孤儿受体TR3与人CNTF受体基因中顺式元件作用机制的研究

孤儿受体TR3与人CNTF受体基因中顺式元件作用机制的研究 114, 15 第 14 卷 第 5 期V o lN o 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报 1998 年 10 月 . 1998O c t C h in e se Jo u rn a l o f B io ch em ist ry an d M o lecu la r B io lo gy 孤儿受体 与人 受体基因 3 TRCNTF 3 中顺式元件作用机制的研究 穆小民刘以训 ( ) 中国科学院动物研究所, 生殖生物学国家重点实验室, 北京 100080 () 张传祥 C h aw n sh an g C h an g ( ) 美国威斯康辛大学癌症研究中心 摘要应用两对人工合成的寡核苷酸引物, 分别通过 扩增, 得到了 25 PCR CN T FR ΑIN BR E 序列两侧的两个扩增片段, 将其和在 V 位点切开的 一起定向连接, 得到了插入 7 E coR p T b lu e 在 的 V 位点的缺失了 序列的 然后再将其切下, 插入到具 7 25, p T b lu e E coR N BR E CN T FR ΑI 有 起动子的 基因达载体的 位点, 构建了 报道基因. 细胞转染和 40 ?SV CA T B g lCA T CA T 实验表明, 缺失 N BR E 后, CN T FR Α2I5 仍具有增强子功能, T R 3 通过该增强子对 CN T FR Α的 表达具有诱导作用, 说明这种诱导作用并不是单一通过 序列进行的.N BR E 关键词: 孤儿受体 睫状神经营养因子受体, 报道基因, 表达调控3, T R M echan ism of the In tera c t ion be tween O rphan Recep tor 3 -TRan d c is A c t in g E lem en t in CNTFRΑ Gen e 22M u X iao M in L iu Y iX u n (), , , 100080S ta te K ey L abora tory of R ep rod u ctiv e B iology I nstitu te of Z oology C h inese A cad em y of S cienceB eij ing C h aw n sh an g C h an g (), , 53792, C om p reh ensiv e C ancer C en terU n iv ersity of W isconsinM ad ison W isconsin U S A () . A bstra c t C ilia ry n eu ro t rop h ic fac to r CN T F is a m em b e r o f th e cy to k in e sup e rfam ilyIt . p lay s a ve ry im po r tan t ro le in th e deve lopm en t an d regen e ra t io n o f th e n e rvo u s sy stem 22CN T F u t ilize s a th reecom po n en t recep to r sy stem m a in ly co n sist in g o f a CN T F sp ec if ic b in d2 . , in g p ro te in k now n a s CN T FR ΑO rp h an recep to r s is a ca tego ry o f recep to r s w h ich co gn a te () . 3 2, 77ligan d is st ill u n k now n an d b e lo n g s to n u c lea r recep to r sup e rfam ilyT R N GF IB N u r . 3 is o n e o f m o st im po r tan t o rp h an recep to r s fo u n d so fa rIt h a s b een k now n th a t T R h a s im 2 . po r tan t fu n c t io n s in regu la t in g som e p h y sio lo g ica l p ro ce sse s in v iv oIn o rde r to in ve st iga te 3 2, th e in te rac t io n b e tw een T R an d c isac t in g e lem en t s in CN T FR Αgen eth e N BR E sequ en ce o f 25 2 . CN T FR ΑIw a s de le ted b y PCR u sin g p a ir s o f syn th e sized o ligo n u c leo t ide p r im e r sT h e re2 su lt in g tw o PCR f ragm en t s in th e f lan k o f th e N BR E sequ en ce w e re liga ted