香烟烟雾提取物诱导肺腺癌A549细胞相关分子改变的比较蛋白组学研究（可编辑）

香烟烟雾提取物诱导肺腺癌A549细胞相关分子改变的比较蛋白组学研究（可编辑） 香烟烟雾提取物诱导肺腺癌A549细胞相关分子改变的 比较蛋白组学研究 闵凌峰 作者姓名: 学科专业: 内科学 湘雅医院 学院系、所: 指导教师: 陈琼教授 答辩委员会主 论文答辩日期趁坠陋 中 南 大学年月 墟鬻嶝憎馕蔫翟叁露遵臻爹矽》嚣瞬?藩苫攀露糖耋够嚣转冬?秘攀矿鹫蓉 璧鬈季孬.包移 .气岁,..,《砖吼矿识:。。.,进静翟》‖?虹一豫秽黪蛮最. 、.“霉鳍‰磕移骚雳擎 一童飘静赫斟赛?静餐露麓;吩??霉虹毽势碰曩零燕。.好。.。。。 .一。?. 原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 吣 .? ? 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名: ?、’ 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名: 导师签名 日期:业年工月堡日\一 ? % 《 , 知湖 预 湖南省保健委重点课题吸烟相关性肺癌预警标志物筛选验 证编号一 ?博仁学位 户 研究目 ~,;毒‘ 仪限于 要的影 不吸烟 可作用 胞,造成肺癌细胞中基因结构及表达发生改变,这些基因表达的变化 势必影响肺癌细胞蛋白质组学的改变,从而进一步影响肺癌细胞的生 物学特性。已有的研究多集中在香烟烟雾造成肺癌患者单一或少数几 个基因表达的差异上,近几年蛋白质组学技术继续的发展为探索香烟 烟雾中有害物质诱导肺癌进展的分子机制提供了很好的技术平台,目 前香烟烟雾中有害物质诱导肺癌进展的蛋白组学变化的研究甚少。本 研究通过香烟烟雾提取物及其主要的致癌物苯并芘模拟吸烟体外处 理人肺腺癌细胞,应用蛋白质组学技术研究香烟烟雾及其致癌 物苯并芘诱导肺癌患者进展的分子机制。 第一章苯并芘诱导人肺腺癌细胞相关分子改变的比较蛋白质 组学研究研究方法: 使用.州、山、 州苯并芘,处理 细胞,检测各组细胞中的活性氧 , 水平及脂质过氧化 ,水平。应用二维凝胶电泳 分离处理组 . , .、对照组.的总蛋白质,图像分析识别差异博学位论文 中文摘要 表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 验证差异蛋白 ..鉴定差异蛋白质点, 以及 的表达。使用.州、州、州处理细胞后,应用 及.检测各组细胞中的表达,检测各组 细胞中总抗氧化活。生 、总活性 、过氧化氢酶活。生 ,、谷胱甘肽 还原酶活性 ,。 研究结果:研究发现 可以诱导细胞中活性氧水平 增高并导致脂质过氧化。采用一步抽提法制备.及 .细胞株的总蛋白质,应用双向凝胶电泳技术建立了重复 性和分辨率均较好的的双向凝胶电泳图谱。软件对两株细胞 蛋白质的双向电泳图谱进行了比较,识别了个差异表达的蛋白质 点。采用..对差异表达的蛋白质进行分析,获取 ..肽质量指纹图谱,数据库搜索鉴定了个差异表达 的蛋白质。 证实及 的表达水平在 处理组中较对照组明显下调,其结果与比较蛋白质组学研究的结果一 致;使用.州、州、州处理细胞后,发现随着 的表达及活性出现先诱导后 的浓度升高,虽然 抑制的现象,但及研活性的增高依然提高了机体的总抗氧化活 性。 研究结论:采用蛋白组学技术分析了香烟烟雾中的致癌物对人 肺腺癌细胞蛋白表达的影响,质谱鉴定了个差异表达蛋白, 博学位论文 中文摘要 其中及 有望成为监测香烟烟雾中氧化应激损 的表达及 伤的生物分子标志物;随着的浓度升高, 活性出现先诱导后抑制,而及的活性增高提高了机体的总抗 氧化活性,及在对抗带来的氧化损伤方面可能具有十 分重要的作用。 