第 12 章 核酸与核苷类药物.doc

第 12 章 核酸与核苷类药物.doc 第 12 章 核酸与核苷类药物 1998年4月，大连珍奥核酸科技发展有限公司在大连开发区建成一期工程。 珍奥核酸#说明#摘录 增强基因自我修复能力，显著改善脑机能，促进新陈代谢及细胞分裂，提高免疫力，美容养颜润肤。核酸具有抗病毒，抑肿瘤，抗衰老，健脑益智的功效。在临床实验中，令医学界十分惊奇的是:在糖尿病及并发症，肝脏疾病，高脂血症，脑血栓后遗症等心脑血管疾病，老年痴呆症，肢体震颤麻痹(帕金森氏病)，关节炎，白细胞减少症，神经系统疾病，性功能减退，肝肾受损等诸多方面，核酸都显现出独特的保健功效。 方舟子:“核酸营养是个商业大骗局” 中国“人类基因组”项目负责人杨焕明:“所谓核酸食品在营养价值上和米粉没有太大的差别” 州理工学院院长戴维?巴尔的摩(1975年诺贝尔医学奖):“据我所知，没有证据表明核酸是一种营养物或有益健康。在我看来它不可能有任何益处。” 第一节 概述 一、基本概念 核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基 天然的、类似物、衍生物及其聚合物 作用: 影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢 恢复正常代谢或干扰某些异常代谢 用途:放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病 核酸是一种多聚体大分子，它的组成是核苷酸，将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核苷，核苷进一步分解可生成戊糖和碱基。 嘌呤核苷酸 AMP GMP 嘧啶核苷酸的结构 核酸类药物分类——具有天然结构的核酸类物质 如:ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+) 、CoII(NADP+) 。 这类药物有助于改善物质代谢和能量平衡，修复受损组织，促使缺氧组织恢复正常生理机能。 临床上广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩等的治疗。 这些药物多数是生物体自身能够合成的物质，在具有一定临床功能的前提下，毒副作用小，它们的生产基本上都可以经微生物发酵或从生物资源中提取。 ATP:用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及动脉或冠状动脉硬化、肝炎等的治疗或辅助治疗。 肌苷:用于急慢性肝炎、肝硬化、白细胞减少、血小板减少等。 核酸类药物分类——自然结构核酸类物质的类似物和聚合物 它们是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。 主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。 它们大部分通过由自然结构的核酸类物质进行半合成为结构改造物，或者采用化学一酶合成法。 OOHNON OHNIHNCH3HNCF23 NNHOON ONOONHOHOHOOOO OHOHN3三氮唑核苷 OH5'- 碘脱氧尿苷叠氮 胸苷三氟 代 胸苷OHOHOH OHNNOH NNHNH NH NNNH2NNNHNHO OHOCHHO22NHN2NOOOHHNHO HOH2OOHCHN OH N 二、核苷酸的生产方法 无环鸟苷丙氧鸟苷双脱氧肌苷阿糖腺苷(一)酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸: 桔青霉产生5`-磷酸二脂酶; 红酵母产生3`-磷酸二脂酶 2、酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸(肌苷酸和鸟苷酸)3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5„—单核苷酸工艺 3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸(I，G) 呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为(I，G)，用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产(I十G)工艺 。 4(菌体自溶法生产核苷酸 磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5„-核苷酸。 (1)菌体自溶法生产核莆酸工艺流程: 5(碱水解法生产2,，3,-混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2,，3,-混合核苷酸。取RNA配成3,,3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol,L浓度，升温至38?，保温16,20小时，用6mol,L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3,-核苷酸的降解率达95,以上，将2′，3,-混合核苷酸制成每片含50,100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少 (二)发酵法生产核苷酸 1(发酵法生产肌苷酸(IMP) 2、发酵生产黄苷酸(XMP)及酶法转化成鸟苷酸 (三)半合成法制备核苷酸 由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。 例一:肌苷2mmol,L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0?，添加氯化氧磷6mmol,L，水2mmol,L，反应2h，5,-IMP摩尔产率达91,。 例二:鸟苷2mmol,L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0?