褪黑素抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡

褪黑素抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡 褪黑素抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细 胞凋亡 ?268?临床肾脏病杂志2006年12月第6卷第6期 JClinNephrolDecember2006,Vo1.6,No.6 褪黑素抑制高糖诱导的大鼠 肾小球系膜细胞凋亡 易晔朱忠华沈延春 【摘要】目的探讨褪黑素(MT)对于高糖诱导的肾小球系膜细胞(MC)凋亡中的作 用及机制. 光学显微镜观察大鼠MC凋亡的形态学变化;流式AnnexinV/PI双染法检测 不同浓度MT对 大鼠MC细胞凋亡率的影响;免疫细胞化学检测细胞色素C的达改变.结果MT 对30mmol/L 葡萄糖诱导的MC高凋亡率有明显的抑制作用,呈剂量依赖性关系;并能明显抑制 细胞色素C的表 达.结论MT可抑制高糖诱导的大鼠MC高凋亡率,这种作用部分通过调控细胞色 素C来实现的. 【关键词】褪黑素;凋亡;细胞色素C MelatoninprotectsratmesangialcellsfromapoptosisinducedbyhighglucoseYIYe,ZHUZh ong-hua, SHENYah— chun.DepartmentofNephrology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,Hua— zhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China [Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsandmechanismsofMelatoninontheapoptosis ofratmesangialcells(M.C)inducedbyhighglucose.MethodRatmesangialcellswereculture din DM_EMwithhighglucoseconcentration(30mmol/L)anddifferentconcentrationsofMelat onin(MT- lowdosegroup)MT-mildmoderatedosegroup)MT-highdosegroup)for72}LTheapoptosisratio wastesteelbyflowcytometryAnnexinV/PIdoublestains.TheexpressionofcytochromeCwastested byimmunohistochemicalmethod.ResultsExposedtOhighglucose(30rrmaol/L)for72h,ascom— paredtOcontrol(30.47?2.59),theapoptosisratioofMT-lowdosegroupwere24.43?1.70; MT-mildmoderatedosegroupwere20,07?1.93;MT-highdosegroupwere16.32?1.41%, fewerMCsunderwentapoptosis(P<0.01)inMTgroup.Itshowedadose-dependentmanner.As comparedtOcontro1.theexpressionofcytochromeCinmesangialcellsweresignificantlydecreasedin MTgroup.ConclusionsMelatonincaninhibittheMCsapoptosisinducedbyhighglucose(30mmol/ L),whichpartlyattributedtOloweringtheexpressionofcytochromeC [KeywordslMelatonin;Apoptosis;cytochromeC 糖尿病肾病晚期肾脏细胞凋亡往往与肾功能恶 化程度成正比l_1],抑制凋亡则可延缓肾小球硬化. 褪黑素(MT)是松果体分泌的神经内分泌激素,体 内众多器官系统均受其影响和调节,肾脏亦是其靶 器官之一.近年研究显示,MT对糖尿病肾病有明 显的保护作用,本研究选用大鼠MC为对象,探讨 MT对高糖诱导的MC凋亡的影响. 一 ,及试剂 材料与方法 作者单位:43~)22武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科 (易哗,朱忠华);江汉大学医学与生命科学学院(沈延春) 实验研究 大鼠MC株(HBZY一1,中国典型动物保成中 心)提供;褪黑素(美国Sigma公司);新西兰小牛血 清(FCS)及DMEM低糖培养基(美国Hyclone公 司);Annexin—V/PI(美国BD公司);兔抗大鼠细胞 色素C单克隆抗体,PBS缓冲液,胰蛋白酶,SP通 用试剂盒,DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有 限公司);Facscaliblr流式仪,Cellquset分析软件 (美国BD公司);HMIAS-2000型全自动医学彩色 图像分析系统.