第二章香烟烟雾提取物诱导细胞相关分子改变的比较蛋白质 组学研究 研究方法:通过香烟烟雾提取物长期处理细胞周以模拟 肺癌患者继续吸烟的状态组,处理周后换用 不含香烟烟雾提取物的普通培养基继续培养周以模拟肺癌后戒烟 的状态组,同时使用一直用普通培养基培养的 细胞以模拟不吸烟肺癌患者的状态.组作为对照组。 提取上述三组细胞的总蛋白,采用蛋白质双向电泳技术和质谱技术分 离鉴定差异蛋白质,应用划痕实验及实验检测三组细胞的 及.验证部分差异蛋 转移侵袭能力的变化;应用 白的表达。 研究结果:本研究应用双向凝胶电泳技术建立了重复性和分辨率均较 好的组、组及其对照组?组 细胞的双向凝胶电泳图谱;软件对三株细胞蛋白质的双向电 泳图谱进行了比较,发现有种差异蛋白的表达在去除后周 组中恢复到了对照组?组的水平,而 剩余的种蛋白的表达在去除后周.组中并没 有恢复到对照组.组的水平。划痕实验及 中文摘要 博士学位论文 实验发现处理后的细胞.组侵袋及迁移 能力明显比对照组细胞增高,且经过脱毒处理周的 .组仍然高于对照组,这说明决定侵袋转移能力增高的差异 蛋白在脱毒处理后应该没有回复到对照组的水平。通过生物信息学分 析后,本研究选择.、.. 及这三种与肿瘤迁移 相关的差异蛋白继续研究。 及.证实作用 细胞周后及脱毒处理周后,的表达水平明显增高, 而.及.?表达水平明显下降。 研究结论:本研究采用蛋白质组学技术筛选到个香烟烟雾诱导 细胞差异表达的蛋白质,这些差异表达蛋白可能与香烟烟雾诱 导肺腺癌细胞转移潜能有关。其中.及.. 表达下降, 表达上升可能与香烟烟雾诱导细胞侵袭及迁移能力明 显增高有关。 第三章部分差异蛋白与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的关系 研究方法:采用免疫组化染色检测部分差异蛋白质、. 及..在例肺鳞癌及例肺腺癌组织中的表达,并分析 、.及..表达水平与临床病理特征和患者预后 的关系。 研究结果:实验显示患者吸烟严重程度与表达正相关,与 .及?.的表达负相关。表达与区域淋巴结转移 状况呈正相关,.?表达与区域淋巴结转移状况呈负相关, .表达与区域淋巴结转移状况呈负相关。.及.. 表达下调、表达上调的肺癌患者,生存率明礁下降。 博士学位论文 中文摘要 研究结论:、一及..与肺癌的吸烟程度、转移 和预后相关,有望成为预测吸烟的非小细胞肺癌患者转移及预后的分 子标志物及潜在的治疗靶标。 总结: 采用蛋白组学技术分析了香烟烟雾中的致癌物对人肺腺癌 细胞蛋白表达的影响,质谱鉴定了个差异表达蛋白, 及 有望成为监测香烟烟雾中氧化应激损伤的生物分子 标志物。 的表达及活性出现先诱导 随着的浓度升高, 后抑制,而及的活性增高提高了机体的总抗氧化活性, 及在对抗带来的氧化损伤方面可能具有十分重要的作用。 采用蛋白组学技术分析了香烟烟雾提取物长期处理及脱毒处理后 细胞蛋白表达的变化,鉴定了种差异表达蛋白,这些差异表 达蛋白可能与香烟烟雾诱导肺腺癌细胞转移潜能有关。其中一 及.. 表达下降,表达上升可能与香烟烟雾诱导 细胞侵袭及迁移能力明显增高有关。 、.及??与肺癌的吸烟程度、转移和预后相 关,有望成为预测吸烟的非小细胞肺癌患者转移及预后的分子标志物 及潜在的治疗靶标。 关键词香烟烟雾提取物,苯并芘,肺腺癌,蛋白质组学,转移潜能 相关机制 一 ; ,&一 . ,. , . .: 博士学位论文 英文摘要: .? .?. ,, . . ,出,, ? , , , . : .