实验二、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法

实验二、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 ---- 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及 在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。 在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作 物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 [] 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或 浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长 下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含 量。 利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液 的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学达式为： A=Kbc 式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g?L -1时的吸光度）分别为82.04 和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液 在663nm和645nm处的吸光度（A和A）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（C、C663645a -1 、C，单位为g?L），的关系可分别用下列方程式表示： 十bab A=82.04C+9.27C （1） 663ab A=16.76C+45.60C （2） 645ab 解方程（1）和（2）得： C=12.7 A—2.59 A (3) a663645 C=22.9 A—4.67 A (4) b645663 C＝20.3 A—8.04 A (5) 十ab645663 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。 ）求得，其为： 652 A×1000 652在652nm处，叶绿素a和b的吸光系数相同，因此提取液中叶绿素的总浓度（a+b）也可通过 34.5 测定溶液在波长652nm处的吸光度（A C＝ （6） 十ab 式中：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。 但Inskeep等（1985）认为叶绿素a和b吸光系数相等时的波长位于吸收光谱斜率很陡的位 置上，因此仪器波长很小的偏差都可能导致很大的测定误差。 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C×V A×1000 叶绿素含量（mg?g -1-2或mg?dm）= （7） 式中：C为叶绿素浓度（mg?L-1-2）或mg?dm）；V为提取液总体积（ml）；A为取样鲜重（g） -2或取样面积（dm）。 [] 1植物绿色叶片。在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半叶和黄色 半叶为试材。 2(1) 分光光度计；（2）天平；(3) 研钵；(4) 滤纸；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。 [] 1用毛笔或毛刷清除叶片表面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取0.25dm -2的 叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。3 。注意取样时要避开大的叶脉。如果需要计算叶片干样叶绿素含 量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干，用于测定干重。 2向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许CaCO (中和酸性，防止叶绿素酯酶分3 解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止 3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也 要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。 3取厚度为lcm的洁净比色皿，，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒 入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（ ），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。 380%100% 4将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。 [] 1 植物名称： 种植地点： 发育时期： 试验处理： 植物的生长状况： 取样时间： 取样部位及数量： 2 3 年 月 日 时 分 至 时 分 4 5 表1 测定数据记录及计算结果 表1 测定数据记录及计算结果 2光密度 叶绿素含量 mg/g FW 或mg/dm C hChlaChla 666l+b +b cc 456a重复 hh公公523/ ll式式nnnc a b （5（6m m m h ） ） l b 1 绿 2 3 叶 平 均 值 标 准 差 1 黄 2 3 叶 平 均 值 标 准 差 6 [] （1）通过叶绿素含量测定你能够解决什么理论和实践问？ （2）说明叶绿素的生理意义以及叶绿素含量测定的重要性？ （3）请简述各种叶绿素含量测定方法的基本原理？比较各种方法的优缺点？ （4）为什么取样时避免打取主脉，样品中含有叶脉，对测定数据会产生什么样的影响？ （5）为什么叶绿素提取液用80%丙酮而不用100%的丙酮？ （6）在研磨提取叶绿素时为什么向研钵中加入少量石英砂和CaCO ？ 3 （7）在强光下提取叶绿素对测定结果会有什么样的影响？为什么？ （8）在用分光光度计测定叶绿素提取液的光密度时，为什么要用80%丙酮将仪器的透光率调到 100%？如果用蒸馏水调100%对测定数据会有什么影响？ （9）为什么在测定时需要洗净比色皿？洗净的比色皿在倒入提取液时为什么还要用提取液洗2-3遍？ （10）在使用分光光度计时，为什么每改变一次波长，就需要重新调零和调透光率100%？ （11）什么是吸光系数？在本实验中叶绿素的吸收系数的单位是什么？ （12）为使不同时间测定的数据具有可比性，你认为需要控制什么环境条件？为什么？ （1） 写出实验时间按排和操作流程图。 （13）写出光合速率测定和叶绿素含量测定实验的统一时间安排和实验流程图。 [] （1）叶片中的类胡萝卜素和花色素是否影响叶绿素含量测定？为什么？ （2）如果你不知道叶绿素的吸收系数，但有叶绿素的纯品，如何测定样品中的叶绿素含量？ （3）根据你所掌握的知识，如何提纯叶绿素？如何检验叶绿素的纯度？ （4）能否根据物品上的绿色残迹出植物的种类？为什么？ （5）如果实验室中没有我们通常用的厚度为1cm的比色杯，只有1.5cm的，若用其测定叶绿 素含量，在结果计算时需要用对计算公式做何种改变？ （6）比较你用波长652nm、波长645nm以及663nm测定的叶绿素总量，是否有差异？若 有差异分析其原因？ 植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测 定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切 相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研 究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种 的重要指标。 [原理] 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜 等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收， 用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶 液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： A=Kbc 式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g?L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g?L-1），的关系可分别用下列方程式表示： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 解方程（1）和（2）得： Ca=12.7 A663—2.59 A645 (3) Cb=22.9 A645—4.67 A663 (4) Ca十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。 在652nm处，叶绿素a和b的吸光系数相同，因此提取液中叶绿素的总浓度（a+b）也可通过测定溶液在波长652nm处的吸光度（A652）求得，其计算公式为： A652×1000 34.5 clear=all> Ca十b＝（6） 式中：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。 但Inskeep等（1985）认为叶绿素a和b吸光系数相等时的波长位于吸收光谱斜率 很陡的位置上，因此仪器波长很小的偏差都可能导致很大的测定误差。 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C×V A×1000 叶绿素含量（mg?g-1或mg?dm-2）= （7） 式中：C为叶绿素浓度（mg?L-1）或mg?dm-2）；V为提取液总体积（ml）；A为取样鲜重（g）或取样面积（dm-2）。 [材料、仪器、药品] 1．材料：植物绿色叶片。在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半 叶和黄色半叶为试材。 2．仪器：(1) 分光光度计；（2）天平；(3) 研钵；(4) 滤纸；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。 [方法] 1．取样：用毛笔或毛刷清除叶片表面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取 0.25dm-2的叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排放，故不设重复）。注意取样时要避开大的叶脉。 如果需要计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干，用于测定 干重。 2．研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。 3．读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先 用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分， 然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器 的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。 4．结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。 [实验结果记录] 1．实验材料： 植物名称： 种植地点： 发育时期： 试验处理： 植物的生长状况： 取样时间： 取样部位及数量： 2．测定地点： 3．测定时间： 年 月 日 时 分 至 时 分 4．测定条件记录： 5．数据记录及结果记载： 表1 测定数据记录及计算结果