应用DNA分析技术早期证明异基因外周血造血干细胞移植成功

应用DNA分析技术早期证明异基因外周血造血干细胞移植成功 应用DNA分析技术早期证明异基因外周血 造血干细胞移植成功 2 252 一 ~ 2 螂碹.殛1 商.p~/A 应用DNA分析技术早期证明异基因外周血, 造血干细胞移植成功 浙江省公安斤刑警总队(310009)昊微微/ / 公安部物证鉴定中I心(100038)郑秀芬v 杭州市红十字会医院(310004)朱晓玲马明信 用异基因外周血造血干细胞移植(allo—PBS CT)的方法治疗白血病,正被用以取代骨髓移 植.但在施行移植后如何尽早判断移植是舌成 功,对决定进一步治疗至关重要.人类 DNA具有高度的遗传多态性,利用特异已知序 列的DNA片段与目的DNA杂交所得到的DNA 指纹图谱具有高度的个体特异性;而多聚酶链 式反应(PCR)技术则是利用靶DNA序列侧翼 上所结台的两个寡核苷酸引物经体外酶促合 成特异DNA片段,笔者利用较为优秀的D.s, D.s,apoB及HUMTH014个位点的扩增片段 长度多态性检测和最新研制的JIJ.n2探针杂交 所得的DNA指纹图技术对1例行allo.PBSCT 患者的血液在移植后13天进行DNA分型检 测.得到了确定其移植是否成功的明确结论, 现报道如下. 材料和方法 1.对象:患者,男,36岁,确诊为慢性粒细 胞性白血病;供者,系患者胞姐,女,4o岁,体 健取移植前患者新鲜枸橼酸抗凝血10m1.供 者新鲜枸橼酸抗凝血5ml,及患者在移植后13 天,15天新鲜枸橼酸抗凝血各5ml 2.方法:各种引物及探针均购自公安部物 证鉴定中心. (1)基因组DNA提取:参照文献【1]方法, 略有改进.采用1.5mlEppendort”管取代10mI的 玻璃管,用300tq提取体系代替300ol (2)4个位点的PCR扩增及检测:列所有提 取的DNA进行Dls扔,D】S…,apoB及HUMTH014 个位点的扩增片段长度多态眭检测,PCR反应 液总体积为50tq,反应条件见表1.在加入相应 表1各位点PCR反应条件 注:?缓冲液浓度为:5nf啪I几KCL,10rnmol/[TriHCL(pH83ll5n~l/IM,0Olmg/rttl白明腔 量T踟DNA聚台酶之前,先在95变性5min, 嘏后液体石蜡覆盖后置Perkin.Elmer480扩增仪 中进行扩增. D.S日0,DS1,apoB3个位点均使用5%聚丙 烯酰胺凝胶220V,分别电泳3Omin,3Omin,40nlilrt~ HUMTHO1位点使用8%聚丙烯酰胺凝胶, 200V,电泳1h.扩增产物最后均经银染显色. (3)DNA指纹图技术:对所有DNA用紫外 分光光度计(Pharmacia公司生产)在波长为2(~11n2 测定核酸浓度(分别为1.2,ug/l,1舭1, 1g1);在波长为28Ohm测定蛋白质浓度,两 者之比值为其纯度(分别为1.9,1.9,1.8).各取 10txgONA,用Hinfl酶(美国Bio.1abs公司生产)酶 解5h.0.6%琼脂糖胶电泳,皎长20era,胶两端电 压差为34.5v电泳2011,凝胶经酸(025mol/L HCI),碱(0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCII变性 厂?\朗4第巷2第罡 拳 医 江 薪 浙立二薹掌1999年第2】卷葬4期 后再中和(3mol/LNaCI.0.5tool/LTris.HCI, D}I7.4),用20XSSC真空转移至Hybond.N (ArIlea?