an d c lo n ed in V 27 ?, E coR site o f p T b lu e vec to r an d th en in B g lsite o f pCA T p rom o te r vec to rso repo r te r ( ) () 3 国家攀登预选项目, 国家自然科学基金 39770290, 中国科学院“九五”基础性研究重点项目 KJ 9522J 2603和自然 1( ) 科学基金国际合作与交流项目 39660111050资助 收稿日期: 1997204214, 修回日期: 1997206219 ( ) gen e s w ith N BR E 2de le ted CN T FR Α2I5 CN T FR Α2I52N BR E - ] in se r t in g in to pCA T 2p ro 2 m o to r vec to r a t up st ream site s re la t ive to th e CA T gen e w ith th e o r ien ta t io n th e sam e o r op 2 . po site to CA T exp re ssio n w e re co n st ru c tedT h e ce ll t ran sfec t io n an d repo r te r gen e a ssay u s2 ) (in g ch lo ram p h en ico l ace ty lt ran sfe ra se dem o n st ra ted th a t CN T FR Α2I52N BR E - st ill h ad an 3 2. en h an ce r ac t iv ity w h ich co u ld b e in du ced b y T R in a do sedep en den t m an n e rIt show s th a t 3 th e in du c t io n o f CN T FR Αgen e exp re ssio n b y o rp h an recep to r T R is no t com p le te ly th ro u gh , 225 .N BR E sitean d o th e r N BR E lik e sequ en ce s in CN T FR ΑIm ay a lso p lay som e ro le s : 3, , , Key word sO rp h an recep to r T R CN T FR ΑR epo r te r gen eE xp re ssio n an d R egu la t io n () 睫状神经营养因子 , 是细胞分裂素家族的一个成员, c ilia ry n eu ro t rop h ic fac to rCN T F 它在神经系统的发育和损伤修复过程中具有重要作用, 是目前在帕金森病治疗中能有效地保 1 护运动神经元退化的重要神经营养因子. 的受体由三个亚基构成. 一个亚基是位于细CN T F 2 胞表面的 CN T F 结合蛋白, 称为 CN T FR Α. 另两个亚基为信号传导 Β—亚单位, 称为 gp 130 3, 4 序列和 . 这两个亚基由 和其它细胞分裂素所共有. 在 基因的 L IFR ΒCN T F CN T FR ΑDN A (() ) 中, 在其第 5 个内含子 中有一个典型的孤儿受体 3 的应答 25CN T FR ΑIo rp h an recep to rT R 5 ( ) ( ) 元 件 其序列为 及数个类似序列. 孤儿受体 3re spo n se e lem en tN BR E A A A GGT CA T R 6 是目前发现的一种未知其配体的重要核受体, 它在某些重要的生理过程中发挥调控作用. 我 们的研究表明, 3 对 , 为了研究 对 基因的表达具有诱导作用3 基因T R CN T FR ΑT R CN T FR Α 表达的调控机理, 我们通过 扩增缺失了 的 序列, 并将其插入具有启 25 PCR CN T FR ΑIN BR E ) (动子的 氯霉素乙酰基转移酶基因载体的 ? 位点, 构建了 基因. 细胞转染 CA T B g l CA T 和 实验表明 具有增强子功能, 3 通过该增强子对 25 的表达仍具 CA T CN T FR ΑIT R CN T FR Α有诱导作用, 这种诱导作用并不是单纯通过 序列进行的.N BR E 1 材料与方法 111 主要试剂和材料 11111 菌种 大肠杆菌 . 109, 5由本实验室自备JM D H Α 11112 限制性内切酶, 4 连接酶, 4 聚合酶, 碱性磷酸酶, 酶和其它工 T DN A T DN A K lenow 具酶购自 和 公司, 22购自 公司, N ew E n g lan d B io lab P rom ega pCA T p rom o to rvec to r P rom ega 7质粒购自 公司. 其余试剂购自 和 公司.p T b lu e S t ra tagen e S igm a A ld r ich 112 方法 11211 扩增: 起始 94? 2 , 然后变性 95? 1 , 退火 50? 1 , 延长 72? 