将MT12mg溶于0.5m1无水乙 醇中,加4.5m1无菌水至5m1,配成1()-3mmol/L 母液,用时稀释为工作液,4?冰箱保存. 二,方法 1.肾小球系膜细胞的培养大鼠MC接种于 无菌玻璃培养瓶内,加入含10灭活FCS的 2006年12月第6卷第6期JClinNephrolDecember2006,,o.!: DMEM(低糖)培养液,常规换液,分离和传代. 实验采用5,11代MC. 本各组图象分析结果见表1. 2.高糖诱导MC凋亡取对数生长期MC接 种于12孔板,细胞生长至7()融合时,用含1小 牛血清DMEM(低糖)培养液37?孵育24h,使细 胞生长同步进入休止期.分4组即高糖对照组,生 理剂量MT组(10,mmol/L),中等剂量MT组 (10,mmol/L),药理浓度MT组(10,mmol/L), 各组糖浓度均为30mmol/L.凋亡诱导与MT同 时作用于细胞72h. 3.形态学观察同上处理,倒置显微镜下观察 细胞形态. 4.流式AnnexinV/PI双染法检测MC凋亡率 同上处理细胞,作用72h后收集细胞,离心 (1000r/min)5rain.PBS洗涤细胞2次,使用结合 缓冲液悬浮细胞,调整细胞密度10,/ml;加入5l AnnexinVFITC及5lPI,避光室温孵育15rain, 流式细胞仪分析凋亡指数. 5.单克隆抗体细胞色素C免疫细胞化学检测 同法处理细胞,作用72h后PBS漂洗,4多聚甲 醛固定,SP法进行免疫细胞化学检测,DAB显色, 苏木素淡染细胞核.以PBS为一抗作阴性对照. 结果判断:细胞浆着棕黄色为阳性细胞.光学显微 镜观察摄片. 三,统计学处理 数据以均数?差(?s)表示,采用t检验; 多组间均数比较采用方差分析.应用SPSS11.0统 计软件进行分析.P<0.05为具有统计学意义. 结果 一 ,形态学观察 光镜下高糖组大量细胞由梭形变为圆形或椭圆 形,并由贴壁细胞变为悬浮细胞,以48,72h最为 明显.MT处理组细胞则保持不的梭形外观, 继续贴壁生长,以药理剂量组最为明显. 二,流式细胞仪检测凋亡率 与高糖对照组(30.47?2.59)相比,生理剂 量MT组(24.43?1.70);中剂量MT组 (20.07?1.93);药理浓度MT组(16.32? 1.41),凋亡率明显下降并呈现剂量依赖趋势(图 1). 三,免疫组化检测细胞色素C在系膜细胞表达 与高糖对照组相比,MT处理组细胞色素C表 达明显减弱,以药理浓度MT组最为明显(图2). -低糖对照组 -高糖处理组 a褪黑素10mmol/L组 -褪黑素10mmol/L组 a褪黑素10mmol/L组 注:与高糖对照组相比'P<O.05,"P<O.01; 与生理剂量MT组相比#P<0.01 图1不同浓度褪黑素对系膜细胞凋亡的影响 表1不同浓度MT对细胞色素C表达的影响(?) 注:与高糖对照组相比,P<().05 讨论 糖尿病肾病早期肾小球细胞增生伴细胞外基质 增多,此时机体通过凋亡来清除过度增生的细胞是 有益的,但病理状态下细胞凋亡过度致功能损害,细 胞数递减往往与肾功能恶化程度成正比【1],最终导 致肾小球硬化l_2].研究表明,糖尿病肾病发展过程 中,肾小球细胞呈逐渐减少之势与细胞凋亡有关_3?. 国外有研究发现,随着硬化的进展,肾小球内凋亡细 胞增加,并且根据存在的部位,推测凋亡细胞中一部 分是MC[43.Mattana等【5]证明,氧化的细胞外基质 和晚期糖基化终产物(AGEs)可使系膜细胞凋亡显 着增加.本研究证实,在高糖环境中培养肾小球 MC2472h后,细胞凋亡增多,与文献报道一 致_6J.所以高血糖能促进MC内形成超氧阴离子和 过氧化氢等活性氧,激活程序性细胞死亡],高糖环 境中培养的MC产生凋亡增加,氧自由基产生增 多,在糖尿病肾病发生发展中起重要作用].因此, 寻找一种能抑制MC凋亡的药物对于延缓肾小球 硬化的发生和进展具有重要的临床意义.Lang 等_8于1981年首次提出了MT和肾脏的直接联系, 其实验结果表明大鼠肾组织内存在MT受体.MT 是目前已知的抗氧化作用最强的自由基清除剂,国 外实验证明MT通过清除氧自由基,提高抗氧化酶 活性等途径,对药物,炎症,休克,缺血再灌注引起的 急性肾损坏有保护作用[9],也可降低糖尿病大鼠肾 临床肾脏病杂志2006年12月第6卷第6期JClinNephrolDecember2006,Vo1.6,No.6 组织及血浆中过高的脂质过氧化物水平,并改善糖 尿病大鼠肾小球病变,对糖尿病时的肾脏有明显的 保护作用_1仉". 细胞色素C是电子传递链复合体III的一个组 分,定位于线粒体内膜.研究表明,线粒体释放的细 胞色素C和凋亡诱导因子,能激活Caspase和核酸 内切酶;抗凋亡蛋白Bcl-2可阻止细胞色素C的释 放,减轻凋亡[1,证明细胞色素C的释放在凋亡中 的重要作用. 本实验结果显示,高糖培养的大鼠MC与MT 共孵育后,可使其过高的细胞凋亡水平降低,同时引 起细胞色素C表达下调,并呈剂量依赖性趋势.由 此可推测,MT可能通过阻断细胞色素C的释放进 而干预肾小球MC凋亡.MT脂溶性高,血浆蛋白 结合率低,极易透过生理屏障渗透进人机体的各种 组织,发挥广泛的作用,可经口服,静脉注射,滴鼻, 口腔粘膜等途径给药.口服后1h达峰值,后进人 消除相,半衰期为30~50rain.MT安全范围大,有 患者口服1g/d连续30d,对眼,肝,肾,骨髓等全面 检查未见明显的毒性反应. 