同仁乌鸡白凤丸中重金属和农药残留的测定

第 32卷第23期 2007年12月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica Vo1．32，Issue 23 December，2007 同仁乌鸡白凤丸中重金属和农药残留的测定 聂黎行h，李向日 ，金红宇 ，Y-~Js ，李志猛 ，林瑞超 (1．中国药品生物制品检定所 中药室，北京 100050； 2．北京同仁堂股份有限公司，北京 100051) 中药来源于天然动植物，由于世界范围内的环 境污染不断加剧，中药中重金属和农药残留问已 成为影响其安全性的重要因素之一。残留重金属元 素的毒性作用主要表现为慢性蓄积性中毒，它们与 人体内酶蛋 白上的．SH和．S．S．键牢固结合，从而使 蛋白质变性，酶失去活性，组织细胞出现结构和功能 上的损害。中药制剂中重金属可能来源于中药材， 辅料，提取溶媒，设备及接触器皿等。农药对人体的 危害主要表现为神经毒性：有机氯农药易产生慢性 中毒；有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶 有抑制作用，它们易产生急性中毒，有时严重危及生 命；菊酯类农药对呼吸道可造成严重刺激，引起过敏 性咳嗽及哮喘，对孕妇及儿童可引起类中毒反应。 中药制剂中的农药残留主要原因是农药的不规范使 用，也有些农药虽早已被禁用，但由于其不易分解， 在土壤中长期残留，也会对中药材造成污染，中药材 在仓储过程中为了防虫蛀而喷洒农药也可能成为重 要的污染途径。近年来，中药中有害残留问题引起 了越来越多的国内学者的关注，但有关中成药中农 药残留量检测的研究报道较少 引¨。作 者采用原子 吸收分光光度法和原子荧光法测定了同仁乌鸡白凤 丸中铅、镉、铜、砷、汞的含量，采用气相色谱法和气 质联用法测定了其中9种有机氯、12种有机磷和 3 种拟除虫菊酯类农药的残留量，为其全面质量控制 提供了实验依据。 1 仪器与试药 Mars 5微波消解仪(CEM公司)，AFS一9130双 道原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)，SO． LAAR M6原子吸收光谱仪 (Thermo公 司)，岛津 GC2010气相色谱仪(带 ECD检测器)，岛津 GCMS — QP2OlO气相色谱．质谱联用仪，Trace GC气相色 [收稿 13期] 2007-02-28 [通讯作者] 聂黎行，Tel：(010)67095387，E—mail：nielixing@ 163．corn 谱仪 (带 FPD检测 器，Thermo公司)，METI'LER AE240电子天平，N—EVAP 111氮吹仪，中华牌加 热器(河南巩义市英峪仪器厂)。 纯氯化钠、无水硫酸钠、硫酸、磷酸二氢铵、 硝酸镁、碘化钾、抗坏血酸、盐酸羟胺、硼氢化钠、氢 氧化钠、高锰酸钾、中性氧化铝(北京化学试剂公 司)，分析纯石油醚(60～90℃)、乙醚(北京化学试 剂公司，重蒸馏后使用)，优级纯硝酸、硫酸(北京化 工厂)，BV．11级硝酸(北京化学试剂研究所)，PR级 正己烷、醋酸乙酯、丙酮、二氯甲烷(DIKMA公司)， 活性炭小柱(Supelclean公司)，弗罗里硅土(PR级， 60／100目，活化后含水 2％，Alltech公司)，柱色谱 用微晶纤维素粉(Serva公司)，水为超纯水。 铅、镉、砷、汞、铜单元素溶液， ．BHC，PC． NB， -BHC，卢一BHC，-BHC，PP'-DDE，OP DDT，PP - DDD，PP'-DDT，甲胺磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧化 乐果、久效磷、乐果、二嗪磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、 对硫磷、杀扑磷、乙硫磷，氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰 菊酯标准品均购自国家标准物质中心。