公司生产). 取500ng探针DNA,稀释成long/1.加入 等体积的辣根过氧化物酶标试剂(.&nersham公 司生产),混匀后加人等体积戊二醛,混匀,离 心.于37?水浴保温15min即可. 取4Oral预杂交液(Am?llam公司生产),加 Naa与酪蛋白,使其终浓度分别为0.5mol/L与 5%,已转移上DNA的尼龙膜在上述预杂交液 中加?预杂交45min.加人标记好的探针,继续 杂交12h.杂交完成后的尼龙膜在洗膜液 (5mol/L尿素,1XSSC,0.4%SDS)中室温振荡洗 涤2次,每次1Omin.再在2XSSC溶液中室温振 荡洗涤2次,每次5rain.洗涤后的膜按倪锦堂 等…方法检测,放入x线胶片曝光,自显影,得 到DNA指纹图谱 结果 在auoB,HUMTHO1位点的扩增片段长度 多态陛图谱上,移植前患者血液同供者血液谱 带一致. 在DSm,D-S位点的扩增片段长度多态 性图谱上,供者血液均为2条带移植前患者血 液均为l条带,而移植后13天,15天患者血液 均出现2条带,且均同供者的2条带位置一 致 在DNA指纹图谱上,移植前患者血液图谱 上有21条特异性带:而供者血液与患者移植后 13天,15天的血液都出现29条特异性带,且三 者位置完全一致.其中2l条特异性带位置同移 植前的谱带不一致,另8条为四者共同带.在 移植后患者血液的图谱上未见移植前存有的 而供体在相应位置上没有的谱带 讨论 自从I.evin等首次报道用外周血造血干细 胞(PBSC)进行移植以来,由自身提供PBSC或 同种异体提供PBSC移植以取代骨髓移植已逐 渐增多.但外周血中造血干细胞数较骨髓少. 且含有大量成熟的淋巴细胞,故在allo—PBSCT 后,宿主对移植物的排斥反应和移植物抗宿主 病(GvHD)的发生率较高.若能在移植后早期 就确诊移植是否成功,从而及时决定或改变治 疗方案,这对决定PBSC移植的患者的疗效有 积极意义. 施行allo—PBSCT后血液中红细胞会被供 者的红细胞完全代替,由于红细胞的寿命周期 是120天,用测定红细胞抗原的方法来判断 移植是否成功,要在移植后120天才能作出明 确的结论.曾有人试用红,白细胞同工酶,免疫 球蛋白等方法,由于受各种因素的影响而不能 早期得出明确结果.人体一个细胞的DNA分子 含3x10个核苷酸,DNA分子结构中的碱基序 列稍有变化,就可导致遗传信息发生很大变 化.每个个体的DNA分子不仅重复单位的不 同,而且重复单位的数目也不同,具有高度的多 态性,分析肼A的这种多态性可进行个人识 别.至于在器官移植中的应用,黄晓军曾报道 用DNA指纹图技术对骨髓移植者进行移植效 果的测定,钱新华等曾报道用PCR小卫星 指纹图对allo.PBSCT者进行监测.获得植入 证据的时间最早为l5天.尚未见有pcR结合 DNA指纹图对allo.PBSCT进行监测的报道. 本文杂交所用的JL.02探针与经典的多位点 DNA探针(33,6;33,15)相比,具有更高的鉴 别能力】.除同卵双生子外,几乎没有两个人 的DNA指纹图是完全一致的对于进行allo— PBSCT的患者,若移植成功,则移植后的血液 中有核细胞的遗传信息必然会被供者的所代 替.由于白细咆的寿命周期是3—4天,故 我们设想利用DNA技术对白细胞核内的DNA 进行分型,应可早期确定移植是否成功.