一 ? ,.?, ? ., ,一 ... 州 . ,,. : , ? ?《蕴雾 ? .. : : , , . 博士学位论文 英文摘要 ? , . , . ? ? ? ,? ? . ? . ? . :?, ? , ? ., , ?? / . , ? , ? . . ? ?. : . ? ?, . : :? , 博士学位论文 英文摘要 , . : ,一 , ..,一. ? , ? . : , ?. :,. , ,. . , :’ , 博士学位论文 中文摘要??. 英文摘要缩略词简表? 前言 日吾 第一章苯并芘诱导人肺腺癌细胞相关分子改变的比较蛋白质 组学研究 .材料与方法.结果? .讨论? .结论? 第二章香烟烟雾提取物诱导细胞相关分子改变的比较蛋白质 组学研究??.. .材料与方法?.. .结果? .讨论? .结论? 第三章部分差异蛋白与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的关系.材料与方 法? .结果? .讨论?目录 成果?. 博士学位论文 缩略词简表 缩略词 英文名称 一 ?? 牛血清白蛋白质 过氧化氢酶活性 锄。。卜 一一。锄。 丙基硫酸盐 一 一氰基羟基肉桂酸 ?一一 双蒸水 焦炭酸二乙酯 二硫苏糖醇 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 电喷雾质谱 ~ 谷胱甘肽还原酶活性 热休克蛋白质等电聚焦固相化梯度 ?? 千道尔顿 脂质过氧化? /基质辅助激光解吸/电离 从 ? 飞行时间质谱‘ 分子量 信使 博士学位论文 缩略词简表 质谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳 多环芳烃 多聚酶链式反应 ? 等电点 肽碎片指纹图谱肽质量指纹图谱 ? 苯甲基磺酰氟 “。?‘ 肽基脯氨酰顺反异构酶肽序列标签 翻译后修饰核糖核酸活性氧活性氧分子 十二烷基磺酸钠 ? 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳 ,,’,’一四甲基乙烯基二胺三氟乙酸??? 甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮 三羟甲基氨基甲烷电压伏小时 博仁学位论文 .?上一 刖 置 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,%的肺癌发生与吸烟有判?。吸烟是 公认的肺癌发生最主要的危险因素,香烟烟雾中存在许多有害物质,可以从 不同 层面导致肺癌的发生、发展。主要有香烟烟雾中最重要的致癌物苯并芘,每 只香 烟含有苯并芘约一,当它被吸入肺后经代谢活化为最终致癌物二氢二醇 环氧苯并芘,后者可与结合形成?加合物,并进一步 的引起的损伤;另外,吸烟的过程中町产生大量的氧自由基,一方面直 接损伤支气管和肺细胞成分,引起的损伤;另一方面与烟雾中的苯并芘等 有害物质协同引起多形核白细胞在肺和气管中聚集和活化,产生呼吸爆发, 释放 大量活性氧自由基,造成多种类型的氧化损伤。这些受损的如果得 不到有效修复,就会在复制过程中产生突变,随着突变的积累,最终促使肺癌发 生。 在例肺癌患者的临床研究中发现,吸烟相对于不吸及戒烟 的患者其风险比为.,并且在调整了吸烟所致并发症的影响后,其风险比依然 达到了.;在局限期的小细胞肺癌中发现,戒烟的患者中位生存期为 个月,五年生存率为.%,而继续吸烟的患者中位生存期降为.