1 ,PCR m in m in m in m in 共 40 个循环. 11212 连接, 转化和克隆 均按文献7 方法进行. 11213 序列分析: 采用 公司的 序列分析系统.P a t io n a l D iagno st ic s Sequ age l 11214 细胞培养、转染和 实验 将 细胞接种到含补充 5% 小牛血清的 ƒCA T CHO DM EM 5 培养液的 60 培养皿中, 使其起始细胞密度为 115×10, 培养约 16 , 用磷酸钙沉淀 12 F mm h 8 法转染构建的报道基因质粒, 培养 48 , 收获细胞, 用反复冻融法破碎, 取上清液, 以半乳糖 h 14 进行 反应, 用乙酸乙酯抽提反应底物2氯霉素 苷酶活力校正转化效率, 按文献方法 9CA T C 14和反应产物2乙酰氯霉素, 抽干, 溶于 15 乙酸乙酯, 点于硅胶板上, 在层析缸内层析 15 C Λl , 将硅胶板风干, 压在 夹内约 10 , 在 机上显示结果, 定量 m in P ho sp ho im age r h P ho sp ho im age r 分析, 实验值为 3 次独立实验的平均值?差. 2 结果与讨论 - 的序列5 CNTFRΑI 211 ) ( 以 和 下述为引物, 通过 扩增克隆了人 片段, 其序列如 在1 4 25 . 1. P P PCR CN T FR ΑIF ig 这个约 276的较短的内含子中, 有一个典型的 的应答元件 其序列为 3 , bp T R N BR E A A A G2还有数个与 的应答元件类似的 序列, 其中一个是 21 结构, 其序列 . 3 GT CAT R A GGT CA D R 为 两 个 之 间 隔 一 个 核 苷 酸; 一 个 是 2结 构, 其 序 列 为 在 ; A GGT CA T R E lik e CC GGGT CA 序列上游 30 个核苷酸处有一段 序列, 下游 20 个核苷酸处有一段 N BR E A GGGCA GGGT CA 序列. . 1 25F igT h e nuc leo t ide sequence o f CN T FR ΑI 221 . 2T R E lik e D R and N BR E sequence s a re a s ind ica ted and unde r linedT h e o th e r A GGT CA lik e sequence s a re a lso . unde r linedT h e com p lem en ta ry st rand s o f a ll th e se sequence s a re g iven 212 - 序列的缺失 5 CNTFRΑINBRE ( ) ( ) 按 照 的 序 列, 人 工 合 成 了 4 个 寡 核 苷 酸 引 物, 引 物 1 1和 4 4位 于25 CN T FR ΑIP P 的侧翼编码区, 序列为:25 CN T FR ΑI 1: 5′223′P CA CC T T CA A T GT GA C T GT GC ′223′4: 5P GT GCA T GTA GC GA A T GT GGC () () 引物 2 2和 3 3分别位于 的 序列的两侧, 序列为: 25 P P CN T FR ΑIN BR E 2: 5′223′P GGA T CCCA A GGCA GGGC T GGGG I 位点 B am H ′223′3: 5P GGA T CC T CA A CC T C T GCCCCA CCC I 位点 B am H 缺失实验的设计如 . 2.F igA 通过扩增, 得到两个大小为 130 和 140 的 的 序列两侧的两个25 bp bp CN T FR ΑIN BR E 片段, 为片段 1 和片段 2, 见 . 3.DN A F ig ) ( 213 缺失 序列的 - - - 的亚克隆5NBRE CNTFRΑINBRE 将两个扩增产物用低溶点琼脂糖方法回收, 酶切, 酚氯仿抽提, 乙醇沉淀, 溶于I ƒB am H ) ( 后和质粒在V 位点切开一起用连接酶连接, 转化. ,745T E p T b lu e E co R T DN A Ecol i D H Α 经蓝白斑筛选转化子, 小量提取质粒, 用和双酶切鉴定, 结果3、6 和7 号克隆切I I E coR P st . 2 25 F igT h e st ra tegy o f de le t ing N BR E f rom CN T FR ΑIby PCR and th e co n st ruc t io n o f repo r te r gene ()( ) ; 2A D e le t ing N BR E by PCR T h e co n st ruc t io n o f CA T repo r te r gene . 3 2% F igA ga ro se ge l e lec t rop ho re sis ana ly sis o f PCR am 2 p lif ied p ro duc t s 11ΚDN A 2H ind , M a rk e r 21PCR p ro duc t o f f ragm en t 1 31PCR p ro duc t o f f ragm en t 2 () 出 270 的和 大小相同的插入片段 . 4, 其中 3 号克隆用 切出一 25 I bp CN T FR ΑIF igA B am H 条和 扩增产物相同的约 140 的带, 说明该克隆插入片段中原设计的 I 位点完 PCR bp B am H ()整 . 