HBME3和CD44v6在甲状腺泡癌与不典型腺瘤中的表达

HBME3和CD44v6在甲状腺泡癌与不典型腺瘤中的达 新疆医科大学 硕士学位论文HBME-1、Galectin-3和CD44v6在甲状腺滤泡癌与不典 型腺瘤中 的表达及意义 姓名:任俊奇 申请学位级别:硕士 专业:病理学与病理 生理学 指导教师:尼加提热合木 2010-04 摘 要HBME-1、Galectin-3 和 CD44v6 在甲状腺滤泡癌与不典 型腺瘤中的表达及意义 研究生:任俊奇 导师:尼加提?热 合木 教授 摘 要 目的:探讨 HBME-1 human bone marrow endothelial cell-1) Galectin-3 和 CD44v6 ( 、在甲状腺滤泡癌(follicular thyroid carcinoma，FTC与 不典型腺瘤(atypical thyroidadenoma，ATA中的表达差异，其表达强度与表达 分布特性，寻找有助于二者临床病理诊断的肿瘤标记物及试探索其部分发病机制， 拟解决在甲状腺临床病理中对良恶性难以确定的滤泡性肿瘤的准确判定、试解释其 生物学特性及其相互间关系，以及对其预后的预示作用。方法:应用免疫组织化学 SP 三步法检测 HBME-1、Galectin-3 和 CD44v6 在 37 例甲状腺滤泡癌、18 例甲 状腺不典型腺瘤、10 例甲状腺嗜酸性腺瘤oncocytic thyroid adenoma，OTA、8 例普 通甲状腺腺瘤follicular thyroidadenoma，FTA、7 例甲状腺乳头状癌papillary thyroid carcinoma，PTC中的表达，以肿瘤旁非癌腺体组织和 5 例尸检正常甲状腺组织作为 对照。结果:HBME-1、Galectin-3 及 CD44v6 在 FTC 中的阳性表达率分别为 70.3、 64.9和 62.2， ATA 在中阳性表达率分别为 66.7、61.1和 61.1，三者在 FTC 与 ATA 中的表达差异性均无统计学意义(χ2 分别为 0.074、0.094、0.245，P 值分别 为 0.786、0.759、0.62， 8P 值均,0.05)在 10 例 OTA 中的表达均为 100， 例 8，756,8及 504,8，7 例 PTC 的表达分别为 FTA 中的表达分别为 37.53 ;, 1007,7，85.716,7及 1007,7，5 例正常尸检甲状腺组织均无表达。结论:HBME-1、 Galectin-3 和CD44v6 对 FTC 与 ATA 的临床病理鉴别诊断均无统计学意义，但提 示此三者标记物可能在甲状腺滤泡癌与不典型腺瘤的发病机制及进展过程中起着某 种部分共同机制。由于此三种标记物已被证实在诸多肿瘤的发生、发展过程中起着 重要作用，本实验中也证实在癌中高表达，故在实际工作甲状腺临床病理诊断中对 表达此三种标记物的良、恶性难以确定的滤泡性甲状腺肿瘤则可能提示其恶性程度 增高，?赡芫哂幸欢ǔ潭惹窒 裕 」懿蛔阋哉锒衔 ? 杂 忧克娣谩,泄?FTC 与 ATA 的临床病理诊断、鉴别诊断及发生发展机制尚有待于进一步探索和研究。关 键词:甲状腺滤泡癌;甲状腺不典型腺瘤;HBME-1;Galectin-3;CD44v6 —1— 新 疆医科大学医学硕士学位论文The expression and significance of HBME-1、 Galectin-3and CD44v6 in follicular thyroid carcinoma and atypical adenoma Postgraduate: Ren Junqi Supervisor: Prof. Nijati Rehemu Abstract Objective:To investigate the immunohistochemical expression of HBME-1(humanbone marrow endothelial cell-1 ) Galectin-3 and CD44v6 in follicular thyroid 、carcinomaFTC and atypical thyroid adenomaATA，finding out the useful markers forits clinicopathological diagnosis and part of its pathogenesis，resolving