鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合脂超分子体系液晶态立方相Im3m和Pn3m结构影响的研究

鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合脂超分子体系液晶态立方相Im3m和Pn3m结构影响的研究 鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合脂超分子体系液晶态立方相Im3m和Pn3m 结构影响的研究 2007年第65卷 第3期.246~252 化学 ACTACH1MICASINICA ,.o1.65.2007 NO.3.246252 ? 研究论文? 鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合脂超分子体系液晶态立方相 Im3m和尸仃3m结构影响的研究 孙润广籼张静凸 (.陕西师范大学物理学与信息技术学院生物物理与生物医学研究室西安710062) (陕西师范大学食品工程系分析测试实验室西安710062) 摘要用磷脂酰乙醇胺(DEPE),鞘磷脂(sphing0myeline,Sph),神经节苷脂(Gm1)$11胆固醇(Cho1)模拟了生物膜超分子 体系液晶态结构,通过用小角x射线衍射(SAXD)对混合脂体系液晶态结构进行了研究,鉴定出了两种立方相:即 Im3m(O229)~[JPn3m(QTM)结构.实验发现,鞘磷脂的含量对DEPE膜的结构有一定的影响,随着鞘磷脂浓度的增加,混 合脂体系的液晶态结构发生了由/m3m(Q229)到Pn3m(Q224)的变化.神经节苷脂(Gm1)的含量对混合脂体系的液晶态结 构也有一定的影响,当神经节苷脂(0m1)含量达到某一临界值时,混合脂体系的液 晶态结构发生了从lm3m(Q2g9)~lJ Pn3m(Q24)的变化.当DEPE—Shp.Gml超分子聚集体中含有胆固醇时,胆固醇的极 性头部(一OH)与磷脂酰乙醇胺 (DEPE),鞘磷脂(shp),神经节苷~(Gm1)的极性头部通过氢键相互作用形成液晶态 立方相lm3m(Q229)结构,再通过疏 水/亲水相互作用形成稳定的Pn3m(Q224)结构. 关健词生物膜;液晶态立方相;小角x射线衍射 EffectofSphingomyelineandMOnOSialiOgangliOSide-Gm1onthe PhaseBehavioroftheSuper—molecularStructuresof 1,2-Dielaidoyl-Sn-glycero-3-phosphatidyl-ethanolamine:CubicPhase Im3mtoPmTransitioninLiquidCrystallineStatePhase SUN,Run—GuangZHANG,Jing ("LaboratoryofBiophysicsandBiomedicalTechnology,CollegeofPhysicsandInformatio nTechnology, ShaanxiNormalUniversity,Xian710062) (.LaboratoryofAnalyticalTest.DepartmentofFoodEngineering,ShaanxiNormalUniversi ty,Xian710062) AbstractIthasbeeninvestigatedthatthesuper?molecularstructureslnliquidcrystallinestate saremade upofDEPE(1,2一dielaidoyl—sn—glycero一3一phosphatidyl— ethanolamine),sphingomyeline,monosialiogan— glioside—GmlandcholesterolbysmallangleX— raydiffraction.TheeffectofsphingomyelineonDEPEfilm wasdetermined.AstructuretransitionfromIm3m(Q)toPn3m(Q)occurredwithincreasings phingo— myelineconcentrationinthesuper— molecularstructures.Theeffectofmonosialioganglioside—Gmlcontent Oilthesuper— molecularstructureswasalsodetermined.Atacriticalconcentrationofmonosialiogan— glioside— Gml,thestructuretransitionfromIm3m(Q")toPn3m(Q)occurred.Theeffectoftheadditiono