纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定 1.纤维素酶活力单位定义 在37?,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u. 2.测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力. 3.试剂与溶液 除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水. 3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml: 称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml. 3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L: 吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml. 3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L: 称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml. 3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L: 称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml. 3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5: 称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v) 称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续 搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4?避光保存,有效期为3天. 3.7 DNS试剂 称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45?.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48?.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45?水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月. 4 仪器与设备 4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵. 4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目). 4.3 分析天平:感量0.001g. 4.4 pH计:精确至0.01. 4.5 磁力搅拌器:附加热功能. 4.6 电磁振荡器. 4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m. 4.8 离心机:2000g以上. 4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60?之间,精度为0.1?. 4.10 秒:每小时误差不超过5s. 4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围. 4.12 移掖器;精度为1l. 5 标准曲线的绘制 吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样. 分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液. 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml(做二个平行),分别加入到刻 度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值. 以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线. 6 试样溶液的制备 固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm). 称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4?条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间). 液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容. 7 测定步骤 吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37?平衡10min. 吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37?平衡10min. 吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37?平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37?保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB. 吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37?平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37?平衡),电磁振荡3s,37?精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE. 8.试样酶活力的计算 [(AE - AB)×K + CO] XD = × 1000 (1) M×t 式(1)中: XD — 试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml; AE — 酶反应液的吸光度; AB — 酶空白样的吸光度; K — 标准曲线的斜率; CO — 标准曲线的截距; M — 葡萄糖的分子量(180.2); t — 酶解反应时间,min; 1000 — 转化因子,1mmol = 1000 umol. XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度, 再进行分析测定. X = XD•Df (2) 式(2)中: X — 试样纤维素酶的活力,u/g; Df — 试样的总稀释倍数. 酶活力的计算值保留三位有效数字. 9 重复性 同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力 测定值(保留三位有效数字) 换成其他的酶的话，基本的一样，只是底物不一样而已～～～