SC_T7219.5-2015三代虫病诊断规程第5部分：细锚三代虫病.doc

SC_T7219.5-2015三代虫病诊断规程第5部分：细锚三代虫病.doc ICS 65.020.30 B 50 中华人民共和国水产行业 SC/T 7219.5—2015 三代虫病诊断规程 第5部分:细锚三代虫病 Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis— Part 5 : Infection with Gyrodactylus sprostonae 2015-02-09 发布 2015-05-01 实施 中华人民共和国农业部发布 刖 SC/T 7219《三代虫病诊断规程》为系列标准: ——第1部分:大西洋鲑三代虫; ——第2部分:鲩三代虫病; ——第3部分:鲢三代虫病; ——第4部分:中型三代虫病; ——第5部分:细锚三代虫病; 第6部分:小林三代虫病; 本部分为SC/T 7219的第5部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由 农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口。 本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人:李文祥、王桂堂、邹红、吴山功、陈爱平。 三代虫病诊断规程 第5部分:细锚三代虫病 1范围 本部分规定了细锚三代虫病的感染对象与临床症状,细锚三代虫(也叫史若兰三代虫,(^ ZM^pro^onae)的采集与固定、形态学鉴定和分子检测的以及细锚三代虫病的综合判定。 本部分适用于鲤、鲫的细锚三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103水生动物产地检疫采样技术规范 3试剂和材料 3_ 1水:符合GB/T 6682中一级水的规格。 3.2乙醇:分析纯。 3.3 Taq酶:一20?C保存,避免反复冻融。 3.4 dNTPs:含 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 10 mmol/L。 3.5 上游引物:5TTTCCGTAGGTGAACCT _ 3\ 3.6 下游引物:5匕 TCCTCCGCTTAGTGATA- 3、 3. 7矿物油:不含DNA酶和RNA酶。 3. 8 DNA marker 2 000:2 000 bp、l 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 3.9其他试剂见附录A。 4仪器和设备 4. 1解剖盒、剪刀、镊子、解剖针、手术刀。 4. 2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。 4. 3盖玻片、载玻片、培养皿。 4.4电子天平。 4. 5普通台式离心机和高速冷冻离心机。 4.6普通冰箱和超低温冰箱。 4.7微量移液器。 4.8 PCR扩增仪。 4.9离心管和PCR管。 4. 10紫外透射仪。 4.11水平电泳系统。 5感染对象与临床症状 5. 1感染对象 细描三代虫能感染娜:Canu’iw awrams awra(MS)、东北鲍car/n'o /iCTwaZojWerws)、翅嘴 红舶:Er3^/m3CMZferifc/iae/ormA)和総:Si/wn? spp.)等。 5. 2临床症状 细锚三代虫主要寄生于体表,病鱼常出现蹭擦池壁、跃出水面的行为;有些病鱼反应迟钝,常在水流 缓慢的地方出现,体表因黏液增多变成淡灰色,背鳍、尾鳍和胸鳍的边缘出现糜烂。 6三代虫采集与固定 6. 1病鱼采集 仔细观察待检鱼类的临床症状和行为,撈取具有典型症状的鱼类。采样方法、样品数量、样品封存 和运输应符合SC/T 7103的规定。 6.2三代虫样品的收集 6.2.1现场采集 剪取鳍条、鳃丝或刮取部分体表黏液,置于载玻片上。滴加数滴清水,置于体视显微镜下观察。用 解剖针将三代虫从鳍条或鳃丝或体表黏液中分离,用吸管吸出,放在盛有清水的培养皿中,每尾病鱼至 少采集成虫10条。 6.2.2固定病鱼中的采集 剪取病鱼鳍条或鳃丝放在载玻片上,逐滴加入自来水浸泡10 min,置于体视显微镜下观察。发现三 代虫后,用解剖针将虫体分离,放在盛有清水的培养皿中;同时,镜检固定病鱼所用容器底部的沉淀物。 如发现有从鱼体脱落的三代虫,用吸管吸出,放在盛有清水的培养皿中。 6.3三代虫样品的固定与保存 加一滴清水到载玻片上,用吸管吸取一个虫体置于水滴中,轻轻地盖上盖玻片。用一张滤纸在盖玻 片边缘缓慢吸水,直到水基本吸干为止。加上一滴APG溶液(见附录A. 1)到盖玻片边缘,直到浸满盖 玻片与载玻片之间的空隙。 