人类精子库精子冷冻最佳方案的探索

人类精子库精子冷冻最佳的探索 人类精子库精子冷冻最佳方案的探索 实用医学杂志2011年第27卷第l2期 人类精子库精子冷冻最佳方案的探索 刘居理冯耀陈伊罗明杨撵 摘要目的:通过对冷冻过程中影响精子冷冻复苏率的不同因素进行研究,以获取最佳的冷冻方案. 方法:比较冷冻过程冷冻方法,甘油浓度,卵黄浓度及精浆浓度对精子冷冻复苏率的影响.结果:(1)缓冻法 精子冷冻复苏率高于直接冷冻法,差异有显着性;(2)甘油浓度为6%或7.5%的保护剂冷冻复苏率显着高于 甘油浓度为4%7Z9%的保护剂,但前两者间无显着差异;(3)卵黄浓度为5%,10%,15%的保护剂间冷冻复苏 率无显着差异,均高于卵黄浓度为0%的保护剂,差异有显着性;(4)50%及75%精浆浓度冷冻复苏率无显着 差异.均显着高于0%的精浆浓度.结论:精子冷冻过程中冷冻方法及甘油,卵黄,精浆浓度对精子冷冻复苏 率均有影响.采用缓冻法,甘油终浓度6%7.5%,,卵黄终浓度5%一15%,精浆终浓度50%或75%的精子冷 冻方案是可行的. 关键词精子库:冷冻方案 2l51 TheoptimalprotocolsforspermfreezinginhumanspermbanksLIU血一li,FENGYao,CHENYi,LUO ,YANGWei.AffiliatedHospital,NanchangInstituteofMedicalSciences,Nanchang33000 1,China 【Abstract】ObjectiveToobtaintheoptimalprotocolsforspermfreezingbystudyingdifferentfactors influencingthemotilityofpost— thaw.MethodsTheeffectsofcryopreservativemethodsandconcentrationsof glycerol,eggyolk,andseminalplasmaonthemotilityofpost— thawwerecompared.ResultsTherateofpost—thaw motilitywassignificantlyhigherinslowfreezingthaninfastfreezing.Therateofpost— thawmotilitywassignificantly higherinthecryoprotectantcontaining6%or7.5%glycerolthaninthoseof4%or9%.buttherewasnosignificant differencebetweenthetwoformercryoprotectants.Theratepost— thawmotilitydidnotdiffersignificantlyamongthe cryoprotectantscontainingeggyolkof5%,10%,and15%,butwassignificantlyhigherthanthatof0%.Therateof post— thawmotilitydidnotdiffersignificantlybetweenseminalplasmaof50%andthatof75%,whereaswashigher thanthatof0%.ConclusionsCryopreservativemethodsandconcentrationsofglycerol,eggyolk,andseminal plasmahaveaneffectonthepost— thawmotilityofhumansperm.Theslowfreezewithglycerolfinalconcentrationof 6%,7.5%.eggyolkof5%, 15%.andseminalplasmaof50%Or75%isfeasibleduringtheprocessofsperm ~eezing. 【Keywords】SpermBanks;Freezingprotocols 人类精子库提供的冷冻精液具有使用方便,避 免感染病毒的优点,已在临床上得到广泛应用.但 目前各类精子冷冻保存的最大缺陷就是解冻后的 精子质量不满意,包括活率,活力等的降低.这主要 是由于精子冻融保存过程中渗透压变化,细胞内冰 晶形成等均对精子质膜产生影响,导致精子损伤. 