,,,,:,,,,,,,,,,:,:,,,:,,,,,:,,,,,,,:,,,,,,药 和 主要表现 为对链霉素等耐 ,,,,,,,, ,,，，,,,″,,,,,))) ,,:,:,,:,,,,,,,,,,,,, 。 、。药 常 在 的 位 置 磷 酸 水 解 化 ,,,,,,″′,,),, ，，，史 伟 峰 王 玉 月 姜 庆 波 等 多药耐药性铜绿假单胞菌耐药 ,, ,,，，、、、表 现 为 对 庆 大 霉 素 妥 布 霉 素 卡 那 霉 素 阿 米基 因 及 菌 株 聚 类 分 析 中华医院感染 学 杂志 :, ,:::,:,″ ,,,,:,:,,,:,:) ,卡星和异帕米 星 耐 药 表 现 为 对 卡 那 霉 素 ,,,′,),, ，,,糜 祖 煌 陆 亚 华 氨基糖苷类修饰酶及其基因检测 现 代 ,,:,，和 阿 米 卡 星 耐 药 ，，,,,实 用 医 学 ,,,,::,,,,,,) 。而 对 庆 大 霉 素 敏 感 高 级 专 家 ,,,,,,,:,,,, ),,, ，，，何 建 方 沈 翠 芬 王 伟 洪 等 多 药 耐 药 铜 绿 假 单 胞 菌 耐 药 基 :, 系统 对铜 绿假单胞 菌的氨基糖苷修饰酶和耐药表型 ,,，，,,,因的检测与分析 中国卫生检验杂志 :,,:,:,:,,,,),,，,株 表 型 分 别 为 表 型 ,,,,,,,:, ,,,, ， ,,,, 对 应 关 系 还 没 有 明 确 判 定 法国 生 物梅里埃公司高 ,,,,和 表 型 均 为 ,,,,,,,:,,,,,,,,,,:,,,，，,, ,,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)) , 。 级 工 程 师 们 还在对这方面进行研究 本 研 究 中 ,,，,,,株 表 型 株 且耐药 表型模式以单一 ,,,,,,,, ,,,,,,:,,,,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,),, ，株 多 药 耐 药 铜 绿 假单胞菌检出耐药 表 型 共 有 种 , ,,，，,,,,,,,,:,,:,,,,,:,,:,,::,,,,,,,:) ，模 式 为 主 以 表 型 模 式 和 为,,,,,,,:, ,,,, ,, ，，，陈 辉 李 翔 伍 勇 等 革兰阴性菌中整合子携带氨基 糖 苷 类 ,,。，主 均 能 检 出 种 氨 基 糖 苷 类 修 饰 酶 基 因 其 中 , ?,,，，,,,耐药基因的分布 临 床 检 验 杂 志 :,,,:,,::,,:,,,,),,，基 因 检 出 株 阳 性 率 为,,,,′,, ,,,:,)? ,,, ,,，基 因 检 出株 阳 性 率 为,,,,,:, ,,,′)? ,, ,″)?