f cholesterolonDEPE—Shp—Gmlsuper— molecularstructurehasalsobeeninvestigated.Thereexistsaninter- actionbetweenthepolarhead(— -oH)ofcholesterolandthatofDEPE,sphingomyeline,monosialiogan— glioside—Gmlbyoxygen— halogenbond,toformcubicphaseofliquidcrystallinestates.APn3m(Q)struc一 E—mail:sunrunguang@snnu.edu.cn;zhangjin@snnu.edu.ca ReceivedOctober16.2o06;revisedandacceptedDecember26,2006. 国家自然科学基金(No.20572067)和教育部科学技术研究重点(No.104167)资助项 目 No.3孙润广等:鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合脂超分子体系液晶态立 方相Im3m和Pn3m结构影响的研究247 turewasfurtherformedbyhydrophilic/hydrophobicinteraction. Keywordsbiomembrane;cubicphaseinliquidcrystallinestates;smallangleX— raydiffraction 生物膜除以脂双层为主要结构特征外,是否还具有 其它结构,一直是人们感兴趣的问题fl1】.有人曾对磷 脂酰乙醇胺及其水系结构的多型性进行研究,发现磷脂 酰乙醇胺脂质体通常处于六角相【8J,在适当温度和含水 量的条件下能自然形成六角相(HII)f9】.钠盐或PEG500 能诱导DEPE(1,2一Dielaidoyl—glycero一3-phosphafidyl- ethanolamine)形成Im3m(Q凹)立方液晶.IllJ,发生相 变时立方相挤入片层相和六角相之间【l.最近Wang和 Quinnf13】研究发现胆固醇能诱导POPE形成立方相 Pn3m,而维生素E促使DLPE形成的立方相Pn3m与 其含量有关【M】.Feng研究发现,葡糖脑苷脂能促使 POPE形成Pn3m和Im3m与相共存,当对其加热或 冷却时,发现Pn3m与两I和L?相共存.研究结果表明, 混合脂体系液晶态立方相Pn3m和Im3m可能与生物膜 的组成密切相关. 为了深刻理解生物膜组成成分之间的相容性,微区 形成以及这些复合结构分子的分布情况,有人曾对磷 脂,胆固醇,糖脂类以及一些化学物质形成的复合膜进 行了研究[12~18],发现生物膜的双亲分子在水溶液中形 成各种中间相,随着双亲分子密度的增加,经历六角相 【具有圆或椭圆(ribbon)截面柱形胶束在空间形成六角形 的点阵】,立方相(球形胶束在空间形成立方点阵),直至 双连通(脂类双层把水或油分成互相交织而又不相连通 的结构)及三连通的结构【脂类双层之间被一种成分(水 或油)充胀,而双层两侧被另一种成分填充】.我们曾用 小角X射线技术研究了酸,盐,醇等化学物质对生物膜 液晶态结构的影响,发现了三个新液晶态结构.研究结 果表明,在外界环境的影响下生物膜的液晶态可以从双 层相变成非双层相.这些非双层相除常见的立方相和六 角相外,还存在一些更复杂的中间相.有些化学物质有 使生物膜的液晶态趋于形成非双层相的作用[19~20].最 近Feng等【I2l用小角x射线技术研究了磷脂酰乙醇 胺相行为,发现葡糖脑苷脂能促使POPE形成Pn3m和 Im3m与上虹共存相.许多混合脂体系都会发生相分离形 成微区.这些微区很可能具有非常重要的生物学意义. 一 些感染性疾病,心血管疾病,肿瘤,肌营养不良症等 可能与生物膜液晶态的结构变化与功能紊乱有密切关 系,也可能与液晶态立方相的纳米结构有关,是一个值 得认真探讨与研究的问题. 针对这个问题,我们在前期工作的基础上,受Feng 等工作的启发,对生物膜的骨架分子鞘磷J]~(Sphingo. myeline,Shp),神经节苷脂(Gm1),胆固醇(Cho1)和磷脂 酰乙醇胺形成的混合脂超分子体系的液晶态结构进行 了研究.以磷脂酰乙醇胺,鞘磷脂,神经节苷脂和胆固 醇为研究对象,通过小角x射线技术对其超分子体系液 晶态结构进行了测定,在混合脂体系中鉴定出了两个液 晶态立方相结构,发现鞘磷脂,神经节苷脂的浓度变化 能引起混合脂体系液晶态立方相结构从Im3m(Q)到 Pn3m(Q2)变化.