the dilemmas in in thediagnosis of thyroid follicular tumors. Methods:SP immunohistochemical technique wasapplied to detect the expression of HBME-1、Galectin-3 and CD44v6 in 37 FTC and 18 10 8 7ATA， oncocytic thyroid adenomaOTA、 general follicular adenomaFTA、 papillarthyroid carcinomaPTC and 5 normal thyroid from autopsy were to be used as controlgroups. Results:The expression of HBME-1，Galectin-3 and CD44v6 were 70.3、 64.9 and 62.2 in FTC，were 66.7、61.1 and 61.1 in ATA，respectively. Thesethree markers has no statistically significance defferences in FTC and ATAχ2 and P valuewere 0.074 and 0.786，0.094 and 0.759，0.245 and 0.62，respectively. In control groupsthe expression of HBME-1Galectin-3 and CD44v6 were all middle to strong positive incytoplasm in OTA，were 37.53,8、756,8 and 504,8 in FTA，were 1007,7、85.716,7 and 1007 ,7 in PTC and all negative in 5 normal thyroid fromautopsy. Conclusions:HBME-1、 Galectin-3 and CD44v6 have no significance in thedifferential diagnosis in FTC and ATA，but the positive of these three markers in ATAmay be hint more biological aggressivelythrere may be coexist some pathogenesis andprogression in FTC and ATA.These three markers had proofed to participated thepathogenesis and progression in many tumorssoif there meet such cases which expressesone of these three markers in thyroid follicular tumorsalthough we cannot diagnose ascarcinomait also need to pay more attension and follow up closely. There also need morestudies to the diagnosis、 differential diagnosis and pathogenesis in FTC and ATA.Key words: follicular carcinoma atypical adenoma HBME-1 Galectin-3 CD44v6 —2— 中英文缩略词对照表英文缩写 英文全名 中文译名 Papillary thyroid PTC 甲状腺乳头状癌 carcinoma Follicular thyroid FTC 甲状腺滤泡癌 carcinoma Atypical thyroid ATA 甲状腺不典型腺瘤 adenoma Follicular thyroid FTA 甲状腺滤泡性腺瘤 adenoma Oncocytic thyroid OTA 甲状腺嗜酸性腺瘤 adenoma follicular tumor of 恶性潜能未定可疑包膜侵犯FT-UMP uncertain malignant 而缺乏乳头状癌核特征的滤 potential 泡性甲状腺肿瘤 NT Normal thyroid tissues 正常甲状腺组织 论文独创性说明 本人申明所呈交的学位论 文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了 文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。