长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存研究

长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存研究 长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低 温保存研究 西北植物,2006,26(8):1605—1611 ActaBot.Borea1.-Occident.Sin. 文章编号:1000—4025(2006)08一I605—07 长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化 法超低温保存研究 郭燕霞,刘玉军 (北京林业大学生物科学与技术学院,北京100083) 摘要:对长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存进行了初步研究.结果明,预培养,预处理,脱水处 理及冻后处理对长鞭红景天悬浮培养细胞存活率均有重要影响,方差分析结果均显示差异显着.长鞭红景天悬浮 培养细胞过程中最佳培养条件是:在含5二甲基亚砜(DMSO)的MS培养基上预培养1h,室温下8o%PVsz预处 理40rain,然后用1OOPVs2于0?处理50min,投入液氮(LN)保存1h后在4O?水浴中迅速化冻,再用1.2mol/ I蔗糖培养液洗涤3次,每次10min,洗涤后的悬浮培养细胞用氯化三苯四氮唑(TTC)法检测,其存活率可达72. 7O. 关键词:长鞭红景天;悬浮细胞;玻璃化法;超低温保存 中图分类号:Q813.1;Q949.751.1文献标识码:A APreliminaryStudyofSuspensionCellCryo-preservation ofRhodiolafastigiatabyVitrification GU()Yan—xia.LIUYu—jun (CollegeofBiologicalSciencesandBiotechnolgy,BeijingForestryUniversityBeijing1000 83,China) Abstract:Thestudywascarriedouttopreliminarilyinvestigatethecryo— preservationofthesuspension cellsofRhodiolafastigiatabyvitrification.Itshowedthatthepre—culture,pre— treatmentanddehydration andpost— freezingtreatmentexertedimportantinfluencesonthesurvivalofthesuspensioncellsofR.fasti— giataandtheinfluencesweretestedinvarianceanalysissignificantlydifferent.Inthesuspensioncultureof R.fastigiatacells,theoptimalconditionswerethatR.fastigiatacellswereculturedontheMSmedium containing5DMSOforonehourandthenpretreatedwith80PVS2atroomtemperaturefor40minutes andnexttreatedwith100PVS2for50minutes;Afterthis,theywereputintoandstoredinliquidnitro— genforonehourandthenthawedin40? waterbath;Lateron,theywererinsedwith1.2mol/Lsucrose solutionthreetimesandeachrinselasted10minutes:Aftertherinses,thesuspensioncellsweretestedwith TTCtohaveasurvivalrateashighas72.70. Keywords:Rhodiolafastigiata;suspensioncell;vitrification;cryo—proservation 长鞭红景天ERhodiolafastigiata(Hook.f.et Thoms.)S.H.Fu]属景天科(Crassulaceae)红景天 属(Rhodiola)多年生草本植物,是重要藏药药用植 物之一;主要产于我国西藏,云南,四川等高海拔地 区.