GBT 26436-2010 禽白血病诊断技术

ICS11．220 B41 园亘 中华人民共和国国家 GB／T26436—2010 2011-01-14发布 禽白血病诊断技术 Diagnostictechniquesforavianleukosis 2011-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学寿 中国国家标准化管理委员会况111 前 言 GB／T26436—201 0 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G、附录H为资料性 附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SC／TC181)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学。 本标准主要起草人：崔治中、孙淑红、赵鹏、杨素、沙才华、廖明、曹伟胜。 GB／T26436--2010 引 言 禽白血病病毒(avianleukosisviruses；ALV)为反转录病毒科的n反转录病毒属，可诱发鸡不同组 织的良性和恶性肿瘤，是鸡群中除马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)外的又一 类重要的致肿瘤病毒。 禽白血病是一类由ALV相关的反转录病毒引起鸡的不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。随发生 肿瘤的主要细胞成分不同，分别称之为不同名称的肿瘤。ALv可分为A～J10个亚群，其中仅A亚 群、B亚群、c亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡相关。A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群属外 源性ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒基因组可完整地整合进感染鸡的染色体 基因组并稳定地遗传下去，也可从中再复制出传染性病毒颗粒，因而称之为内源性病毒。此外，在一些 鸡的染色体的不同部位，还可能带有一些ALV的基因组片段。E亚群ALv的致病性很低或没有致病 性，不属于净化对象，但很多鸡群中包括一些无特定病原(SPF)鸡群都可能带有E亚群内源性ALv，它 的感染不会给鸡群带来不良影响，但会干扰检测。 目前，该病对我国养鸡业的危害很大。在国际种禽贸易中，外源性白血病病毒感染是最主要的检测 对象之一。 Ⅱ 1范围 禽白血病诊断技术 本标准规定了病料中ALV特异血清抗体和外源性ALV的检测方法。 本标准适用于判断鸡群或病料中是否有外源性ALV感染。 2临床症状和病理变化 GB／T26436—201 0 ALv主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率和发病死亡率高低不等，死亡率最高可 达20％。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。 淋巴样白血病是最为常见的经典型白血病肿瘤，肿瘤可见于肝、脾、法氏囊、肾、肺、性腺、心、骨髓等 器官组织，肿瘤可表现为较大的结节状(块状或米粒状)，或弥漫性分布细小结节。肿瘤结节的大小和数 量差异很大，表面平滑，切开后呈灰白色至奶酪色，但很少有坏死区。在成红细胞性白血病、成髓性细胞 白血病、髓细胞白血病中，多使肝、脾、肾呈弥漫性增大。J亚群ALV感染主要诱发髓细胞样肿瘤，它最 常见的特征性变化主要为肝脾肿大或布满无数的针尖、针头大小的白色增生性肿瘤结节。在一些病例 中，还可能在胸骨和肋骨表面出现肿瘤结节。 单纯苏木精伊红染色(H．E染色)的病理组织切片观察在诊断上有一定参考意义。在表现为淋巴 样细胞肿瘤结节时，要注意与马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)诱发的肿瘤相 区别；在表现为髓样细胞瘤时，既要与REV诱发的类似肿瘤细胞相区别，也要与嗜中性白细胞浸润性 炎症相区别，如鸡戊型肝炎病毒感染引起的肝局部炎症。最终的鉴别诊断以肿瘤组织中的病毒抗原检 测或病毒分离鉴定为最可靠依据。 3病毒的分离培养、检测和鉴定 3．1试剂和仪器 3．1．1试剂 DMEM液体培养基(pH7．2)、0．25％胰酶、磷酸盐缓冲液(o．01mol／LPBS，pH7．