同仁乌鸡白 凤丸 10批，由北京同仁堂股份有限公司北京同仁堂 制药厂提供。 2 方法和结果 2．1 同仁乌鸡白凤丸中重金属残留量的测定 2．1．1 标准贮备液的制备 将各单元素标准溶液用 2％硝酸溶液稀释成一 定浓度的标准贮备液，于低温保存，临用前稀释并制 备标准曲线。 2．1．2 供试品溶液的制备 取同仁乌鸡白凤丸，研细，精密称取 0．5 g于聚 四氟乙烯消解罐中，加硝酸 5．00 mL，混匀，盖好内 盖，旋紧外套，置 Mars 5微波消解仪内按以下程序 消解： 第 1步：温度 3 rain内从室温升至 110℃，保持 3 min； ． 2563． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第32卷第23期 2007年 l2月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica Vo1．32，Issue 23 December，2007 第 2步：温度3 rain内从 110℃升至 150℃，保 持3 rain； 第 3步：温度3 rain内从 150℃升至 180℃，保 持9 rain。 消解完毕后，使消解罐自然冷却至室温，置电热 板上 120℃加热至红棕色蒸气挥尽，并继续浓缩至 约2—3 mL，放冷，用水转移至25 mL量瓶中，并稀 释至刻度，即得供试品溶液。 2．1．3 铅、镉、铜的测定(原子吸收分光光度法) 照《中国药典))2oo5年版一部附录ⅨB‘‘砷、镉、 铅、汞、铜测定法”分别测定了同仁乌鸡白凤丸中 铅、镉、铜 的含量，其标准曲线 回归方程依次为 Y= 一0．000 008 X2 + 0． 003 51X + 0．004 0．r = 0．998 8；Y= 一0．001 947X2+0 ． 059 15X +0．006 2， r=1．000 0：Y = 一 0．009 935X + 0．117 78X + 0．000 6，r=0．999 7，测定结果见表 1。 表 l 同仁乌鸡白凤丸中铅 、镉、砷、汞、铜的残留量 2．1．4 汞的测定(原子荧光法) 2．1．4．1 测定条件 检测波长253．6 nm，空心阴 极灯工作电流为 60 mA，以含 0．2％硼氢化钠和 0．2％氢氧化钠的混合溶液(临用前现配)作为还原 剂，盐酸溶液(1—100)为载液，高纯氩为载气。 2．1．4．2 标准曲线的制备 精密量取汞标准储备 液(100 ng·mL )1 mL，置 100 mL量瓶中，加20％ 硫酸溶液20 mL，5％高锰酸钾溶液0．5 mL，摇匀，滴 加5％盐酸羟胺溶液至紫红色恰好消失，加水稀释 至刻度，摇匀。仪器自动配置标准曲线，浓度分别为 0，0．1，0．3，0．5，0．7，1．0 ng·mL～，测定荧光强度， 以荧光值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线， 其回归方程为Y=0．003 4X+0．007 0，r：0．999 7。 2．1．4．3 样品测定 精密量取供试品溶液 2 mL， 置 10 mL比色管中，加 20％硫酸2 mL，5％高锰酸钾 溶液0．1 mL，摇匀，滴加5％盐酸羟胺溶液至紫红色 · 2564· 恰好消失，加水稀释至刻度，摇匀。照标准曲线的制 备项下方法测定荧光值，从标准曲线上读出供试品 中汞的含量，计算，即得，结果见表 1。 2．1．5 砷的测定(原子荧光法) 2．1．5．1 测定条件 检测波长 193．7 nm，空心阴 极灯工作电流为60 mA，以含 1％硼氢化钠和0．3％ 氢氧化钠的混合溶液作为还原剂，盐酸溶液(1— 100)为载液，高纯氩为载气。 2．1．5．2 标准曲线的制备 精密量取砷标准储备 液(1 txg·mL )5 mL，用 2％硝酸溶液稀释至 100 mL。精密量取 5 mL。