体内含特有的长鞭红景天素甲(glucoside fastigitinA)及红景天甙,酪醇等多种化合物,红景 收稿日期:2006—05—12;修改稿收到日期:200607,16 基金项目:西藏自治区科技厅重点资助课(2002—49);北京林业大学研究生院研 究生科研基金资助 作者简介:郭燕霞(1977一),女(汉族),硕士,主要从事药用植物学研究. *通讯联系人.C0rresp0ndencetO:LIUYu—jun.E—mail:yjliubio@163.corn 西北植物 天甙(salidroside)具有抗疲劳,抗衰老,抗微波辐射, 抗病毒及抗肿瘤等显着功效.近几年研究还发现, 红景天甙在军事医学,航天医学及运动医学上亦具 有十分重要的价值].但由于我国的野生红景天资 源十分有限,红景天又多生长在海拔较高地区,常常 难以得到较多的繁殖材料,加之长期的掠夺性采挖 及在引种时根茎腐烂现象十分严重,使得红景天已 成为濒危物种_3].因此,红景天的就地保存和迁地 保存都变得较为困难.离体培养技术在植物种质收 集扩增和中短期保存起到了很大作用,但长期继代 培养不仅费时费力,而且还会引发遗传不稳定性. 超低温保存是长期保存植物组织和细胞并保持其遗 传稳定性的有效方法.在液氮温度为一196?下,细 胞的生长和代谢瞬间完全停滞,不仅安全稳定,并且 节省空间,可建立起长期有效的离体基因库]. 玻璃化法与传统的超低温保存技术所运用的技 术和物理都不同;传统的超低温保存技术以胞 外结冰诱导脱水为基础.玻璃化法则利用高浓度保 护剂对悬浮细胞进行脱水,当脱水完成后,迅速投入 液氮冷冻保存,细胞连同胞外保护剂都进入玻璃化 态,排除了影响胞内结冰的所有因素,达到保存的效 果.那么什么是玻璃化态呢?在生物物理学上,含 水溶液能固化分成两种主要形式,一种是冰晶态,另 一 种是玻璃化态.如果溶液非常粘稠,降温速度又 非常快,冰晶难以生长或没有充分时间生长,溶液就 进入玻璃化态.进入玻璃化态时,水分子没有发生 重排,不产生结构和体积的变化,减轻了机械损伤和 溶液效应损伤[1]. l973年Nag和Steetl6成功地用液氮超低温保 存了胡萝卜悬浮培养细胞,这是超低温保存植物材 料的首次报道;自此以后,干冻法,预冻法,两步法等 传统的超低温保存方法逐步发展起来.悬浮细胞是 体细胞胚和再生植株的重要来源,也是植物生物技 术的重要实验材料.20世纪90年代以前,悬浮细 胞的超低温保存大多采用两步法,但这种方法操作 繁琐耗时,需要程序控温仪等设备,难以普遍推广应 用I7].20世纪80年代末90年代初发展起来的玻 璃化法是超低温保存的新方法,无需程序控温仪,不 仅操作简单,冻存效果好,而且可以用于保存完整的 器官,与只能保存同一组织或同种细胞的传统技术 相比,玻璃化法更为实用,是长期保存植物种质并保 持遗传稳定性的最有效而经济的方法].本实验室 在成功建立起长鞭红景天悬浮细胞培养体系的基础 上,对其悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存开展 了深入细致的理论探索与技术研究,形成了一套较 为完善的实验室研究用长鞭红景天悬浮培养细胞的 超低温保存,为长鞭红景天种质资源的长久有 效保存奠定技术基础. 1材料与方法 1.1实验材料 长鞭红景天于2002年7月采自西藏自治区林 芝地区色基拉原始林区,由西藏大学农牧学院植物 教研室鲍隆友教授鉴定,凭证标本保存在西藏大学 农牧学院高原生态研究所(西藏林芝国家生态定位 站)标本馆., 悬浮培养细胞是以长鞭红景天叶片为外植体, 在MS附加6-BA(3mg/I)和2,4一D(0.1mg/I) 的培养基上诱导获得并继代培养;本实验取继代培 养l0,l5d的悬浮细胞为实验材料.