综上所述,MT不仅可降低高糖诱导的大鼠 MC高凋亡率,延缓肾小球硬化;而且给药方便,无 明显毒副作用,适用于糖尿病肾病的临床治疗,值得 进一步研究. (本文图2见.封三) 参考文献 1Ortiz八Apoptotieregulatoryproteinsinrenalinjury.Kidney Int,2000,58:467—485. 2ZhangW,KhannaP,ChanLL,eta1.Diabetes2inducedapopto— sisinratkidney.BiochemMolMed,1997,61:582-621. 3WolfG,ZiyaiiehFN,Ziyade}LMolecularmechanismsofdiabet2 inrenalhypertrophy.KidneyInt,1999,56:3937—3938. 4高清.肾小球硬化研究进展.现代医药卫生,2003,19:700—701. 5MattanaJ,KochlatyiS,GibbonsNM,eta1.Catalyzedoxidation ofextracellularmatrixproteinspromoteshumanmesangialcell apoptosisandisassociatedwithenhancedexpressionofBaxand caspaseactivation.BiochemBiophysResCommun,2002,292: 652—658. 6KangBP,FrencheS,ReddyV,eta1.Highglucosepromotes mesangialcellapoptosisbyoxidant—dependentmechanism.AmJ PhysiolRena1Physiol,2003,284:455—466. 7LeeHB,YuMR,YangY,eta1.Reactiveoxygenspeciesregu— latedsignalingpathwaysindiabeticnephropathy.JAmSoc Nephrol,2003,14:S241—245. 8LangU,AubertML,SizonenkoPC.Location0fmelatoninre— ceptors(abstract).PaediatrRes,1981,15:80—81. 9CuzzocreaS,ReiterRJ.Pharmacologicalactionofmelatoninin shock,inflammationandischemia/reperfusioninjury.EurJ Pharmaeol,2001,426:1-10. 10张立斌,张慧,刘志民,等.褪黑素对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的 抑制作用.中华内分泌代谢杂志,2003,19:602—621. 11CamM,YavuzO,GuvenA,eta1.Protectiveeffectsofchronic melatonintreatmentagainstrenaliniuryinstreptozotocin2in— duceddiabeticrats.JPinealReser,2003,35:212-220. 12SerelTA.OzgunerF,Soyupeks.Preventionofshockwavein— ducedrenaloxidativestressbymelatonin:anexperimentalstud— UrolRes,2004,32:692—711. 13GreenDR,Reedjc.Mitochondriaandapoptosis.Science.1998. 281:1309—1312. (收稿日期:2006—05—26修回日期:2006—08—16) 《临床肾脏病杂志》征订启事 《临床肾脏病杂志》是由着名的肾脏病专家孙世澜教授主编,众多国内着名教授任顾问和编委的专业性学 术刊物,国内外公开发行. 本刊主要介绍原发和继发性肾病,高血压,水及电解质代谢,血液净化等领域的新动向,新技术,新成果, 新的检测方法和药物应用进展.主要栏目有述评,论着,实验研究,中西医结合,专家笔谈,诊治经验,综述,讲 座等. 经中国科学技术信息研究所信息分析研究中心对期刊多项科学计量指标的综合定量评定及严格的同行 专家评议推荐,本刊被评定为主垦燕窒筮盐鎏塑型i史垦筮塑型),并收录国家科技部中国科技论 文与引文数据库(CsTPc). 本刊为双月刊,每双月28日出版.大16开,48页.每册定价5.O0元,全年3O.OO元.中国标准刊号: ISSN1671—2390,CN42—1637/R;邮发代号:38—375;订购单位:全国各地邮 局.2007年若有漏订,请直接与 编辑部联系. 编辑部地址:武汉市胜利街155号,联系电话:027— 82784570.E-mail:sb430014@yahoo.co札cn 褪黑索抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋L: 图2电恤IfL…末cn茉聪把{ 抗ThyI肾小球肾炎大鼠抗MIF对TGFDl表达的影响 围3'~J}TGF表述免瘴染包:0对照组大恩TGF一川染色仪有少量阳性物匝帆 积:I]ATG组 '阿小球系髓TGFpI船色强阳性一抗MIF蛆肾小球染色阳性物沉租明显减少 fx_J?fI_ ...^耷置鬣 . ' . . _蠡 , , 一韶磐一一一麓鼢