2)、抽提缓冲液、 青霉素(10万u／mL)、链霉素(10万U／mL)、抗ALV单抗、抗ALV单因子鸡血清、异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的山羊抗小鼠IgG抗体、ALV-p27抗原酶联免疫吸附试验(ELIsA)检测试剂盒、聚合酶链 反应(PCR)试剂、RT-PCR试剂、生理盐水(0．9％氯化钠)、无水乙醇(分析纯)、丙酮(分析纯)、甘油(分 析纯)、75％酒精、碘酒、细胞生长液(含有5％胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基)、细胞维持液 (含有1％胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基)、大肠杆菌(TGl)、蛋白酶K、70％冷乙醇、乙酸 钠(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、异戊醇(分析纯)、异丙醇(分析纯)、10×加样缓冲液、琼脂糖、DL2000 DNAMarker、TAE电泳缓冲液、氯化钙(o．1mol／L)、氨苄青霉素(100／-g／tLL)、双蒸水、LB液体培养 基、TE缓冲液、RNase、细胞裂解液、0．1％的DEPC(焦碳酸乙二酯)水等(除特殊说明外，上述试剂均为 分析纯)。 3．1．2仪器 锥形瓶、荧光显微镜、恒温培养箱，冰冻台式离心机(≥12000r／min)、一20℃冰箱、一80℃冰箱、 1 GB／T26436—2010 Eppendorf管(离心管)、棉棒、载玻片、盖玻片、细胞培养平皿、37℃数显恒温水浴锅、37℃摇床、96孔 培养板、SPF隔离器、紫外光凝胶成像分析仪、微量移液器、低温恒温水槽(16℃)、吸水纸。 3．2分离病毒用细胞 3．2．1鸡胚成纤维细胞(CEF) 鸡胚成纤维细胞制备方法见附录A。 3．2．2鸡胚成纤维细胞自发永生株(DFl)细胞 DFl细胞培养基制备方法见附录B。 3．3病料的采集与处理 3．3．1全血、血清或血浆 取疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清，无菌接种于长成单层的CEF或DFl，置于含5％ 二氧化碳的37℃恒温培养箱中培养。 3．3．2脏器 采集疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏，按脏器质量的1倍～2倍加入灭菌生理盐水(含青霉素和链霉素 各1000Iu／mL)研磨，直至成匀浆液。将悬液移至离心管中充分摇振后，4℃，10000r／rnin离心 5min，收集上清液。按3．4．1．1中的方法接种培养或一70℃保存备用。 3．3．3疫苗样品 疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV，应接种DFl细胞或其 他抗E亚群自血病鸡细胞(C／E)鸡来源的细胞。 3．3．4咽喉、泄殖腔棉拭子 取咽喉棉拭子时，将棉拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；取泄殖腔棉拭子 时，将棉拭子深入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便；将棉拭子头一并放人盛有1．5mL磷酸盐缓冲液的无 菌离心管中(含青霉素和链霉素各1000Iu／mL)，盖上管盖并编号，10000r／rain离心5rain后取上清 备用。 3．4病毒的分离培养与鉴定 3．4．1病毒的分离培养 3．4．1．1接种培养：病料接种细胞单层后，置于37℃培养箱中培养2h。然后吸去细胞生长液，换入细 胞维持液，继续培养5d～7d。 3．4．1．2细胞传代：将3．4．1_1培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养5d～7d。 3．4．2病毒的鉴定 3．4．2．1间接免疫荧光抗体反应(IFA) 3．4．2．1．1固定 将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酮一乙醇(6：4)混合液室温固定5min，待其自然干 2 燥，用于IFA，或置于--20℃保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。 3．4．2．1．