悬浮细胞聚 集成小组织块,均匀分布于液体培养基中,外观呈浅 黄色,此时细胞质浓,无液泡,壁薄,处于旺盛生长的 指数期,具有较强的抗冻性. 1.2实验方法 植物种质玻璃化冻存的一般程序包括预培养, 预处理,脱水处理,冷冻保存,化冻,洗涤和细胞存活 率检测7个主要环节j. 1.2.1冻前处理冻前处理包括预培养,预处理和 脱水处理3个环节.本研究对预培养,预处理和脱 水处理的最佳条件分别进行了筛选,具体操作如下: (1)预培养:将悬浮培养细胞转至含5的二甲基亚 砜(dimethylsulfoxide,DMS())的MS培养基上,预 培养不同时间(0,l,2,3h);(2)预处理:将悬浮培 养细胞移入冷冻管,并加入80玻璃化保护剂2 (plantvitrificationsolution,PVS2)_g],在室温下预 处理不同时间(0,l0,20,30,40,50min);(3)脱水 处理:在悬浮培养细胞中加入预冷至0C的100 PVS,于0?处理不同时间(0,10,20,30,40,50,60 min).通过以上各步骤比较不同处理时间对超低 温保存后组织存活率的影响,筛选出最佳组合. 1.2.2冷冻保存悬浮培养细胞经脱水处理后吸 去原有的处理液并换入新鲜的PVS2,迅速投入液氮 中实施冷冻保存,液氮中贮存时间长短对冻后细胞的 遗传特性和植株再生几乎没有影响】.因此,本研究 中确定悬浮培养细胞在液氮中的保存时间为lh. 1.2.3冻后处理冻后处理包括化冻和洗涤2个 8期郭燕霞,等:长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存研究 环节.化冻方式和化冻温度对冻后植物材料的成活 率均有较大影响.本研究预备实验阶段比较了冰箱 内4?低温,自来水流水(18.5?2)?冲洗,室温(23 - 2)?及30,40,50C水浴几种不同化冻方式的化 冻效果,并进行氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl一 2H—tetrazoliumchlorideTTC)法检测l】.]. 1.2.4细胞存活率检测细胞存活率的检测采用 TTC法.具体操作如下:取洗涤后的悬浮培养细胞 放人试管中,加入0.1的TTC溶液(缓冲液为0.2 mol/IpH一7的磷酸缓冲液)5mI,置于室温下染 色26h.用吸管吸去TTC液,再用蒸馏水漂洗2, 3次,加入5mI95酒精,置于60?水浴中加热30 min,提取氯化三苯基四氮唑被脱氢酶还原后生成 的红色甲簪(三苯基甲簪,TTF).取上清液在分光 光度计490nrn波长处测定吸收值.用吸收值 (TTC值)表示各处理组织在超低温保存后细胞的 存活率.,计算公式: 细胞存活率一(处理后细胞的TTC值/未处理 细胞的TTC值)×100 1.3统计分析方法 统计分析采用Excel单因素方差统计分析法及 SPSS邓肯分析法. 2结果与分析 2.1预培养时间对长鞭红景天悬浮培养细胞存活 率的影响 预培养的目的是提高悬浮培养细胞的抗冻力, 减少或避免冷冻伤害.悬浮培养细胞首先在含5 二甲基亚砜的MS基本培养基上培养一定时间,以 减少细胞的自由水含量.从图1可以看出,未经预 培养的悬浮细胞活性较低,抗冻能力较弱,其相对存 活率只有30.07,而经过5DMSO处理后,悬浮 培养细胞的存活率随预培养时间的延长有升高的趋 势,至预培养1h时,长鞭红景天悬浮细胞存活率最 高,达到57.36;继续培养其存活率开始下降,当 预培养3h时存活率只有30.97.这是因为DM— S()对细胞生长有毒害作用l】"],一定预培养时间 内,它能使细胞内自由水减少,保护性物质增多;预 培养时间过长,DMS()会对细胞造成伤害甚至死 亡.实验结果表明,长鞭红景天悬浮培养细胞的存 活率在各预培养时间之间差异显着(P<0.05),其 最佳预培养时间为1h. 处理时间Timeoftreatment(h1 图1不同预培养时间对长鞭红景天悬浮 培养细胞玻璃化冻存后存活率的影响 Fig.1Thesurvivalratesofsuspensioncellsof Rhodiolafastigiataatdifferentprc—culturetimes 2.2预处理时间对长鞭红景天悬浮培养细胞存活 率的影响 为了进一步降低组织含水量,在PVS脱水处 理前还往往有一个过渡性的预处理阶段.