这些发现对弄清生物膜结构变化与功 能紊乱之间的关系提供了部分理论和实验依据,具有重 要的生物学意义. 1材料与方法 1.1实验材料 l,2.反十八碳.3.磷脂酰乙醇胺(1,2.Dielaidoy1.n— glycero一3一phosphatidyl?ethanolamine,DEPE),胆固醇 (Cholesterol,Cho1),鞘磷~(Sphingomyeline,Sph),神经 节苷)l~(Monosialioganglioside.Gm1)购于Sigma(USA)公 司,其结构式如图l所示.其它化学试剂购于上海试剂 公司. 1.2样品制备 将磷脂酰乙醇胺,鞘磷脂,神经节苷脂和胆固醇按 实验要求分别共溶于乙醚中;将1/15mol磷酸盐缓冲 液(PBS,pH7.4)置于烧瓶中,放在磁力加热搅拌器上高 速搅拌,温度控制在60~70?范围内.在搅拌的同时, 用微量注射器将溶有药物的乙醚(大气压下乙醚沸 点34.6?)溶液缓慢加入,加完后在上述温度范围内继 续搅拌90min,除去乙醚,然后密闭保存在电热恒温培 养箱中待用,温度控制在(60?2)?.样品的组成见表1. 1.3小角X射线散射(SAXS)实验 小角x射线衍射(SAXD)图谱在日本理学D/max.rB 型旋转阳极x射线衍射仪上测得.样品用浴式超声波发 生器振荡30min,将其充分混匀后,置于特制样品架上 进行小角X射线衍射测定.用闪烁记数器作为X射线探 测系统,将光信号转换成电信号输入计算机进行数据处 理.测试条件:CuKa辐射,2=0.154056nm,Ni滤波片, 管压为40kV,管流为100mA,扫描速度为0.5(.)/min, 时间常数为2S,样品均在室温进行测定,小角X射线衍 射数据见表2. 248化学V o1.65.2o07 O H+~.一.I一.一};一oo H/\HoI. OH3 O 1-2-Dielaidoyl-sn?glycero-3-ph0sph0elhan0Iamine Sphingomyeline CH3 CH3 图l1,2-反十八碳-3-磷脂酰乙醇胺,胆固醇,鞘磷脂,神经节苷脂的结构式 FigurelStructuresof1,2?dielaidoyl.,l.glycero-3-phosphoethanolamine,cholesterol,sphin gomyelineandmonosialioganglioside.Gml 表1样品的组成成分(摩尔分数) Table1Thecompositionofsamples(molarfraction) 兰坐.Positionx(Sph)/%x(Om1)/%x(Cho1)/% 11DEPE+Sph 12DEPE+Sph 13DEPE+Sph 21DEPE+Gml 22DEPE+Gml 23DEPE+Gml 31DEPE+SDh+Ch0l 32DEPE+Sph+Ch0l 41DEPE+Sph+Gml+Chol 42DEPE+Sph+Gml+Chol 43DEPE+Sph+Gm1+Chol / {;\<\色'|?O,(o o. C; 3一 一一一一:2:2:2:2 一一55一一55一一011一一011 一一一 No.3孙润广等:鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合脂超分子体系液晶态立 方相3和Pn3m结构影响的研究249 表2脂筏超分子结构的X射线衍射的晶面间距与空间比率 Table2TheratiosandspacingofthesetoflatticeplanesoftheX-raydiffractionoflipidraftssup er-molecularstructures 2结果与讨论 2.1鞘磷脂对DEPE立方结构的影响:Im3m/Pn3m-- Pn3m的转变 如图2a所示,在DEPE中加入x=0.5%的鞘磷脂, 其DEPE.Shp超分子体系的衍射线空间分别对应于空间 群Im3m(O)和Pn3m(Q)的结构.根据晶格常数日与 晶面间距d和晶面指数hkl的关系,以与 ?IIl+k+,为坐标作图,得到一条通过零点的直线, 斜率为a值的倒数,由此求得Im3m(Q2)和Pn3m(Q224) 的晶格常数分别是26.626和20.805nm.实验结果表明, DEPE.Shp超分子体系处于Im3m/Pn3m共存的液晶态立 方相结构.随着鞘磷脂浓度的增加,DEPE.Shp超分子体 系中发生了从lm3m(Q)到Pn3m(Q.)的结构转变,与 此相应的鞘磷脂摩尔分数是=1.O%.当DEPE中含 :5%的鞘磷脂时,DEPE.Sph超分子体系衍射线空间对 应于Pn3m(Q)液晶态立方相结构(图2b),晶格常数是 2O.800nm.实验结果表明,鞘磷脂对1,2.反十八碳.3.磷 脂酰乙醇胺(DEPE)结构的影响依赖于鞘磷脂的浓度(见 表3). 