学位论文作者签名: 签字日期:导师签名: 签字日期: 关于论文 使用授权的说明 本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，(选择“同 意/不同意”)以下事项: 1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文; 2.学校有权 将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊光盘版电子杂志社”用于出版和编 入 CNKI《中国知识资源总库》或其他同类数据库，传播本学位论文的全部或部分 。学位论文作者签名: 签字日期:导师签名: 签字日期: 前 言 前 言 甲状 腺癌Carcinoma of thyroid占人类所有癌的 1，代表了内分泌系统最常见的恶性病变， 对病理学家、外科医生及肿瘤学家们提出了不容忽视的挑战。近年来，甲状腺癌的 发病率在逐年上升，每 10 万人口中年龄化的发病率男性在 0.8,5.0岁之间变 动，女性在 1.9,19.4 岁之间变动1，据估计全球每年新发病例 122000 例2。新疆 维吾尔自治区属内陆地区，是我国甲状腺疾病的高发地区，流行病学统计研究发现， 新疆维吾尔自治区甲状腺疾病尤以居住在南，北疆干早地区(碘缺乏)的少数民族 人群最为多见。碘缺乏所致的地方性结节性甲状腺肿在维吾尔族人群中发病率最高， 同时，甲状腺良性肿瘤和恶性肿瘤的发病率也很高。地方性结节性甲状腺可导致或/ 和伴随甲状腺滤泡腺瘤(Follicular Thyroid Adenoma，FTA)、甲状腺乳头状癌 (Papillary Thyroid Carcinoma PTC)以及甲状腺滤泡癌(Follicular ThyroidCarcinoma，FTC)。 传统上将甲状腺癌分为乳头状癌、滤泡癌、髓样癌和 未分化癌，主要是基于组织形态学和临床特征，并有分子遗传学研究新进展的强烈 支持3。90,95的甲状腺癌为滤泡上皮细胞起源，其中以甲状腺乳头状癌最为多见，其次为甲状腺滤泡癌。甲状腺乳头状癌占甲状腺恶性肿瘤的 60,80，被定义为恶性上皮性肿瘤显示滤泡细胞分化的形态和特征性胞核。甲状腺乳头状癌多见于年轻女性和青少年，生长缓慢、局部以淋巴结转移较早、恶性程度低、易钙化及预后好为其特性，且可以隐匿性癌及瘢痕癌的形式存在。其组织形态学特征为:大体:多为 1,2cm 的圆形肿块，无包膜，少数有完整的包膜，以后逐渐向周围浸润。切面灰色或灰棕色，质地中等偏硬，颗粒状，触之有砂砾感。镜下:癌细胞围绕纤维结缔组织中心轴，呈乳头状排列，乳头分枝较多;癌细胞立方形或矮柱状，其特点是核染色质少，核呈透明状或毛玻璃样，核沟、核内包涵体、核重叠以及吸收空泡、砂粒体、钙化为诊断的主要依据。甲状腺乳头状癌发现时约 30已有颈部淋巴结转移4，有时，先发现转移灶而后确认原发灶，有的原发病灶甚至小到难以觉察的程度，但经血道的远隔转移较少见。另外，癌组织间及癌旁组织内常伴随有淋巴细胞的浸润以及增殖性反应，甲状腺乳头状癌 10 年存活率达 95以上。 甲状腺滤泡癌占甲状腺恶性 ,255，但自滤泡型乳头状癌从滤泡癌中分出去后，有报道发现滤泡癌的肿瘤的 20 诊断在逐年下降6。甲状腺滤泡癌被定义为显示滤泡细胞分化证据的恶性上皮性肿瘤，并缺少乳头状癌诊断性的核特征。其组织形态学特征为:大体:肿瘤灰白色，有的为结节状，有不完整的包膜，貌似腺瘤;有的广泛浸润于甲状腺内，进而侵犯气管壁、颈部血管、肌肉及喉返神经。镜下:见不同 —3— 新疆医科大学医学硕士学位论文分化程度的滤泡，分化良好者，滤泡小，滤泡形态完整，细胞异型性较低;分化不良者，滤泡少，滤泡形态不整，有的呈实性细胞巢，细胞异型性较明显，核分裂像多见。其病理学诊断依据主要依赖于确切的包膜侵犯、血管侵袭和/或远处转移，而不注重细胞形态学的改变。