本实验用 80PVS室温下进行预处理,比较不同预处理时 间对长鞭红景天悬浮培养细胞存活率的影响.从图 2可以看出,用80PVS经40rain预处理获得最 大细胞存活率,TTc检测存活率达到67.19;预 处理时问少于40rain,细胞不易存活;预处理时问 超过40min,则由于80PVS溶液对细胞的毒害 而使存活率又有所下降[】.因此,最佳预处理时间 是40min,方差分析结果显示,不同预处理时间的 细胞存活牢莆(P/(1.05).. olo203o405o 处理时间Timeoftreatment(h) 图2不同PVS(8O)处理时间对长鞭红景 天悬浮培养细胞玻璃化冻存后存活率的影响 Fig.2Survivalratesofthesuspensioncellsafter theirvitrificationcryo—preservationadoptingdifferent timesof8O%PVtreatment ?如?如O 一一o对.I一对一.Ij?u 斛烬u ???O 一一o对.I一对一.Ij?u 料蜒姑u 1608西北植物26卷 2.3PVS脱水时间对长鞭红景天悬浮培养细胞存 活率的影响 由于PVS的毒害作用较大,在室温下用PVS 处理,细胞易伤害致死,低温条件下,相对来说毒性 较低,故在0?用100PVS处理.本实验比较了 不同脱水处理时间对长鞭红景天悬浮培养细胞存活 率的影响.实验结果(图3)显示,未经PVS.脱水处 理其成活率为23.739/6,随着PVS处理时间的逐渐 延长,其存活率有所提高,PVS处理50rain时长鞭 红景天悬浮培养细胞存活率达到最高,为61.03. 超过50rain后存活率呈现下降趋势.这是因为处 理时间少于50rain,由于细胞脱水不够,在降温过 程中不能迅速达到玻璃化状态,因而不易成活;处理 时间超过50rain,细胞由于受到PVS的毒害作用, 存活率反而又有所下降.所以长鞭红景天悬浮培养 细胞的玻璃化法超低温保存必须有玻璃化保护剂的 参与,但PVs处理的最适宜时间应为50rain,方差 分析结果显示,各脱水时间的细胞存活率差异显着 (P<0.05) {;{卜 蝤 烛 U O1O2O30405060 处理时间Timeoftreatment(h) 图3不同PVS处理时间对长鞭红景天悬浮 培养细胞玻璃化冻存后存活牢的影响 Fig.3Thesurvivalratesofsuspensionceilsof Rhodiola{nstigiataaftertheirvitrificationeryo— preservationsadoptingdifferenttimesofPVS2treatment 2.4化冻处理对长鞭红景天悬浮培养细胞玻璃化 冻存后存活率的影响 表1结果显示,冰箱内4C低温,室温,30|C水 浴及50?水浴化冻的细胞存活力较低弱,而自来水 流水冲洗化冻和40C水浴化冻后的细胞存活率较 高,分别为59.O9和63.18,说明化冻后的悬浮 培养细胞保持了较高的生活力.因此,自来水流水 冲洗化冻和40?水浴化冻是长鞭红景天悬浮培养 细胞玻璃化法超低温保存较好的化冻方式.本研究 确定采用40.C水浴化冻处理,方差分析结果显示, 各化冻方式间的细胞存活率差异显着(P<0.05). 冻存后的洗涤处理在超低温保存过程中也是很 重要的一步,既能除去高浓度的玻璃化保护剂,避免 对细胞造成伤害,又是一个后过渡,使悬浮细胞从充 满玻璃化保护剂的环境过渡到适合恢复生长的附加 6一BA(3mg/L)和2,4一D(0.1mg/L)的MS培养 基环境.洗涤液的渗透压过低,细胞因吸水膨胀而 容易受到损伤,过高的渗透压又可能导致细胞发生 质壁分离,也影响其成活率"],常用的洗涤液是 含1.2mol/L蔗糖的MS基本培养液.本研究将化 冻后的材料用含1.2mol/I蔗糖的MS基本培养液 在室温下洗涤3次,每次10rain,效果良好. 2.5玻璃化冷冻程序的优化 为了检测玻璃化完整程序中的每一步对长鞭红 景天悬浮培养细胞存活率的影响,获得一个最优化 和最简单的玻璃化冷冻方案,本实验对长鞭红景天 悬浮培养细胞进行了以下6种处理,处理方式及结 果见表2. I号是经过完整程序处理的悬浮细胞,其存活 率可达72.70;II号悬浮细胞经预培养,预处理, 脱水处理后直接洗涤,未经冷冻,其存活率为 81.29;?