在DEPE.鞘磷脂超分子系统中,高浓度的鞘磷脂诱 导形成Pn3m结构,低浓度的鞘磷脂促使形成Pn3m和 Im3m共存的液晶态立方相结构.在Im3mlPn3m液晶态 立方相结构共存时,晶格常数比是1.28(26.625/20.805 =1.2798).实验证实DEPE分子的极性区存在分子间静 电力作用,即相邻分子间带负电的磷酸基团和带正电的 氨基之间相互作用.在单层膜中这种作用主要发生在同 层DEPE分子间;在多层膜中这种作用发生在相邻的两 层间,减弱了同层间的相互作用,从而使多层膜的间距 增大.因此,多层膜受其它因素影响较小,稳定性较好, 明显优于单层膜【231.DEPE分子在不同pH值时极性头磷 酸基团的解离状态不同,形成分子间氢键的状态也不 同.在pH值为中性时,DEPE的磷酸基团带一个负电荷, 氨基带一个正电荷,分子仍为中性,难以离解成为 DEPE(一)形式,但相邻的分子可以通过vanderWaals 力,分子间静电相互作用达到平衡,形成有序结构;在 pH为碱性和酸性时DEPE分子成为半解离DEPE(--1/2) 和DEPE(,1—1/2)的解离状态,相邻分子形成的分子 间氢键数减少,得到的单分子膜有序性降低【.24】. 2.2神经节苷脂(Gm1)对DEPE立方结构的影响: 『,n3m一,m3Pn3m~Pn3m结构的转变 加入少量神经节苷脂(Gm1)到DEPE.Gml超分子体 系中,促使其形成液晶态立方相结构.在x(Gm1)= ,与DEPE.Gml超分子体系的间距(nm)相应的 0.5%时 密勒指数是(110),(200),(211),(220),(3lO),(222), 250化学Vo1.65,2007 重 宝 景一 罾 兽 尝 图2脂筏超分子结构的x射线图 (a)在鞘磷脂)=0.5%时,脂筏超分子体系的衍射线图谱与空间群lm3m/Pn3m的结构 相符,相应的晶格常数分别是26.626和20805nm.(b)在x(鞘磷脂 =1.5%时,脂筏超分子体系被诱导形成立方相结构,晶格常数是20.800am Figure2TheX—raypatternoflipidraftssuper—molecularstructures (a)Atx(sphingomyeline)=0.5%.theX?raypattemoflipidraftssuper-molecularstructuresh asasffuctlll*eidenticaltothatrecordedforthelm3m/Pn3mmixtures obmined,withlatticeconstant26.626and20805nmrespectively.(b)Atx(sphingomyeline)= 1.5%,lipidraftssuper-molecularstructureswereinducedtoforma cubicphasewithlatticeconstant20.800nm 表3鞘磷脂,神经节苻脂和胆固醇对脂筏超分子结构的影响 Table3Effectofsphingomyeline,monosialiogangliosideandcholesterolonlipidraftssuper- molecularstructures (321),(400),(411/330),(420),(332),对应于Im3m(Q") 结构.根据晶格常数a与间距d舭口密勒指数hkl的关 系,求得它的晶格常数是28.553am.在x(Gm1)<1.O% 时,混合脂超分子体系是处于Im3m(Q)结构.在 x(Gm1)=1.O%时,发生从3(Q.)结构到Pn3m(Q) 结构的变化.混合脂超分子体系属于Im3m/Pn3m共存 的液晶态立方相结构.在Gm1)>1.O%时,混合脂超 分子体系是处于Pn3m(Q)结构,它的晶格常数是 22.298nm.随着神经节苷J~D(Gm1)浓度在混合脂超分子 体系中的增加,液晶态立方相的晶格常数减小.空间群 Im3m(Q)和Pn3m(Q)品格常数的比率是1.28.研究 发现,加入神经节苷脂改变了液晶态立方相的结构.在 含有高浓度的鞘磷脂中,当Gml浓度增大时,在混合脂 超分子体系中,Pn3m(Q)比Im3m(Q)更稳定(见表3). 神经节苷~D(Gm1)的存在允许磷脂酰乙醇胺(PE)系 统形成液晶态立方相.在较高的神经节苷脂(Gm1)含量 =1.5%)中,空间群(Pn3m)结构在DEPE/GmI混合体 中形成.在较低的神经节苷脂(Gm1)含量中,至少两个 (/m3m,Pn3m)结构被发现.在我们的实验中,从/m3m到 Pn3m的转变中没有发现Ia3d相.我们认为,在DEPE/ Gm1系统中,通过组分浓度的改变,可能诱导/m3m转 变成Pn3m.