用于形态学鉴定的虫体样本可用70%酒精保存,用于PCR鉴定的虫体样品可用95%酒精保存。 7细锚三代虫的鉴定 7.1细锚三代虫的形态学鉴定 细锚三代虫运动如尺蠖;虫体呈长叶形,体长〇. 2 mm?0. 5 mm,体前有2个头器,无黑色眼点;虫 体后端具几丁质的伞状后吸器,其上有1对锚钩、16个边缘小钩和1根腹联结片;锚钩基部较长,与钩 尖几乎等长,腹联结片上窄下宽,突起间长小于腹联结片长,可依次进行鉴定。 细锚=代虫后吸器的锚钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其大小见附录B。如果虫 体后吸器的形态特征和测量大小与附录B相符,则可判定为细锚三代虫。 7.2细锚三代虫的分子检测 7. 2. 1虫体DNA的提取 将80%乙醇同定的三代虫(1个虫体作为1个样品)充分干燥去除乙醇,置人1. 5 mL的离心管中, 加入500 DNA抽提缓冲液I (见附录A. 4)于55?C消化3 h,冷却至室温后加人500 DNA抽提缓 冲液II (见附录A. 5),摇匀,11 000 g离心10 min,收集上清液。然后,加入2倍上清液体积的一20?C预 冷无水乙醇,4?C下5 000 g离心10 min弃上清液,70%乙醇洗涤沉淀2次,弃上清液,空气干燥后溶于 40 pL TE缓冲液(见附录A. 2),一20?C保存备用。 2 7. 2. 2 rDNA - ITS 的 PCR 扩增 PCR反应体系(25 L)中,加入20 pmol/L的上游引物和下游引物各1 L,dNTPs 2 pUMgCU 2. 5 pUTaqMM 酶缓冲液2. 5 juUO. 5 U Taq酶以及模板基因组DNA 1 yL,最后用无菌去离子水定容到25 pL, 无热盖加的PCR仪应加矿物油25 yL。PCR扩增时,应设置阴性对照和阳性对照。 在PCR扩增仪中,94?C预变性4 min,再94?C 30 s—50?C30 s—72?C 1 min,共35个循环;最后72?C 延伸10 min。 7. 2. 3 PCR产物电泳与测序 取5 juL PCR产物,加入1斗溴酸蓝指示剂溶液(见附录A* 9),混匀。用1. 0%琼脂糖(含0. 5 pg/mL EB)于TAE缓冲溶液(见附录A. 7)中电泳分离,同时设置DNA分子量标准作参照,紫外透射仪下检查 是否存在大约1 300 bp的目的条带。如存在目的条带,则取PCR扩增产物测序,其序列参见附录C。 序列相似性在99%以上者,判定虫体为细锚三代虫。 8综合判定 8. 1细锚三代虫的判定 如果在显微镜下观察到鲤、鲫的鳍条或鳃丝或体表的三代虫符合7. 1的形态特征和测量数据,或根 据7. 2的方法对PCR扩增产物测序,与附录C给出的序列进行比对分析,序列相似性在99%以上者均 可判定虫体为细锚三代虫。 8.2细锚三代虫病的判定 鲤、鲫(包括金鱼)感染细锚三代虫,数量多于其他三代虫种类的,且病鱼临床症状符合5. 2描述,则 判定为细锚三代虫病。 附录A (规范性附录: 试剂及其配制 本附录所有试剂,除特别注明外,全部采用分析纯的试剂。 A. 1 APG溶液 将饱和的苦味酸铵溶液和甘油按照1 : 1的比例混合。 A.2 TE缓冲液 1 mL Tris- HC1(1 mol/L,pH 8. 0)和 0. 2 mL EDTA(0. 5 mol/L,pH 8. 0)混合,加无菌去离子水 定容至100 mL,高压灭菌后4?C保存。 A. 3 10%SDS 溶液 10 g SDS溶于90 mL蒸馏水中,68?C助溶,用盐酸调pH至7. 2,最后加蒸馏水定容至100 mL,室温 保存。 A.4 DNA抽提缓冲液I 400juLTE缓冲液、16^蛋白酶K(5mg/mL)和20L 10% SDS的混合溶液。 M A.5 DNA抽提缓冲液I 按Tris - HC1溶液饱和过的重蒸酚、氯仿、异戊醇以25 : 24 : 1的比例混合,密闭避光4?C保存。 A. 6 Taq 酶缓冲液:10 倍 PCR buffer) 0• 5 mol/L pH8. 8 的 Tris - HCU0. 5 mol/L 的氯化钾(KC1)和 1%的 TritonX- 100 的混合溶液。 A.7 TAE电泳缓冲液(50倍: 242. 0 g Tris碱、37. 2 g NaEDTA . 2H0混合,然后加人800 mL的去离子水充分搅拌溶解,再22 加 人57. 1 mL的冰乙酸,充分混勻,加去离子水定容至1 L,室温保存。 A. 8 核酸染色剂(ethidium bromide,EB) 用水配制成10. 〇 mg/mL的浓缩液。使用时,每10. 0 mL电泳液或琼脂中加1. 0 pL的EB。 A. 9溴酣蓝指示剂溶液 溴酚蓝100 mg,加双蒸水5 mL,在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25 g,加双蒸水溶解后移入溴 酚蓝溶液中。