号虽然未经冷冻处理,但由于DMSO及 PVS都带有一定毒性lI"J,依然会对悬浮细胞造 成一定的伤害,所以它的成活率达不到100-. 对I号处理与?号处理进行比较,发现两组处理中 细胞存活率相差较小,方差分析结果也表明,差异不 显着(P>0.05),说明在液氮中的冷冻并未对悬浮 细胞造成重大伤害.在接下来的?号,?号,v号, VI号处理中,细胞成活率均相对较低,依次为56. 20,53.37,57.429/6,51.60,方差分析结果显 示,各处理与I号处理差异显着(P<0.05),表明冻 前冻后处理才是超低温保存成功的关键所在. 2.6恢复培养 在玻璃化冻存生物材料后,通常采用TTC法 或FAD来测定细胞生活力,但其检测的都是细胞 内某种酶的活性,无法显示细胞是否具有分生能力, 因此真正能正确鉴定植物材料生活力的较有效的测 定方法就是保证经玻璃化冻存后的组织或细胞可以 恢复生长. 在本实验中,取处于旺盛生长期生长良好的悬 浮细胞,按前面所述的玻璃化超低温保存的完整程 序进行处理.先将一批材料经冻前处理后投入液氮 进行超低温保存;在保存9d后按照同样的方法另 加?如?如加m0 ^一Q三d^l艺j?u 8期郭燕霞,等:长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存研究1609 注:不同小写字母表示数据在0.05水平上差异显着. Note:Thedifferentnormallettersintherowsbowsignificantdifferenceat0.05leve1. 表2不同冷冻程序组合对长鞭红景天悬浮培养细胞玻璃化冻存后存活率的影响 Table2ThesurvivalratesofsuspensioncellsofRhodiola{ustigiataaftertheirvitrification cryo—preservationsadoptingdifferentprocedures 注:表中所列的存活率为TTC法检测结果;+表示处理;一表示未处理.不同小写字 母表示同列数据间差异显着(a一0.05). Notes:Intable2thesurvivalratesweretestedwithTTC;+.1,reated;.Untreated.Thedifferent normalletterinthesamecolumsshow significantdifferenceata一0.05. 外保存一批,第1O天时同时取出解冻,洗涤并重新 接人附加6-BA(3rag/I)和2,4-D(0.1rag/I)的 MS培养基进行恢复培养,并同时与未经任何处理 的悬浮细胞及虽经冻前冻后处理但未经冷冻的悬浮 细胞做对比,并绘制生长曲线(图4),以比较不同冷 冻时间及不同处理方式对细胞恢复培养所产生的不 同影响. 从图4可以看出,系列1与系列2两条曲线开 始均呈上升趋势,这时细胞逐渐恢复生长,生长量有 明显增加,同时也说明冻后的长鞭红景天悬浮细胞 仍具有正常分生能力;12d时达到最大,12d后则 由于培养基中的营养物质和氧气的逐渐减少及细胞 代谢产物的生成,阻碍了细胞的继续生长,使得一部 分细胞死亡,生长量开始有所下降.从图4也可以 看出,系列1与系列2两条曲线显示出的生物量的 增长趋势基本相同,表明冷冻时间长短对细胞成活 率影响不大,再次证明玻璃化法超低温保存是对植 物种质进行长期保存的最有效的方法. 系列3经冻前,冻后处理但未经冷冻处理,后期 细胞成活率略大于经冷冻处理的悬浮细胞,但由于 冻前冻后处理依然会对悬浮细胞造成一定的伤害, 所以与系列4相比,其成活率较低. 磐 删 — ?一系列1Sequence1—?一系列2Sequence2 — ?一系列3Sequence3—?