滤泡癌的组织学分类根据浸润范围分为微小浸润型滤泡癌和广泛浸润型滤泡癌，根据组织学分化程度分为高分化滤泡癌和低分化滤泡癌，除上述类型外滤泡癌还包括一些有特殊细胞学特征的亚型，如嗜酸细胞性滤泡癌和透明细胞滤泡癌。甲状腺滤泡癌多发生于 40 岁以上的女性，属低度恶性的癌，与乳头状癌相比，滤泡癌所属淋巴结的转移率较高(6,30)，且易于发生血管侵袭和肺及骨的远处转移。癌组织间及癌旁组织内多无淋巴细胞的浸润及增殖性反应，原发病灶切除后 5 年存活率为 30,40。 甲状腺“不典型腺瘤”thyroid atypical adenoma，ATA是WHO最近才被单独提出，以表示对其重视，是指具有以下特征的滤泡性肿瘤，即:富于细胞、核异型或不寻常的组织学形态(例如:梭形细胞巢)，而充分取材中不见血管和包膜侵犯7。Rosai与Ackerman提出，对一些难以确定恶性的病例，建议应用“恶性潜能未定的滤泡肿瘤”或“非典型性腺瘤”诊断名称8。不典型腺瘤主要有以下三种组织结构:1.实性腺泡状:细胞以多边形和长梭形为主，排列成团，常无滤泡腔形成，周围是毛细血管或少量纤维间质;2.小梁状:瘤细胞以梭形为主，排列成双行或多行，连接成不规则互相吻合的小梁状结构。周围是丰富的毛细血管;3.弥漫性:主要是多边形细胞排列成团并融合成弥漫状。可见核分裂象，但常无病理性核分裂，通常无坏死。间质常很少，一般不见水肿及炎细胞浸润。目前对于该肿瘤的生物学行为尚无定论，大多数文献报道不典型腺瘤属于良性肿瘤，也有文献提出不典型腺瘤不同于普通型腺瘤，而具有相似于滤泡癌的生物学性状，因而提出不典型腺瘤是滤泡性腺瘤与滤泡癌之间的交界性病变9。目前对于甲状腺不典型腺瘤的良、恶性尚难定夺，多数学者认为应加强术后随访。 甲状腺滤泡性腺瘤 指具有滤泡分化、包膜完整的良性肿瘤，最常见于 30,45 岁女性，多生长缓慢而无自觉症状。瘤细胞的形态及生长方式类似胚胎发育期或成熟期的甲状腺组织，腺瘤为单发性，圆形或卵圆形，包膜薄而完整，表面光滑，大小自数毫米到 8cm 不等，但多小于 3cm。根据组织学形态主要分为正常滤泡型、巨滤泡型、小滤泡型、小梁或实性型及嗜酸性细胞型等，各亚型间并无生物学行为及预后差异。嗜酸性细胞腺瘤又称 Hurthle 细胞腺瘤，单发，包膜完整，切面光泽较差，稍显黄褐色。镜下瘤细胞大，呈多边形，胞质丰富、颗粒状、嗜酸性，胞核较小、大小一致，深染，部分核呈固缩状，有的核大而畸形，有时亦可见核呈空泡状。瘤细胞排列呈小梁状、条索状、乳头状或腺泡状，少数呈滤泡状，其内很少或无胶质。目前 WHO 分类中将嗜酸性细胞腺瘤归类为良性肿瘤10，但有学者认为嗜酸性腺瘤 —4— 前 言具有比一般滤泡性腺瘤更加侵袭性的生物学行为，认为是一种潜在恶性肿瘤11。 良性和恶性甲状腺肿瘤的病理演变过程及形态学改变极其复杂，其生物学特性及临床预后与病理组织学类型有着密切的关系。与其他器官的肿瘤相比，甲状腺肿瘤的发展相对较缓慢且预后较好，但值得注意的是，有些甲状腺癌其原发病癌灶很小或“无”原发癌灶，但临床上却发现局部颈部淋巴结转移和肺组织、骨组织等远处转移病灶。甲状腺癌多起病隐匿、生物学特性多变，现有的影像学、免疫学、细胞学、甚至病理学诊断均存在一定的误诊率，尤其是术前细胞学及术中冰冻诊断的准确率还不理想。癌始终伴随并威胁着人类的健康，癌的病因学研究、发病机制学探索是预防与治疗癌的基础。随着科学技术的发展，基础医学研究领域在对肿瘤发生与演变以及病因学的探讨正处于从宏观认识向微观研究转变阶段。随着分子生物学工程技术的发展，甲状腺癌研究在分子水平上取得了很大的进步，不仅提出了分子生物学为基础的三步假说机制，而且与之相关的分子基础正逐渐得到阐明，包括细胞粘附分子、蛋白水解酶、运动因子及其受体等。这些分子的相互作用实现了癌细胞侵袭与转移的黏附、降解及运动过程，而这些表型归根到底是由众多基因调节和控制的。侵袭与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一，在肿瘤侵袭与转移这一复杂的动态演进过程中，涉及许多基因发生质和量的改变。抑癌基因的失活和癌基因的活化是导致肿瘤增殖失控、恶性生长、侵袭与转移的生物学基础。 筛选特异性强的分子生物标记物对肿瘤发生与演变的认识、肿瘤起源的判定、肿瘤亚型的分类、良恶性肿瘤的鉴别、肿瘤早期诊断、肿瘤细胞浸润与转移的证实以及预后判定等均可提供可行性依据与手段。研究与探讨甲状腺肿瘤病因学、发病规律以及良恶性肿瘤间的关联性对有效防治此类疾病有着重要理论与实际应用价值。