加 25％碘化钾溶液(临用前现 配)1 mL，摇匀，加 10％抗坏血酸溶液(临用前现配) 1 mL，摇匀，用盐酸溶液(20—100)稀释至25 mL，摇 匀，作为对照品溶液(10 ng·mL )。仪器 自动配 置标准曲线，质量浓度分别为 0，1，3，5，7，10 ng· mL～，测定荧光强度值，以荧光值为纵坐标，质量浓 度为横坐标，绘制标准曲线，其 回归方程为 Y= 0．016 2X +0．280 7。r=0．997 8。 2．1．5．3 样品测定 精密量取供试品溶液 5 mL， 照标准曲线的制备项下，自“加 25％碘化钾溶液 1 mL起”，依法测定，从标准曲线上读出供试品中砷 的含量，计算，即得，结果见表 1。 2．2 同仁乌鸡白凤丸中有机氯类农药残留量测定 2．2．1 GC色谱条件 EQ,ZU~ 一 1701 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 (0．25 txm×0．25 mm×30 m)，柱升温程序：初始温 度60℃，以60℃ ·rain 升至 180℃，再以5℃ · rain 升至210℃，保持 10 rain，以 15℃ ·rain 升 至250℃，保持5 rain，进样口温度220℃，不分流进 样，ECD检测器温度 300℃，载气高纯氮，柱流速 1．48 mL·rain～，吹扫气流速 3 mL·rain～，进样量 1．0 txL。有机氯对照标准品色谱图见图 1。 1 25 50 7．5 100 12 5 l5D l75 200 225 t／nin 图 1 有机氯类农药标准品色谱图 1．d·BHC；2．PCNB；3． 一BHC；4．卢一BHC；5．6-BHC； 6．PP'-DDE；7．OP'-DDT；8．PP 一DDD；9．PP 一DlYr 维普资讯 http://www.cqvip.com 第32卷第23期 2007年 12月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica V01．32．Issue 23 December，2007 2．2．2 样品的测定 取同仁乌鸡白凤丸，研细，精密称取 2 g，照《中 国药典》2005年版一部附录ⅨQ“农药残留量测定 法”测定了9种有机氯类农药残留量，结果部分样 品中检出Ot．BHC， ．BHC，6．BHC，PP'-DDE，其余有 机氯类农药均未检出，标准品标准曲线的回归方程 和测定结果分别见表2，3。为保证含量测定的可靠 性，随行制备了加样回收样品，取供试品2 g，精密加 入 200 ng·mL 的混合标准品溶液 1 mL，同法测 定，各标准品回收率见表2。 表 2 9种有机氯农药的回归方程和随行回收率 表 3 同仁乌鸡白凤丸中有机氯类农药残留量 测定结果(n=2) ⋯ ⋯ ． 有机氯类农药残留量／ g·kg-1 样品批号 —————————————— v_—v_——一 Ot—BHC B—BHC ~-BHC PP 一DDE 2．3 同仁乌鸡白凤丸中有机磷类农药残留量的测定 2．3．1 GC色谱条件 RESTEK Rtx 一 5 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 (O．25 m×0．25 mln×30 m)，柱升温程序：初始温 度6O℃，以3O oC·min 升至 120 oC，再以5℃ · min 升至 130 oC，保持3 min，以15 oC·min 升至 180 oC，保持5 min，以15 oC·min 升至 270 oC，保 持4 min，进样口温度250 cc，不分流进样，FPD检测 器温度 120 oC，载气高纯氮，柱流速 1．50 mL· min～，氢气流速90 mL·min～，空气流速115 mL· min～，进样量 1．0 wL。有机磷混合对照品色谱图 见 图 2。 图2 有机磷类农药对照品色谱 1．甲胺磷；2．敌敌畏；3．乙酰甲胺磷；4．