在正常情况下只有具有前向活动的精子才能使卵 子受精.已有研究证实精子的活动力和活动率与精 子的生育力明显相关….卫生部对精子库检测质量 的一个主要指标就是前向运动精子的百分比.因 此,如何提高冷冻后精子的活动率,提供合格优质 的标本是当前精子库工作的重点,而冷冻方案在精 子冷冻过程中具有十分重要的作用. doi:10.39694.issn.1006—5725.2011.12.021 作者单位:330001南昌市医学科学研究所附属医院 为探索最佳的冷冻方案,获取满意的精子冷冻 复苏率,本文对精子冷冻过程中冷冻方法,甘油浓 度,卵黄浓度及精浆浓度对精子冷冻复苏率的影响 进行了研究. 1对象与方法 1.1研究对象精液样本来自到我院做生殖健康 体检合格的自愿者,年龄22,35岁. 1.2研究方法 1.2.1精液标本收集与常规精液分析所有研究 对象均禁欲2,7d,手淫取精于无菌容器中,37c《= 水浴箱中孵育.精液液化后进行精液常规分析.按 卫生部对(a+b)级精子>60%,精子密度>60 ×10/mL,精液量>2mL的标本进行分组并冻存. 1.2.2分组方法(1)按冷冻方法分为缓冻组,直 接冷冻组;(2)按甘油终浓度为分为4%甘油组,6% 甘油组,7.5%甘油组,9%甘油组:(3)按卵黄浓度分 为0%卵黄组,5%卵黄组,10%卵黄组,15%卵黄 组;(4)按精浆终浓度分为0%精浆组,50%精浆组, 75%精浆组. 1.2-3冷冻保护剂的配制按照Mahadevan等[z] 的经典方法配制含葡萄糖的冷冻保护剂,根据实验 不同改变甘油,卵黄浓度,调节pH值至7.2,7.6. 用微孔直径0.22Ixm的过滤器除菌后不添加抗生 素. 1.2.4精子冷冻同组问同次实验均采用同一样 本进行对照分析.冷冻时,除非实验本身有要求外, 均采用保护剂与精液比例为1:3,甘油终浓度为 6%,卵黄终浓度为10%,用缓冻法冷冻24h后进 行复苏的实验方案.冷冻步骤具体如下.(1)缓冻 法:精液与冷冻保护剂按一定比例混匀,装入2mL 精子冻存管.放人小提筒内,室温放置10rain后置 于液氮面上5cm处10rain,将提筒吊放于液氮面 上0.5em处5min.立即置人液氮中贮存.(2)直接 冷冻法:精液与冷冻保护剂按一定比例混匀,装入 精子冻存管.放人4?冰箱15rain后立即置入液氮 中贮存. 1.2.5复苏从液氮中取出精子冻存管,立即投入 37%水箱中,期间颠倒混合数次,5rain后取出,观 察精子活动率,并计算精子冷冻复苏率. 1.3统计学分析各组之间的精子活动率采用 SPSS11.0,应用方差分析和两两比较的q检验. 2结果 不同因素对精子冷冻复苏率的影响如下.(1) 冷冻方法:缓冻法精子冷冻复苏率高于直接冷冻 法,差异有统计学意义,见表1.(2)甘油浓度:甘油 浓度为6%或7.5%的保护剂冷冻复苏率显着高于 甘油浓度为4%及9%的保护剂,但前二者问无统 计学意义,见表2.(3)卵黄浓度:卵黄浓度为5%, 10%.15%的保护剂间冷冻复苏率尤统计学意义, 均高于卵黄浓度为0%的保护剂,差异有统计学意 义,见表3.(4)精浆浓度:50%及75%精浆浓度冷 冻复苏率无统计学意义,显着高于O%的精浆浓度. 见表4 表1冷冻方法对精子复苏率的影响(12=15)4-s,% 注:与直接冷冻组比较,P<O.05,AP<0.05 3讨论 精子冷冻在辅助生殖领域中具有重要地位.而 精子活动力被认为是衡量男性生育力的较好指标. 实用医学杂志2011年第27卷第12期 表2甘油浓度对精子复苏率的影响(n=20)jj?5 注:?与?,?,?比较,P<O.05,AP<O.05;?与?,?比较, P<O.05.?P<0.05 表3卵黄浓度对精子复苏率的影响(n=20)%,"-t-S 注:?与?,?,?比较,$P<0.05,?尸<0.05 表4精浆浓度对精子复苏率的影响(n=20)%,?s 注:?与?,?比较,P<0.05,AP<O.05 因此如何提高冷冻后精子复苏率,使冷冻后标本保 持较好的精子活动力,是当前精子冷冻研究的重 点.而在冷冻过程中有众多因素影响着精子冷冻复 苏率.其中冻融过程中细胞内冰晶的形成和溶液效 应是精子损伤的主要原因l3].因此,尽量减少精子 在冻融过程中的损伤是一个关键. 国内已有许多研究表明程序冷冻法和液氮 蒸汽法两种冷冻方法对精子复苏后的前向活力及 总活力的影响没有明显区别[,国外也有类似报道. 因此利用液氮蒸汽法进行冷冻是可行的.