本课题研究通过免疫组织化学技术对 HBME-1、Galectin-3 及 CD44v6 在 FTC 与ATA 中表达差异性的研究，以探讨和寻求对 FTC 与 ATA 的诊断及鉴别诊断意义的标记物及探索此三者抗原在 FTC 与 ATA 中的部分发病机制。 本课题主要检测的目标是:(1)HBME-1、Galectin-3 及 CD44v6 在 FTC 与 ATA (2)HBME-1、Galectin-3 及 CD44v6 分别在 FTC 中的中的表达特性及表达差异性;表达相关性;(3)HBME-1、Galectin-3 及 CD44v6 分别在 ATA 中的表达相关性。 —5— 新疆医科大学医学硕士学位论文 材料与方法1(材料1.1 标本来源 随机选取新疆维吾尔自治区人民医院病理科 1980 年至 2008 年及新疆医科大学第一附属医院病理科 2004 年至 2008 年间甲状腺手术标本 95 例。年龄最小者为 13岁，最大者为 72 岁，平均年龄为 47.3 岁。筛选出甲状腺滤泡癌为 37 例、甲状腺不典型腺瘤 18 例、甲状腺嗜酸性腺瘤 10 例、甲状腺普通型腺瘤 8 例、甲状腺乳头状癌 7 例及 5 例尸检正常甲状腺组织。以上标本均经两位副高职称以上病理专业人员复查临床和组织病理学诊断并证实。1.2 标本切片的制备(1)所有标本均经 10中性福尔马林固定，常规组织处理，石蜡包埋，载玻片均经 多聚赖氨酸处理后捞片放入 50?温箱过夜。(2)将洗净的载玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中，停留 20,30 秒钟， 取出稍停片刻，再放入蒸馏水中刷去未结合的 APES，在 60?烤箱中过夜晾干， 进行防脱处理。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的 存在。(3)用一次性刀片将蜡块均以 3m 厚度连续切片 5 张，捞片，在 60?烤箱过夜烘 干。(4)二甲苯脱腊、梯度酒精水化后，分别进行 HE 及 SP 免疫组化三步法染色，DAB 显色，苏木精复染，50?温水反蓝 20 分钟。1.3 试剂1.3.1 免疫组织化学试剂1.3.1.1 一抗 抗体名称 试剂公司 稀释比例 鼠抗人 HBME-1单克隆抗体 美国 Thermo 公司 1:40 兔抗人 Galectin-3多克隆抗体 北京中衫金桥生物技术有限公司 1:90 鼠抗人 CD44v6单克隆抗体 北京中衫金桥生物技术有限公司 1:301.3.1.2 免疫组织化学 SP-9002 HistostainTM-Plus Kits 免疫组化染色试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司提供的美国 ZYMED 公司 SP 系列试剂盒，全称 —6— 材料与方法过氧化物酶标记的链酶卵白素(Streptavidin/Peroxidase)染色试剂盒。由于链酶卵白素的分子量是 60kDa有四个亚基可与生物素结合，等电点为 6.5，所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点。 剂型:工作液 试剂盒内容: 试剂 (无 6ml 试剂 A(蓝色液体):封闭正常山羊血清工作液 色液体):3H2O2 去离子水 6ml 试剂 B(黄色液体):生物素化二抗工作液(IgG/Bio) 6ml 试剂 C(橙色液体):辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液(S-A/HRP)6ml 适用:一抗为兔抗或小鼠抗的免疫组化检测 储存:2-8?1.3.1.3 ZLI-9032 浓缩型 DAB 试剂盒内容物: A 瓶:浓缩缓冲液(20×) 3ml B 瓶:浓缩 DAB 溶液(20×) 3ml C 瓶:浓缩过氧化氢溶液(20×) 3ml DAB 工作液的配制: 在 1,1.5 毫升双蒸水(pH 约 7.0)中，加入一滴(约 50 微升)试剂 A(浓缩缓冲液)，混合均匀，然后将试剂 B 和试剂 C 各一滴加入其内，再次混匀。必要时可过滤此溶液。此溶液必须现用现配，配好后避光保存，30 分钟内使用，剩余的液体应弃去。标本显色时间一般为室温 3,10 分钟，请在显微镜下观察显色情况，显色充分后自来水终止反应。1.3.2 溶液配置1.3.2.1 PBS 缓冲液: Nacl 8.5g Kcl .