笔者 在患者行allo—PBSCT后13天检测得其血液中 DNA分型同供者一致,而不同于移植前患者 血液的DNA分型,证明我们的设想是符合实 际的 同以往报道相比,本研究在pcR扩增时所 采用的D【SD【S…,apoB及HUMTH01这4个 位点由于常见的等位基因较多,具有较高的识 别能力,且由于具有灵敏度极高(仅需DNA 10,,g即可),操作简单等特点,一般基层单位都 可开展此项目.但PCR不足之处是提供的信息 不够丰富,如在本文中得出的两个特异结果的 位点上,患者在接受移植后的扩增片段长度多 态性谱带同供者一致,均为2条带,不同于移 植前患者的1条带,但由于两者有1条相同位 置的共同带,故在移植后患者出现2条带时, 只能说明是半嵌合体,而不能证明是否已完全 植人;但在DNA指纹图上则不同,患者在移植 后血液的特异性谱带同供者完全一致,没有出 现移植前存有的而供体在相应位置上没有的 谱带,这说明在移植后l3天时造血干细胞已 经完全植人.因此,在条件允许的情况下,对接 受allo—PBscT韵患者应做DNA指纹图检测, 浙江医学1999年第21巷第4期 以便对治疗效果进行科学的评估. (本文得到祝家镇教授的关心与指导.幂表谢意!) 参考文献 1李伯静.倪锦堂,储晓兰用n一珠蛋白一3HVR探针研究 DNA指纹图中国法医学杂志,1989,4【I):5 2李伯龄,丁焰.倪锦童,等PMCT118位点扩增片段长度多 态性及其运用中国法医学杂志,1991,6(3):132 3季安全,李继周,叶健,等JL.?多位点探针DNA指纹的 法医学应用研究.中国法医学杂志,1997,l2【2):65 4倪稀堂,叶毽,刘健.等辣根芷氧化物醉标记DNA探 针厦光增强检测DNA指纹图在法医学应用.遗传. 1992,19(3):179 5周衍椒.张镜如.生理学第3腹北京:人民卫生出版杜 l989.1ol 6黄骁军.人类DNA指纹图及苴在骨髓移植中的应用临床 血液学杂志.1992.5(3):130 7钱新华冯骁勤,李夏新,等.PCR叫,卫星DNA指纹图在异基 因造血干细胞移植植活指标监测中的应用中华医学遗传 学杂志.1996.13(1) 翱.破E甜,丁c9,多兽 经阴道彩色多普勒检测早孕子宫螺旋动脉的变化 杭州市中医医院(310007)张竹君潘农 经阴道彩色多普勒(?CD)对中,晚期妊娠 的监测有所价值.笔者使用TVCD技术检测了 38例早孕滋养层周围子宫螺旋动脉血流, 如下. 对象和方法 早孕组:38例,年龄20—39岁,平均勰.4 岁.停经35,49天,血HcG?25retool/ral,二 维超声图象显示孕囊最大直径?2.0cm. 对照组:40例,年龄25—42岁,平均3o5 岁.均为子宫内膜分泌晚期,月经周期规律,无 妇科疾患,在1年内未服用过任何刺激排卵以 及激素类药物. 采用A耵_I-IDI3000型全数字彩色多普勒 超声诊断仪,C9.5MHz超宽频变角(150.)探头, 探头中心频率9,5MHz,0角?30~,取样容积 1.0rmn.被检者取膀胱截石位,将消毒隔离的阴 道探头缓缓送人阴道,常规检查宫内胚囊的形 态,大小,位置.继而运用彩色多普勒能量图 (CDE),显示孕卵着床部位滋养层周围的子宫 螺旋动脉,并行脉冲多普勒测定,当显示连续而 稳定的动脉频谱时,测定收缩期最大峰值 (PSV),舒张期峰值(EDV),阻力指数(RI),并记 录图象.然后再应用彩色多谱勒血流图【CDF1) 进行观察. 结果 1.正常子宫螺旋动脉和早孕子宫螺旋动 脉的TVCD血流参数比较:早孕子宫螺旋动脉 PSV,EDV明显加快,而RI明显下降(见表1),