，添加氯化氧磷6mmol,L，水2mmo/L，反应6h，5,-GMP摩尔产率达90%。 第二节 核酸类物质的生产 一、RNA的提取与制备 1. RNA的工业来源 从微生物中提取RNA，是工业上最实际和有效的方法，一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源。通常在细菌中RNA占5,-25,，在酵母中占2.7,,15,，在霉菌中占0.7%~28%, 面包酵母含RNA4.1,,7.2,。 2. 高RNA含量酵母菌体的筛选 酵母菌体收率高，易于提取RNA 。 可以从自然界筛选并可用诱变育种的方法提高酵母的RNA含量。 发酵法生产高含量RNA酵母及其RNA提取工艺流程见图 2.RNA提取实例 二、DNA的提取与制备 DNA，可以促进细胞的活化，调节新陈代谢，延缓机体衰老，维护正常免疫功能有积极的作用。 1(工业用DNA的提取 从冷冻鱼精中提取。鱼精中主要含有核蛋白、酶类以及多种微量元素。核蛋白的主要成分是脱氧核糖核酸(DNA)和碱性蛋白质(鱼精蛋白)，其中DNA 占大约2,3。 2(具有生物活性DNA的制备 可从动物内脏(肝、脾、胸腺)中提取制备，操作条件0,3?。 动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5,十二烷基磺酸钠，并搅拌2,3小时，在0 ?2500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷乙醇，离心即可得纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。 三、核苷类药物的制备 核苷是多种核苷类药物的原料，这些药物通常是生物自身能够合成的组成遗传物质的结构类似物，目前已用于临床的此类药物有几十种 另外，核苷的发酵法生产水平大大高于同类结构核苷酸的发酵水平，因此肌苷酸钠，鸟苷酸钠可分别由肌苷和鸟苷经化学磷酸化方法合成，ATP由腺苷酯法合成。 发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点: ?它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株; ?它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌; ?它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。 在右边的合成途径中，嘌呤核苷酸生物合成的第一个酶PRPP转酰胺酶受AMP、ADP、以及腺嘌呤衍生物的强烈抑制而受鸟嘌呤衍生物的抑制很弱。IMP脱氢酶受最终产物GMP及鸟嘌呤衍生物反馈抑制，SAMP合成酶受AMP反馈抑制的。 枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型，当培养基中提供限量腺嘌呤时就累积肌苷。 而枯草杆菌的腺嘌呤、黄嘌呤缺陷型，当培养基中提供限量鸟嘌呤时就累积腺苷。 ATP GTP ADP GDP GMPAMP GMP合成酶 GMPAMPSAMP裂解酶 脱氨还原 酶 酶 SAMPIMP脱IMPXMPSAM合成酶 氢酶 P AICAR SAICAR PRP P PRPP 生产菌株: (1)酶6、7缺失(为腺嘌呤缺陷型)积累IMP---肌 苷(肝炎辅助药); (2)酶4缺失(为鸟嘌呤缺陷型)积累XMP---黄苷; (3)酶5缺失积累鸟苷。 对5 ’ -IMP的生物合成来说，关键的酶是PRPP转酰胺酶，利用 产氨短杆菌直接发酵法 生产肌苷酸的关键: ?使用腺嘌呤缺陷型菌株。 ?提供亚适量腺嘌呤从而解除了对PRPP转酰胺酶的活性影响。 ?选育Mn2+不敏感性变异株 ?菌本身的5 ' -核苷酸降解酶活力低 (一)发酵法生产肌苷(I或Iou) 肌苷生产菌(AJ11102)遗传性状: ?腺嘌呤缺陷型(A-); ?GMP还原酶缺失(GMPred-); ?磺胺脒抗性(SGr); ?精氨酸缺陷型(Arg-)。 选育出从遗传上解除正常代谢控制的理想菌株。肌苷产率达20g/L. 发酵法生产肌苷 (1)肌苷生产工艺 (2)发酵工艺条件: 碳源为葡萄糖 保证充足的氮源 磷酸盐的影响 Mg+、Ca+有促进作用 生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量 最适发酵温度为30--34?，pH6.0—6.2 需大风量,高溶氧和低CO2 (二)聚肌胞苷酸(聚肌胞)(Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1:C) 1、结构与性质 1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85,氯化钠溶液。 2、生产工艺 70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下: 1)底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备 2)固定化多核苷酸磷酸化酶的制备 (3)固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。 3)Poly I:C制备 (1)底物预处理:CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。 (2)酶促反应: (每毫升反应液含μmol,L数)IDP或 CDP 15;Tris 150;MgC126; EDTA 1;聚合酶5单位，pH9.0，37?，3,4小时。用盐酸调pH1.5,2.0，使PolyI(或Poly C)沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly I与Poly C混合，生成产品 。 3、作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。 临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患。