个月,五 年生存率仅为%;在期非小细胞肺癌的治疗过程中,继续吸烟患者出现第 二肺内原发肿瘤的几率明显高于不吸烟患者%:%;另外, 开展的前瞻性研究中第一次观察到在/期头颈部肿瘤患者的放疗过程中,正 在吸烟的患者较不吸烟及戒烟的患者的治疗效果更差,生存期更短,在/ 期的非小细胞肺癌化疗过程中,吸烟患者的化疗应答率降低继续吸烟:不吸烟 %:%,.【引;上述临床研究提示:吸烟不仅是能影响肺癌进展的 独立因素,而且能影响肺癌的治疗效果。我们在肺癌临床诊治中常常发现很多肺 癌患者在肺癌发生后至临床诊断前仍在吸烟,即便患者明确诊断后,仍有% 以上的患者继续吸烟【,癌变组织继续受香烟烟雾中有害物质如苯并芘等的持续 刺激而进展,且吸烟肺癌患者相对于非吸烟肺癌患者来说对治疗反应更差, 对这 一临床现象目前还很少有实验研究来阐述其机制。 吸烟与肺癌的既往研究主要集中在吸烟导致肺癌发生的分子机制上,香烟烟博七学位论文 雾中的苯并芘等致癌物能通过诱导等癌基因突变后激活以及等抑癌基 因突变后失活,诱导肺癌的发生【. ,我们前期也发现苯并芘可导致出现突 变而失活,且肺内注射苯并芘可诱导大鼠肺部肿瘤的发生成瘤率为.% 【。香烟烟雾中有害物质对肺癌患者进展及预后影响的分子机制方面目前研究较 少,已有的研究大多集中在香烟烟雾中有害物质造成机体单一或少数几个基因表 达的差异上。等发现苯并芘可诱导人肺腺癌细胞和的表 达,却没有观察到细胞出现凋亡,由此他们认为苯并芘町同时诱导 细胞中蛋白水解酶表达上调,使和降解,从而阻断了凋亡的信号通路【。 研究发现长期暴露于“苯并芘培养基中的细胞表现出更强的增 殖能力,随后的微阵列分析中发现个与细胞迁移、粘附或增殖有关的 基因表达水平出现了倍以上的表达差异【。苯并芘处理后的肺癌细胞 期阻滞作用消失,凋亡能力下降,且生长速度明显增快,推测肺癌细胞经 苯并芘处理后,其蛋白质的表达发生了改变,促进肺癌生长的蛋白质的表达上调, 抑制肺癌生长的蛋白质的表达下调【 。香烟烟雾中的多环芳烃物质可通过 激活 细胞中的..从而诱导.的表达,并可能进一步诱导肺腺癌细胞血管 生成能力的变化引。香烟烟雾也可诱导肺癌患者体内缺氧诱导因子.基因的表 达增高,并进一步在一定程度上造成肿瘤细胞迁移侵袭及血管新生能力增加【。 综上所述,我们有理由认为香烟烟雾中有害物质不但町作用支气管肺上皮细胞诱 导其癌变,而且还能通过继续刺激肺癌细胞,造成肺癌细胞中基因结构及表达发 生改变,这止匕基因表达的变化势必影响肺癌细胞蛋白质组学发生改变,并进一步 影响了肺癌细胞的生物学特性,这也是本课题设想的立论点。 近几年蛋白质组学技术的发展为探索肺癌蛋白组学提供了很好的技术平台。 蛋白质组学是以生命功能的执行者??蛋白质做为研究的主体,通过整体、定量 地、动态地分析细胞中蛋白质种类、表达水平和修饰的变化,从而对生命活动的 规律以及重要的生理与病理现象产生更深刻、更本质的理解,它克服了传统研究 方法中分割式小规模研究蛋白质的弊端,被认为是把基础医学研究与临床应用连 接起来的一座桥梁。等用肺鳞癌组织及癌旁组织对照研究建立了肺鳞癌差 异表达蛋白质数据库【, 等采用蛋白质组学技术建立了肺腺癌与正常肺 等用例肺肿瘤组织与 组织对比的差异表达蛋白质数据库【, 例正常肺组织对比分析获取了蛋白质的差异表达谱,并以此为基础探讨了用差异 博士学位论文 前言 表达蛋白质谱判断非小细胞肺癌预后的方法【,在寻找肺癌标志物方面, 等用蛋白组学方法筛选出.为肺癌患者中的癌抗原【; 被鉴定为人支气管上皮永生细胞恶性变的差异表达蛋白剧。针对于肺癌的防 治, 等证实牛樟菇 提取物能阻止肺腺癌细胞 的增殖,对比分析获取了个差异表达蛋白质与之相关。由此可见,肺癌蛋白 质组学分析将为肺癌的诊治提供关键性的信息。