4.F igB 214 报道基因构建CA T 为 报道基因构建的实验设计图, 按设计的路线, 将缺失了 序列的. 2F igB CA T N BR E 片段插入 启动子下游 真核表达载体的 位点, 小量提取质25 40 ?CN T FR ΑIDN A SV pCA T B g l 粒, 酶切鉴定. 由于该表达载体上有两个 位点, 相距 459 , 插入位点 在这两个 I ? E coR bp B g l 之间, 所以用 酶切鉴定, 结果 3、4、5、6、9、10、11、12 和 15 号克隆切出了约 730 I I E coR E coR () 的片段, 说明有约 270 的 2插入片段, 其它克隆则切出 459 的 25- bp bp CN T FR ΑIN BR E bp 片段, 说明没有插入, 见 . 5.F ig ( ) F ig. 4 D e te rm ina t io n o f recom b inan t c lo ne co n ta in ing p T 7b lue2CN T FR Α2I52N BR E - by E coR + P st and I I I B am H d ige st io n () ()I + I I A E coR P std ige st io nd ige st io nB B am H : 1 : 1 ak b ladde r ak b ladde r 1: - : 3, 6, 7, P la sm id vec to r co n t ro l bdrecom b inan t p la sm id 2—7: 2W h ite c lo ne se lec ted by X ga l and IP T G se lec t io n : 3 eC lo ne p la sm id co n t ro l 由于在 片段的 5′端 25 CN T FR ΑI 起 始 处 有 一 位 点, 所 以 用I A va 和 酶切鉴定上述克隆 I I E coR A va 中插入片段的方向. 按计算, 正接应 切出一条约 700 的大带和一个约bp 的 小 带, 反 接 应 切 出 一 条 约40 bp 200 和 500 的 带, . 6 表 示bp bp F ig ( ) 2报 道 25- CN T FR ΑIN BR E CA T 基因 和 双酶 切 的 鉴 I I E co R A va 2 pCA T F ig.D e te rm ina t io n o f recom b inan t c lo ne co n ta in ing 5 ( ) CN T FR Α2I52N BR E - by E coR d ige st io n I 定结果. a: 1 k b ladde r; 1—15: R ecom b inan t p la sm id s; 16: P la sm id co n t ro l 按上述 + 双酶切 I I E coR A va ( ) F ig. 6 D e te rm ina t io n o f liga t io n d irec t io n o f recom b inan t c lo ne co n ta in ing pCA T 2CN T FR Α2I52N BR E - by E coR I+ IA vad ige st io n : 1 ; : 3 ; —: ak b ladde rbR ecom b inan t p la sm id co n t ro lcqR ecom b inan t p la sm id () () 确定的外源插入片段的插入方向, 选择 3 号 正接和 5 号 反接克隆, 提取 进行序 , DN A 列分析, 表明 序列确实已经缺失, 而且连接方向和上述方法确定的一致. 这样就构建了 N BR E () () 2位于 基因 5′2端上游的报道基因, 225- 25- CN T FR ΑIN BR E CA T CN T FR ΑIN BR E DN A () ( ) 片段的方向和 基因的转录方向一致 正接的称为 225- 5+ ,CA T pCN T FR ΑIN BR E CA T e ) ( ) (2片 段 的 方 向 和 基 因 的 转 录 方 向 相 反 反 接的 称 为 25- CN T FR ΑIN BR E DN A CA T () . pCN T FR Α2I52N BR E - CA T e5- () 215 3 诱导的 - - 的增强子活力 5- TRCNTFRΑINBRE 为了证实 是否通过和 序列的单一作用来调控 , 分别将 3 基因的表达T R N BR E CN T FR Α ( ) 构建的含 2为 5′2顺式作用元件的报道基因和 表达质粒共转染25- 3 CN T FR ΑIN BR E T R ()细胞 根据 2结果, 该细胞不表达能检测到的 蛋白. 结果表明, 序列 3 CHO R T PCR T R N BR E 缺失后, 具有增强子活力, 3 通过该增强子仍对 . 25 的表达有诱导作用CN T FR ΑIT R CN T FR Α ( () 如 所示, 无论 2的插入方向和 基因的转录方向一致 3,. 