在DEPE系统中加入鞘磷脂,神经节苷脂, 胆固醇,可能诱导/m3m通过表面结构的变化形成 Pn3m,而没有任何结构的破坏.由此可见,生物膜液晶 态结构的多形性问题是一个十分有趣且值得深入研究 的课题,对揭示生命科学的基本规律具有重要意义. 2.3胆固醇对模拟生物膜结构的影响:Pn3m-*一I相结 构的转变 加入一定含量的胆同醇[x(Cho1)=15%】到DEPE. Shp超分子体系中,实验发现,DEPE.Shp.Chol超分子体 N0.3孙润广等:鞘磷脂和神经节苷脂对磷脂酰乙醇胺混合腊超分子体系液晶态立 方相Im3m和Pn3m结构影响的研究251 系的晶面间~E(nm)的比率是?2:43:44:45: ?石:?百:?,表明DEPE-.Shp—Chol超分子体系处在 en3m(Q")结构.当模拟生物膜超分子体系样品中含有 少量的鞘磷脂(鞘磷脂)===0.5%】时,小角X衍射结果 (见表2)表明属Pn3m(Q)结构,晶格常数是23.591 nm. 在(鞘磷脂)=1.5%时,加入X=15%胆固醇到 DEPE,Shp.Chol超分子体系中,能促使形成Pn3m(Q) 和六角相I共存相,即Pn3m(Q)/I.Pn3m(Q")结构 的晶格常数是22.686nm.六角相I的晶格常数是7.5 nm. 在低浓度神经节苷脂溶液[x(Gm1)=0.5%仲,混合 脂超分子体系是Pn3m(Q")结构,晶格常数为20.130 nm.胆固醇对混合脂超分子体系的影响结果表明,无论 在高浓度的神经节苷脂溶液【(Gm1)=1.5%】中,还是在 低浓度的神经节苷脂溶液Gm1)=0.5%】中,它均有助 于体系形成Pn3m(Q)结构.胆固醇对Pn3m(Q)结构 具有稳定作用(见表3). 胆固醇是极为重要的生物分子,一般集中分布在作 为细胞边界的外周膜上,在生物膜结构和功能中扮演着 重要的角色.它是类固醇激素(steroidhormones)~El胆汁 酸(bileacids)合成的前体.胆固醇的合成和利用对人体 健康和疾病防治具有重要作用.如冠状动脉硬化在临床 上的特征是胆固醇的变态沉积(abnormaldeposition)和 脂蛋白(1ipoproteins)胆固醇增多,这些沉积物最终导致 动脉硬化症[2引.为了防止胆固醇在人体的过量堆积和 变态沉积,必须对胆固醇的合成和利用进行严格控制. 胆固醇(Cho1)对DEPE-.Shp超分子聚集体的影响表明, 在高的鞘磷脂浓度中胆固醇有利于形成Pn3m(Q22)和 六角形.液态有序共存相.在低的鞘磷脂浓度中,胆 固醇促使DEPE.Shp超分子聚集体形成Pn3m(Q"24)的液 晶态结构.在DEPE-Shp—Gm1..Chol超分子聚集体中,胆 固醇有助于形成稳定的Pn3m(Q)的液晶态结构.这是 因为胆固醇只有一个3-OH极性头部,当DEPE.Shp. Gml超分子聚集体中含有胆固醇时,胆固醇的极性头 部(一OH)与磷脂酰乙醇胺(DEPE),鞘磷脂(Shp),神经 节苷脂(Gm1)的极性头部通过氢键相互作用形成液晶态 立方相Im3m(Q)结构,它再通过疏水/亲水相互作用形 成稳定的Pn3m(Q")结构.胆固醇的加入阻扰DEPE分 子脂酰链的旋转异构化运动,降低了膜的流动性,对 DEPE单分子膜有比较显着的稳定作用.胆固醇与磷脂 分子的相互作用研究表明,膜呈液晶态时脂类中的胆固 醇含量增加,具有增大有序性,降低流动性的作用.人 体内过多的胆固醇将导致膜流动性减小,使膜硬化【. 适当控制体内的胆固醇含量对健康是有益的,这对认识 生命的本质,不断促进生物学的发展具有重要意义 3结论 利用磷脂酰乙醇胺(DEPE),鞘磷]~(Sphingomye-- line,Shp),神经节苷脂(Gm1)和胆固醇(Cho1)的自组装特 性.模拟了生物膜超分子体系液晶态结构,通过用小角 X射线衍射对其超分子体系液晶态结构的测定,发现了 两个液晶态立方相结构Im3m(Q")和Pn3m(Q24).鞘磷 脂的含量对DEPE膜的结构有一定的影响,随着鞘磷脂 浓度的增加,混合脂超分子液晶态立方相结构发生了由 Im3m(Q.)到Pn3m(Q")结构的变化.神经节苷脂 (Gm1)的含量对混合脂超分子结构也有一定的影响,当 神经节苷脂(Gm1)含量达到某一临界值时,混合脂超分 子液晶态立方相结构发生了从Im3m(Q)到Pn3m(Q) 结构的变化.胆固醇的极性头部(一OH)与磷脂酰乙醇 胺(PE),鞘磷脂(Shp),神经节苷脂(Gm1)的极性头部通 过氢键相互作用形成液晶态立方相Im3m(Qz)结构,它 再通过疏水/亲水相互作用形成稳定的Pn3m(Q)结构. 胆固醇的加入阻扰了DEPE分子脂酰链的旋转异构化运 动,降低了膜的流动性,对DEPE单分子膜有较显着的 稳定作用. 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