而液氮蒸 汽法中又可分为直接冷冻和缓冻两种方法,为了比 较其中的优劣.本研究对15例精液标本进行了冷 冻分析,冷冻时每份标本与冷冻保护剂按3:1比 例混匀后取等量分别利用直接冷冻法和缓冻法进 行冷冻.结果表明,缓冻法,直接冷冻法复苏率分别 为(76.7?9.43)%及(54.7?9.10)%,差异具有统计 学意义.因此利用缓冻法进行冷冻是可行的,其冷 冻效果远远好于直接冷冻法.原因可能是由于直接 法将精液从4?直接浸入液氮中,温差大,降温率 极快.精子来不及调整自身的功能状态以适应冷环 境的刺激,而造成了更大程度的冷冻损害[. 另外,精液冷冻保护剂在冷冻过程中对精子的 保护作用也是相当关键的,冷冻保护剂配制的好坏 直接影响到复苏精子的质量.目前常用的具有较好 实用医学杂志2011年第27卷第12期 保护效果的人类精子冷冻保护剂是甘油复合型.由 于各种类型甘油复合型保护剂成分不一,冷冻效果 存在差异,因此为了获得冷冻效果更佳的保护剂, 本研究根据经典的冷冻保护剂配方,对其中成分进 行了调整.甘油是最早使用的保护剂,可很快渗入 精子细胞内.降低细胞内液的冰点,减少冰晶的形 成,起到保护精子的作用,精子与保护液作用10 rain的精子活力最好.有报道指出甘油的最终浓度 为5%,10%[.但本研究结果提示,甘油浓度为 6%或7.5%的保护剂冷冻复苏率要显着高于甘油 浓度为4%及9%的保护剂,但前两者间无显着差 异.原因可能是保护剂中甘油浓度太低使溶液的凝 固点降低不足,不能很好地延缓细胞内冰晶形成作 用,从而使精子受损:而过高会引起精子顶体颈部 的损害以及尾部的弯曲,复苏后精子形态发生变 化,影响精子质量.因此,保护剂甘油浓度需适中, 本研究结果表明甘油浓度为6%,7.5%更适合人 类精子的冷冻而卵黄作为保护剂中另一个重要的 成分.能附着于精子细胞表面,调节降温复温过程 中细胞内外电解质平衡,卵黄所含卵磷脂能稳定精 子细胞膜,阻止顶体破裂,减轻冷冻引起的精子冷 体克,减弱冰晶对精子造成的损伤.本研究结果也 进一步证实了卵黄对精子冷冻的保护作用,含卵黄的保护剂其冷冻复苏率要显着高于不含卵黄的保 护剂.但在本研究中高浓度的卵黄对精子冷冻复苏 率并没有显示出特别的优势,卵黄浓度5%,10%, 15%的保护剂问复苏率无显着差异,而且高浓度的 卵黄可造成细胞碎片的明显增多.本研究中5%gI~ 黄浓度的保护剂冷冻后几乎看不到细胞碎片,但 15%卵黄浓度的保护剂却可见大量细胞碎片.因此 在选择卵黄浓度时这也是一个需要考虑的因素.至 于高浓度卵黄对精子功能是否具有更好地保护作 用还待研究. 此外.本文对精浆浓度对精子冷冻复苏率的影 响也进行了探讨.在传统的精液冷冻中,精液通常 以I:i的比例与保护剂混合,即精浆浓度为50%. 有研究发现,在离体的附睾精子中加入精浆.能够 促进这类精子的前向运动,而精浆中的前列腺素 被认为可以提高精子内的cAMP浓度_8],从而促进 精子的运动[.但在临床或实验工作中,精浆往往 被认为是一种阻碍精子存活的物质而在精子制备 过程中加以除弃_】.l.由于精浆的成分及其比例非常 2153 复杂.因而精浆浓度是否对冷冻精子的复苏有所影 响,是一值得研究的问题.本研究结果显示:50%及 75%精浆浓度冷冻复苏率无显着差异,显着高于 0%的精浆浓度.为了减少实验误差,本实验将精液 标本等量分成3份,低速离心后将其中1份标本精 浆小心去除并加入保护剂混匀,另2份标本重悬后 分别与保护剂按1:1及3:1混匀,混合后三者甘油 终浓度及卵黄终浓度均相同.因此一定浓度的精浆 对精子的冷冻是必要的,至于其机制还有待研究. 综上说明:精子冷冻过程中冷冻方法及甘油, 卵黄,精浆浓度对精子冷冻复苏率均有影响.采用 缓冻法,甘油终浓度6%,7.5%,,卵黄终浓度5% , 15%,精浆终浓度50%或75%的精子冷冻方案是 可行的. 4参考文献 [1]SallamHN,EzzeldinF,SallamA,eta1.Spermvelocityan morphology,femalecharacteristics,andthehypo—osmotic swellingtestaspredictorsoffertilizationpotential:experience fromtheIVFmodel[J].IntJFertilWomensMed,2003,48 (2):88-95. 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