2加第一抗体 GB／T26436--2010 用0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)将单克隆抗体(如抗ALV-J亚群特异性单克隆抗体)或抗 ALV单因子鸡血清(抗ALV单因子鸡血清的制备见附录c)稀释到工作浓度，在37℃水浴箱作用 40rain，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。 3．4．2．1．3加FITC标记二抗 按商品用磷酸盐缓冲液稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体(当第 一抗体为ALV特异性单克隆抗体，选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体；当第一抗体 为鸡抗ALV单因子血清，则选用FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体作为第二抗体)。37℃水浴箱作用 40rain，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。 3．4．2．1．4加甘油 滴加少量50％甘油磷酸盐缓冲液于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。在荧光显微镜下 观察。 3．4．2．1．5结果观察与判定 被感染的CEF细胞内呈现亮绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在放大200×～ 400×时，可见被感染细胞胞浆着色，判为ALV阳性，无亮绿色荧光者判为阴性。 3．4．2．2ALV—p27抗原ELISA检测 3．4．2．2．1抗原样本制备 将病料同3．4．1．1和3．4．1-2所述方法接种细胞，培养7d～14d后取上清液直接检测；也可取细 胞培养物冻融后检测；或用从泄殖腔采集的棉拭子。 3．4．2．2．2p27抗原ELISA检测 ALV—p27抗原可用商品试剂盒检测，对不同来源的样品，按厂家的说明书操作。当样本在DFl细 胞或CEF(C／E品系)上检测出ALV-p27抗原时，判为外源性ALV阳性，否则判为阴性。直接用泄殖 腔棉拭子样品检测出p27，说明有ALV，但不能严格区分外源性或内源性。 3．5 ALV亚群鉴定 3．5．1利用J亚群ALV特异性单克隆抗体进行IFA检测，可以鉴定J亚群ALV，但不能鉴别其他 ALV亚群如A亚群、B亚群、C亚群、D亚群。 3．5．2对分离到的病毒用RT—PCR(上清液中的游离病毒)或PCR(细胞中的前病毒cDNA)扩增和克 隆囊膜蛋白gp85基因，测序后与基因序列数据库(GeneBank)中的已知A亚群、B亚群、C亚群、D亚群 的gp85基因序列做同源性比较，即可对病毒进行分群。ALV病毒分群方法见附录D。 3．6荧光定量PCR扩增ALV-J 该方法适用于鸡群的检疫或ALv-J感染的净化，可在较短时间内完成大量样品的特异性检测。血 浆或泄殖腔棉拭子样品可直接用于检测，见附录E。 GB／T26436—2010 4血清特异性抗体的检测 4．1仪器和试剂 4．1．1试剂：磷酸盐缓冲液洗液、禽白血病抗体ELISA检测试剂盒、FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体、 甘油。 4．1．2仪器：酶标仪、荧光显微镜、37℃恒温培养箱。 4．2样品的采集 样品的采集见3．3。 4．3抗体的检测 4．3．1ELISA检测 可选用禽白血病A亚群、B亚群及J亚群抗体ELISA检测试剂盒，严格按商品提供的说明书操作 和判定。 4．3．2IFA检测 4．3．2．1抗原 抗原制备方法见附录F。 4．3．2．2操作步骤 在相应的盖玻片上或抗原孔中加入用磷酸盐缓冲液(1：50)稀释的待检鸡血清，在37℃下作用 40min，用磷酸盐缓冲液洗涤三次。再加入工作浓度的FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体(第二抗体)，在 37℃作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加少量50％甘油磷酸盐缓冲液后在荧光显微镜下观察。 4．3．2．3结果的判定 结果的判定方法同3．4．2．1．5。不论是商品鸡群还是SPF鸡群，只要检出A亚群、B亚群及J亚群 抗体阳性的鸡，就表明该群体曾经有过外源性ALv感染。 附录A (规范性附录) O系SPF鸡胚成纤维细胞(cEF)的制备 GB／T26436—201 0 选择9日龄～10日龄发育良好的SPF鸡胚。