然而,香烟烟雾中有害物质诱 导肺癌进展的蛋白组学变化研究目前甚少。我们设想应用香烟烟雾中的有害物质 处理肺癌细胞,将诱导与肺癌进展相关蛋白质表达出现变化,如果采用蛋白质组 学技术对比分析,很有可能发现与香烟烟雾导致肺癌进展分子机制相关的这些差 异表达蛋白质。目前,国内外尚未见动态分析香烟烟雾及其有害物质作用于肺癌 细胞诱导蛋白质组差异表达的相关研究报道。 博士学位论文 第一章苯并芘诱导人 改变的比较 香烟烟雾中最重要的致癌物是苯并芘【,世界卫生组织分支机构最近也将的致癌物等级从 级很可能的致癌物上调为级确定的致癌物【】。氧化应激损伤在苯并芘的致 癌作用中扮演了重要的角色,这种损伤在肺癌发生后如何进一步影响肺癌细胞的 生物学特性,目前了解甚少。目前研究大多都集中在对细胞单个或少数几 个基因表达的影响【引,也有研究通过技术分析了暴露于后细 胞在基因组水平的变化‘?。鉴于基因组的变化必将导致蛋白质组发生改变,且 蛋白质在细胞体内的决定性作用,采用蛋白质组学技术进行研究,更能揭示生命 现象的本质。但是,目前从整体蛋白质组水平上探索苯并芘对细胞影响的研究还 很少。因此,我们本章首先筛选能引起人肺腺癌细胞.细胞出现氧化应激损 伤的浓度,再通过该浓度的短期处理人肺腺癌细胞.细胞以模拟香烟 对肺腺癌患者的氧化应激损伤,通过蛋白组学方法寻找是否可造成肺癌细胞 出现 差异表达蛋白,为迸一步的研究提供实验的线索。 材料与方法 .细胞株 肺腺癌细胞株购。细胞常规培养于含%小牛血清的 培养基中,在进行各项实验前先无药条件下培养一周。 .主要试剂 博七学位论文 第一章 ..双向凝胶电泳试剂: 试剂 公司 蛋白质定量试剂盒 瑞典 公司 同上 尿素 硫脲 同上 . 同上 . 同上 二硫苏糖醇? 同上 碘乙酰胺 同上 同上 固相梯度干胶条?, 同上 缓冲液? 同上 两性电解质,? 覆盖液 同上 双向凝胶电泳蛋白质 同上 溴酚蓝 同 ’ 美国.公司产品 同七 琼脂糖 同上 过硫酸铵 同上 同上 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 同上 甘氨酸 同上 同上 同上 分步抽提试剂盒 德国公司产品 ..质谱鉴定试剂: 试剂 公司 硫代硫酸钠 美国公司产品 碳酸氢铵 同.上二 同 铁氰化钾】 三氟乙酸 同一卜 乙睛和基质【.氰基..羟基肉桂酸 同.卜 胰蛋白质酶 美国公司产品第一章 博士学位论文 ..试剂 试剂 公司 鼠抗人一抗 美困公司 鼠抗人 一抗 公司 美国公司 鼠抗人抗体 ? 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗 美困公司 公司 发光剂 膜 公司 ..氧化应激试剂 总抗氧化活性检测试剂盒,碧云天公司 总活性检测试剂盒,碧云天公司 过氧化氢酶活性检测试剂盒,碧云天公司 谷胱甘肽还原酶活性检测试剂盒,碧云天公司 .. 试剂 ? 公司 总抽提试剂,美国 逆转录试剂盒,美国公司 . 试剂,天根公司 所用引物如下: :’..’ :一’: 扩增片段大小 :’: :’一 一’: 扩增片段大小。 引物由上海生工生物技术公司合成。 .生物信息学软件 公司 仪器 美国 图像分析软件 公司 扫描软件 公司 美国 同 质谱分析软件 美国.公司产品 双向凝胶图谱分析软件 质谱信号峰识别软件 英国公司产品 肽质量指纹图数据库查询软件 同一 同 /数据库查询软件 博学位论文 第一章 .主要仪器 仪器 公司 瑞典 公司 等电聚焦仪 垂直电泳槽 同上 同上 扫描仪 自动酶标仪 美国. 公司 低温高速离心机 美国公司 英国公司 恒温水浴箱 美国 公司 真空冷冻干燥仪 英国公司质谱 美国公司 低温超速离心机 .