7 25- F igCN T FR ΑIN BR E CA T lan e ) ( ) ( 4或者相反 9, 10, 3 可将报道基因中 基因的转录活力提高约 3 倍 3, 4, 9,lan e T R CA T lan e ) ( ) ( ) 10 , 而做为对照, 只转染无 2的 表达载体 1, 7或转染构建 25- CN T FR ΑIN BR E CA T lan e () ( ) 的含 2的 表达载体而不共转染 或共转染反义 25- 3 2, 83CN T FR ΑIN BR E CA T T R lan e T R ( ) 表达质粒 5, 6, 11, 12则基本不影响 基因的转录活力.lan e CA T ) ( F ig. 7 D o sage dep enden t induc t io n o f CA T ac t iv it ie s o f T R 3 v ia CN T FR Α2I52N BR E - ( ) V a r io u s repo r te r co n st ruc t s w itho u t lane 1, 7o r w ith exp re ssio n vec to r w e re t ran sfec ted in to CHO ce ll. T h e re2 ( ) ( ) ( )2—61, 725- 5+ 2po r te r co n st ruc t s fo r t ran sfec t io n w e re e ith e r pCA T p lane o r pCN T FR ΑIN BR E CA T elane ( ( ) )o r pCN T FR Α2I52N BR E - CA T e52lane 8—12. E xp re ssio n p la sm id s co t ran sfec ted inc lude: sen se T R 3 exp re s2 ( ) ( ) ( ) sio n p la sm id, 3 Λg lane 3, 9, 015 Λg lane 4, 10; o r an t isen se T R 3 exp re ssio n p la sm id, 3 Λg lane 5, 11, 015 Λg ( )6, 12. . lane C h lo ram p h en ico l co nve r sio n ra te s w e re cacu la ted f rom p ho sp ho Im age r quan t if iab le in ten sio n sFo ld in2 duc t io n w a s no rm a lized re la t ive to th e CA T ac t iv ity p ro duced by th e co n t ro l p la sm id pCA T p w itho u t th e co t ran s2 3 . fec t io n w ith T R exp re ssio n p la sm idD a te a re ave rage o f a t lea st th ree indep enden t exp e r im en t s w ith th e e r ro r ba r s rep re sen t standa rd dev ia t io n 10 序列是孤儿受体 的最主要的应答元件, 3 通过该元件对目前已知的多 3 N BR E T R T R 11 种基因的表达发挥调控作用. 除了 序列外, 3 也可和一些与 序列类似的以N BR E T R N BR E 12, 13 13 为 基 础 的 序 列 发 生 相 互 作 用, 并 对 其 所 在 基 因 的 表 达 起 调 控 作 用. 缺 失A GGT CA 的 序 列 后, 3 仍 对 . 表 明 对 25 的 表 达 有 一 定 诱 导 作 用3 CN T FR ΑIN BR E T R CN T FR Α T R 序列进行的, 在 上的另外几个表达的诱导作用并不是单纯通过 25 CN T FR ΑN BR E CN T FR ΑI 类似序列也起着一定的作用. A GGT CA Ref eren ce s 1 Send te r M , Schm a lb ruch H , S to ck li K A , C a r ro ll P , K reu tzbe rg W G, T ho enen H. C ilia ry neu ro t rop h ic fac to r p reven t s . , 1992, 358: : 502, 504degene ra t io n o f m o to r neu ro n s in m o u se m u tan t p ro g re ssive m o to r neu ro nop a th yN a tu re D av is S, A ld r ich T H , V a lenzue la, D M , W o ng V , F u r th M E , Squ in to S P , Yancopo u lo s. T h e recep to r fo r c ilia ry neu2 2 ro t rop h ic fac to r. S cience, 1991, 253: 59, 63 D av is S, A ld r ich T H , S tah l N , P an L , T aga T , K ish im o to T , Ip N Y, Yancopo u lo s G D. 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