一系列4Sequence4 0369l2l5 培养时间Timeoftreatment(d) 图4不同冷冻时间与不同预处理过程 组合对恢复培养细胞增长的影响 系列1:经过冻前,冻后处理且冷冻1d的悬浮细胞;系列2: 经过冻前,冻后处理且冷冻10d的悬浮细胞;系列3:经冻前, 冻后处理但未经冷冻处理的悬浮细胞;系列4:未经任 何处理正常生长的悬浮细胞. Fig.4Effectsofdifferentfreezingtimesanddifferent waysoftreatmentonrecuhureofthesuspensioncells Sequence1:withpre—treatment.post—treatmentand1dfreezing treatment;Sequence2:withpre—treatment.post—treatmentand10d freezingtreatment;Sequence3:withprttreatmentand post—treatment;Sequence4:withoutallytreatment. ?舳??加O 西北植物 3讨论 目前进行超低温保存的植物材料已达200余 种L7],超低温保存技术也在珍稀植物种质资源的保 存中发挥着越来越重要的作用;本实验所采用的玻 璃化法,广泛地应用于各种植物材料的超低温保 存L】;在超低温保存过程有些材料(如种子和休 眠芽)因可以自然脱水而无需进行任何预处理,但大 多数材料(如悬浮培养细胞,愈伤组织,茎尖,胚胎细 胞等等)因细胞含有大量的自由水,对冻害极为敏 感,不具有抗冻性,因此必须对这些细胞进行人工脱 水,以确保在胞内冰晶化过程中不造成冷冻伤 害【2.玻璃化法目前已成为低温生物学领域发展 最快的门类之一. 在本实验中,预培养,预处理,脱水处理及冻后处 理对长鞭红景天悬浮培养细胞存活率也都有重要的 影响,研究结果表明:将悬浮培养细胞在含59/5二甲 基亚砜(DMS())的MS培养基上预培养lh,室温下 8OPVS2预处理40min,后用1009/6PVS2于0C处 理50min,投入液氮(LN)保存,lh后在40?水浴中 迅速化冻,用1.2mol/l蔗糖培养液洗涤3次,每次 10min,TTC法检测长鞭红景天悬浮培养细胞的最高 存活率可达72.7O,并可恢复培养.为珍稀濒危药 用植物种质库的建立奠定了技术基础. 在玻璃化法超低温保存过程中,经过预培养的 悬浮细胞在投入液氮保存前,必须投入高浓度的玻 璃化保护剂中进行脱水;而未经预处理直接脱水会 对悬浮细胞造成伤害,影响细胞的渗透平衡甚至造 成化学毒害.因此,脱水前的处理是影响冻存效果 的重要因子l2.通过预处理诱导渗透耐性的具体 的作用机理还不是很清楚,可能是预处理减小了这 种破坏作用,避免了在接下来的脱水及冷冻过程 中破坏细胞膜l2.超低温保存中适当的脱水是成 功的关键,对悬浮细胞进行脱水,在投入液氮快速冷 冻时,可以提高玻璃化的形成能力,减小对细胞膜的 伤害.除此而外,预培养,预处理和脱水处理时 间也会影响到冻存效果;处理时间太短,达不到预期 效果;处理时间太长,又会毒害悬浮细胞[;脱水时 间取决于材料的特性,包括植物的基因型,抗冻性及 细胞的年龄,生理状态等... 在降温过程中,对细胞造成伤害甚至促使细胞 死亡的原因是多方面的;水的结晶除了对细胞造成 机械损伤之外,也会使细胞内溶质分子接近,浓度增 加,pH值发生变化,破坏植物的正常生理活动,从 而造成溶液效应损伤;除此之外,脱水会对细胞膜造 成伤害,影响细胞的渗透平衡.因此,选择合 适的超低温保存方法及最佳的超低温保存条件,把 对细胞的伤害减小到最低,就显得尤为重要. 低温保护剂的使用会对冷冻材料产生有利效 果..二甲基亚砜(DMS())是迄今广泛采用的 一 种低温保护剂,它的作用机理是使开始结冰的温 度降低,终止结冰的温度也降低,到达细胞内外水汽 压力平衡所需的时间延长,这些作用与DMS()浓度 成正比,然而,DMSO有一定的毒性,还有可能引起 基因的遗传变异,因此,实际采用的浓度通常为5 ,l5E'.而且采用复合低温保护剂效果会更 好.即使如此,经冻存的材料还是会不可避免地受 到不同程度的伤害. 参考文献: [1]吴征镒.中国植物志(第34卷第一分册)[M].北京:科学出版社,1984:181. 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