摇匀后加双蒸水定容至50 mL,加人氢氧化钠(NaOH)溶液1滴,调至蓝色。 附录B (规范性附录: 细锚三代虫后吸器的形态测量 B. 1细锚三代虫后吸器锚钩的测量部位及大小见图B. 1。 说明: -钩柄长(36. 0卩m?40. 0 ^m); d--- 基部长:13. 0 pm?21. 0 pm)。 锚钩的测量部位及大小 图B. 1 B. 2细锚三代虫后吸器边缘小钩的测量部位及大小见图B. 2。 10 说明: a----全长:18. 1 pm?25. 8 pm); b ---镰部长(3. 9 pm?6. 0 jLim); 图B. 2 边缘小钩的测量部位及大小 B. 3细锚三代虫后吸器腹联结片见图B. 3。 10 jx m -基部总宽度(21. 0 pm?25. 0 pm)。 -基部宽度:6. 0 ?7. 0 pm); - 中间宽度(4. 1 ?6. 2 pm); 图B. 3腹联结片的测量部位及大小 附录C (资料性附录: 细锚三代虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列 细锚三代虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列如下,下划线为引物。 tttCCRtaRK gaaggatcat taaacatagt ttcctgtttg tgtgtaattc tgaacct只CR 1 61 agttgtgatt gctaacagct aatatagctg agctctatga gcgagtgaga gattaacgaa 121 atgaaacctg 6l3.t3r3.t3.CCC aaggttatca taaataatgc cacccaataa tactgcacgt 181 ttgccacacg cagtaaaaag 3,?l3,CC3.8.8.Cg aacgagatac gaacgagatt cgaacgagat 241 aataagcgca tcgcgcaaaa gcaatcacac tgttttattc gcatttcatc tgccctataa 301 aattaggggt gaactatgta gtaacccctc actgtcattc agacagttgc tatttacaat 361 acgcaatgtg gtgaactggt aatcttccgt gctaaaatgg taatggctag ctacggtaag 421 gtctgattat cggtttggct acggccagcc cattggtgta tccgctatta ccaaaacctt 481 ctctacagtg gttcgttgga gttccacact cactgcctcg gcaccttcgg gtgaactgat 541 cgtagtgctt agcgccccgt aaaaagggaa gaagctttgc ttattacaac tccatgtggt 601 ggatcactcg gctcacgtat cgatgaagag tgcagcaaac tgtgttaacc aatgtgaaac 661 gcaaactgct tcgatcatcg gtctctcgaa cgcaaatggc ggctaagggc ttgctcttag 721 ccacgttcga tcgagtgtcg gcttttacct atcgtaacgc ttaattagtt acggattggg 781 aagcatacca tggctacgcg attaacttgt tgctgaaagt gggaacagtg ggtattacac 841 ggtctttacg gtttgcccat tggtgttcgg attctggtat tacacggtct ttttacggtt 901 tgccagatga attcacgctc ttacaagtaa gcgcttcaaa gtattacacg gtctctacgg 961 tttgctttga agtaaagacc tctatatcat acacgacttc tacggtttga tatggagtga 1021 agtagctcta gtggttcttc cttaattact tgggtagtat tgttgtatac tttatggtct 1081 gctctgcaca gggtgcgtgg cttagttcgc tttgtaacgc tgtactgttg tggatagatt 1141 tgtgtatgat atacccagtg aaataaagtc ctgacctcga ttcgagcgtg aatacccgct 1201 gaacttaagc atatcactaa RCRRaRRa