氧化乐果；5．久效磷； 6．乐果；7．二嗪磷；8．甲基对硫磷；9．马拉硫磷；10．对硫磷； 11．杀扑磷；12．乙硫磷 2．3．2 样品的测定 取同仁乌鸡白凤丸，研细，精密称取 3 g，照《中 国药典》2005年版一部附录ⅨQ“农药残留量测定 法”测定了12种有机磷类农药残留量，结果 lO批样 品中均未检出有机磷类农药，标准品标准曲线的回 归方程见表4。为保证含量测定的可靠性，随行制 备了加样回收样品，取供试品3 g，精密加入浓度为 1 wg·mL 的混合标准品溶液O．5 mL，同法测定。 表 4 12种有机磷农药标准曲线的回归方程 2．4 同仁乌鸡白凤丸中拟除虫菊酯类农药残留量 的测定 2．4．1 GC．MS条件 色谱条件：DB-5弹性石英毛细管柱(0．25 wm ×0．25 mm×30 m)，柱升温程序：初始温度 6O℃， 以 3O oC·min 升至 120 oC，再以 1O oC ·min 升 至200 oC，以2 oC·min 升至 230 oC，以3O℃ · min 升至 280 oC，保持 7 min，进样口温度 250 oC， 不分流进样，载气高纯氦，柱流速1．40 mL·min～， 进样量 1．0 wL。质谱条件：负化学 电离离子源 (NCI)，电压 1．0 kV，温度 200 oC，选择离子(SIM) 模式监测：29．00—3O．00 min，选择碎片离子207(定 ． 2565· 维普资讯 http://www.cqvip.com 第32卷第23期 2007年 12月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica Vo1．32，Issue 23 December，2007 量离子)，171(定性离子)，对氯氰菊酯进行检测； 30．00～31．50 min，选择碎片离子211(定量离子)， 167(定性离子)，对氰戊菊酯进行检测；31．50～ 33．20 min，选择碎片离子79(定量离子)，137(定性 离子)，对溴氰菊酯进行检测，混合标准品的选择离 子扫描质谱图见图3。 ， 图3 拟除虫菊酯类农药对照品选择离子扫描质谱 1．氯氰菊酯(m／z：207)；2．氰戊菊酯(m／z：211)； 3．溴氰菊酯(m／z：79) 2．4．2 标准曲线的制备 分别精密称取氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯对 照品适量，加醋酸乙酯配制成 1 pLg·mL 的混合标 准品储备液，精密移取混合对照品储备液适量，加醋 酸乙酯逐步稀释成 1，10，50，100，200 ng·mL 的 混合对照品溶液，按上述色谱条件进样，每个浓度进 样 3次，以质量浓度 为横坐标，平均峰面积值 y 为纵坐标绘制标准曲线，各标准品回归方程见表 5。 表5 3种拟除虫菊酯类农药的回归方程和随行回收率 2．4．3 拟除虫菊酯类农药的测定 取同仁乌鸡白凤丸，研细，精密称取 2 g，照《中 国药典}2005年版一部附录ⅨQ“农药残留量测定 法”下“拟除虫菊酯类农药残留测定”项下方法制得 供试品，按上述色谱条件进样测定，部分样品中检出 氯氰菊酯，其余拟除虫菊酯类农药均未检出，结果批 号4030271，5035022，5035023的3批样品中氯氰菊 酯残留量 0．005，0．008，0．004 mg·kg～。为考察 含量测定的准确性，随行制备了加样回收样品，各标 准品回收率见表5。 3 讨论 中国、FAO／WHO、欧盟 对药材(或草药)中本 实验涉及的重金属及农药残留限量的规定与 10批 样品测定结果的最大值的比较见表 6，由表可知，所 测样品中重金属含量均未超过《中国药典》的限量 · 2566． 要求，而农药残留量均未超过《中国药典》和欧洲药 典的限量要求，因《中国药典》仅对少数农药规定了 限量，建议以《中国药典》和欧洲药典的限量为参考 分别对同仁乌鸡白凤丸中重金属和农药残留量进行 控制。 