各种溶液的配制 .. 的配置 .溶于 中,即配制成 /的储备液; 储备液 ,加入 可稀释成/的工作液。 ..双向凝胶电泳试剂配制 组织裂解液配方:、 终浓度 试剂及分子量 质量或体积 . . . % . . . ... 一 . %/ 一 . %/ 用前加. . % 共,分装成借 平衡贮液: 终浓度试剂及分子量 质量或体积 % % % 甘油 . . . . 。 . 尿素 . . . 痕量 痕量 %溴酚兰 双蒸水 定容至 先加尿素和,再加甘油和一点双蒸水使固体溶解。然后加.及溴酚 兰,最后定容。 平衡液. 平衡液.碘乙酰胺 电泳缓冲液: 试剂及分子量 质量或体积 甘氨酸 . 碱 . 双蒸水 定容至 博卜学位论文 第一章 .%胶: 终浓度试剂及分子量 质量或体积 % . 单体 . . . % . . . . . ?. . . 双蒸水 . . % . . . .. . 共 .%琼脂糖: 试剂及分子量 质量或体积 电泳缓冲液 琼脂糖. %溴酚兰 中高火到分钟,加热至沸腾 考染液: 试剂及分子量 质量或体积 甲醇或乙醇 硫酸胺 磷酸 考马斯亮蓝 . 双蒸水 定容到 ? .: . 试剂及分子量 质量或体积 . 双蒸水 约 调至. 最后,双蒸水定量至滤纸过滤,度冰箱棕色瓶保存 %三氯乙酸溶液 终浓度 试剂及分子量 体积或质景 % 三氯乙酸 双蒸水 定容 %丙酮一?保存备用。 博仁学位论文 脱色漉 试剂及分子量 质量或体积 甲醇或乙醇 双蒸水 定容到 ..质谱分析试剂的配制 脱色液: 终浓度 试剂及分子量 / . % / . 终浓度 试剂及分子量 /. . 双蒸水 / : 终浓度 试剂及分子量 质量或体积 /. . 双蒸水 / : 终浓度 试剂及分子量 质量或体积 / .. 双蒸水 碘乙酰胺: / 终浓度 试剂及分子量 质量或体积 / . 碘乙酰胺 . 儿. / : 终浓度 试剂及分子量 质量或体积 /. /. 第一章 博:学位论文 %: 终浓度 试剂及分子量 体积 % % 双蒸水 .% 终浓度 试剂及分子量 体积 % .% . 双蒸水 酶解缓冲液: 终浓度 试剂及分子量 体积 % % . 儿 / 双蒸水 . 基质溶解液 终浓度 试剂及分子量 体积 % % . .% .% . 萃取液 体积 终浓度 试荆及分子量 % % .% % 胰蛋白质酶的配制: 取支/胰蛋白质酶溶于% 中,再分装成每支。冻存于. ?,最多可保存周待用。用时取支配制好的胰蛋白质酶/入.酶解缓冲 液,使胰酶最终浓度为稀释为“咖。每个蛋白点一般约用.町,故只分 装胰蛋白酶可做约个点。 基质工作液: 终浓度 试剂及分子量 质量或体积 基质溶解液 / 旋涡搅拌器充分振荡混匀,离心分钟,取上清液备用。博士学位论文 .. 分析试剂配制 . . . . 调 调至 双蒸水 . . . . 调 双蒸水 调至 . . . . 调 双蒸水 调至 %丙烯酰胺 丙烯酰胺 . 亚甲双丙烯酰胺 . 调至 双蒸水 ×积层较缓冲液 . % 双蒸水 ×分离胶缓冲液 . % 双蒸水 . . . 调至 双蒸水 第一章 调至 现配 调至 . 调至 . . .. / / 双蒸水 调至 ×凝胶加样缓冲液 %.. % 溟酚蓝.% . 甘油% . 现用现配 双蒸水 调至 ×电转缓冲液 . . 甘氨酸. . 甲醇 双蒸水 调至 博七学位论文 . 一 .% 调至 异丙醇 置一?保存 . . .. 置.?保存 凝胶蛋白质脱色液 双蕉水 乙酸 甲醇 凝胶蛋白质染色液 双蒸水 考马斯亮蓝 . 乙酸 甲醇 ×丽春红染液 丽春. 三氯乙酸 磺基水扬酸 调至 双蒸水 考马斯亮蓝溶液 考马斯亮蓝. %乙醇 磷酸 调至 双蕉水 滤纸过滤,。保存