经比较实验，三步消解比一步消解效果好，故采 用三步操作制备重金属测定用供试品。另经考察发 现，在 120℃酸性环境中加热浓缩，砷、汞无损失。 汞的原子荧光测定中加入5％高锰酸钾将样品 中各种形式的汞氧化成同价态的汞，再与活泼态氢 生成氢化汞，汞化氢进一步被氢离子还原成原子态 汞进入吸收池测定。5％盐酸羟胺的作用是还原过 剩的高锰酸钾。 原子荧光法测砷时加入 25％碘化钾将溶液中 的各种高价态的砷还原为同价态的砷，然后与活泼 态氢生成氢化砷，进一步生成原子态砷用于测定。 碘化钾被氧化后生成的碘用 10％抗坏血酸还原，同 时，抗坏血酸对干扰金属离子也起到一定的掩蔽作 用。 因农药残留测定属痕量检测，环境、试剂和样品 中的其他成分均易造成干扰，所以应随行加样回收 实验，以确保结果的可靠性。对于农药残留测定，随 行回收率可接受的范围是 60％ ～140％ j，本实验 中用于测定拟除虫菊酯类农药随行回收率的溶液进 样前放置过久，可能导致被测成分分解，造成实验回 收率低。 因农药残留的测定为痕量检测，为排除假阳性 结果，采用另一极性的色谱柱对有机氯残留测定结 果进行验证。色谱条件为：DB-5弹性石英毛细管柱 (0．25 m×0．25 iTlrn×30 m)，柱升温程序：初始温 度 120℃，以30℃ ·min 升至 180℃，再以5℃ · min 升至210℃，保持 10 min，以 15℃ ·min 升 至240℃，保持5 min，进样口温度250℃，不分流进 样，ECD检测器温度 300℃，载气高纯氮，柱流速 1．00 mL·min～，吹扫气流速 3．00 mL·min～，进 样量 1．0 IxL。供试品在验证柱上检出的农药残留 峰与测定柱上检出的农药残留峰一致。因有机磷残 留均未检出，且随行 回收率均大于 70％，故无须对 结果进行验证。 曾尝试用气相色谱法(ECD检测器)测定拟除 虫菊酯类农药，但由于样品成分复杂，色谱干扰太 多，因此改用气质联用法测定，负离子化学电离和选 维普资讯 http://www.cqvip.com 第32卷第23期 2007年 l2月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese M~efia Medica Vo1．32，Issue 23 December，2007 注：”五氯硝基苯、五氯苯胺、甲基五氯苯胺硫酸盐的总量； ’乐果和氧化乐果的总量； 甲基对硫磷和甲基对氧磷的总量 择离子监测模式大大提高了灵敏度，且因质谱为专 [4]田金改'高天兵’张曙明，等-2种出口中成药中有机氯类农药 璺 测器，可不必采用另一极性色谱柱对结果进 [5] ．’ 黧 分析[J]．解 仃 验 让 。 放军药学学报 ，2002，IS(i)：56． [参考文献] 『6]郭素华 ，廖华军．闽产中成药中有机氯农药残留量的测定[J]． [1] 汪锡灿 ，周素娣，盛娟芬，等．中成药中有机氯农药残留量的 中成药 ，2005，27(2)：l61． GC法测定[J]-1996，27(1)：32- [7] 欧盟委员会 ． Quality control procedures for pesticide residues a一 [2] 韩桂茹，陈太平，杨建红，等．中药中有机氯农药残留量的研究 nalvsis『s] ． Guidlines for residues monitoring in the European U． [J]．中国中药杂志，1996，21(10)：591． nion ． No．SANCO／10476／2003，2006． [3] 张 炜，张汉明，郭美丽，等-几种中成药中有机氯类农药的残 【责任编辑 鲍 雷] 留分析[J]．第二军医大学学报，1999．20(4)：267． 欢迎登 、^ ·cjcmm· 录《中国中药杂志》网站： l 自 。 自 、 、 、 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