先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出 鸡胚，去头、四肢和内脏，放人灭菌的玻璃器皿内，用无血清的DMEM液洗涤胚体。用灭菌的剪刀剪成 米粒大的小组织块，再用无血清的DMEM液洗2次～3次，然后加0．25％胰酶溶液(每个鸡胚约加 1 mL)，在37．5℃～38．5℃水浴中消化10min～15min。吸出胰酶溶液消化产生的悬液，再加入适量 的营养液(用无血清的DMEM液，加青霉素、链霉素200IU／mL～500Iu／mL)吹打，用4层纱布滤过。 取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数，其余在l000r／rain下离心5rain。将细胞沉淀再混悬于细胞培 养液中，制成每毫升含活细胞数约100万～150万的细胞悬液，分装于培养瓶(皿)中，进行培养，形成单 层后备用(一般在24h内应用)。 GB／T26436--2010 附录B (规范性附录) DFl细胞培养基配制 B．1商品化的DMEM液，pH7．2，加5％胎牛血清。青霉素、链霉素：各250Iu／mL。 B．2培养条件：37℃，5％二氧化碳。 附录C (规范性附录) 抗ALV单因子鸡血清的制备 GB／T26436--201 0 选择经鉴定无任何其他潜在病毒的ALV参考株作为种毒(如经ALv_J全基因组cDNA克隆质粒 DNA转染SPF鸡的CEF所产生的分子克隆化ALV)，接种C／ECEF后复制和扩增病毒。病毒接种 CEF继续培养5d后，再传代一次。将传代长成单层的CEF换成含1％小牛血清的DMEM维持液，继 续培养72h～96h后收取上清液(通常可达到最高病毒效价)，分装在离心管中，每支1mL，于一70℃ 冰箱保存。2d～3d后，取出一支，用细胞培养液作10倍系列稀释后，分别接种于含有新鲜配制的CEF 单层(细胞覆盖面应70％)96孔培养板上，每个稀释度8孔。在37℃下培养6d后，弃上清液，用磷酸 盐缓冲液洗一次后，加入预冷的丙酮一乙醇(6：4)固定。待自然干燥后，用抗ALv_J的单克隆抗体进行 IFA(见3．5)，以IFA的结果来判定病毒感染的终点，测定其中ALv的组织细胞半数感染量(TCIDs。)。 选用6周龄以上SPF鸡，SPF隔离器饲养。每只鸡皮下接种104个TCID；。的ALv悬液。4周～ 6周后采集血清。IFA抗体滴度应≥1：i00。 GB／T26436—2010 D．1 克隆载体和宿主菌 附录D (规范性附录) ALV亚群鉴定程序 商品化的PCR产物克隆载体质粒，或其他类似载体质粒。可用多种大肠杆菌作为宿主菌，如 TGl等。 D．2病毒模板的制备 按照以下程序或商品化提取细胞DNA试剂盒的说明书提取细胞DNA。 1)接种病毒的细胞经磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入适量0．25％胰酶，37℃温箱中放置5rain 10min，将细胞消化吹打后收集于1．5mL离心管中。 2)2000r／min离心收获细胞，然后加入500pL抽提缓冲液(100mmol／L氯化钠，10mmol／L Tris．C1pH8．0，25mmol／LEDTApH8．0，0．5％SDS)悬浮后，加入5pL蛋白酶K (100btg／mL)，56℃水浴中消化5h。 3)加入等体积的苯酚一三氯甲烷溶液(苯酚：三氯甲烷；异戊醇一25：24：1)约500“L抽提一 次，将上层液体转移到另一1．5mL离心管中，加入1／10体积3mol／L的乙酸钠和2倍体积 无水乙醇后，置于一20℃冷却2h或者更长时间。 4)取出后12000r／min离心10rain沉淀DNA，弃去上清液。再小心加入70％冷乙醇轻洗DNA 沉淀，弃去上清液。 5)经乙醇沉淀后的DNA，空气中室温自然干燥后，溶解于50pL双蒸水中，即为模板DNA。 D．3囊膜蛋白eny基因的扩增 D．3．1引物 可根据已发表资料合成扩增ALV—J的前病毒DNA特异性PCR引物，本例示范引物为： 正向引物：5，_CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT一37，相当于ALV·J原型毒株HPRS-103前病 毒基因组DNA序列的第5394对～第5416对碱基。 反向引物：5『_AGTTGTcAGGGAATcGAC-3’，相当于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基因组 DNA序列的第7811对～第7794对碱基。 引物用双蒸水稀释为25pmol／pL，一20℃保存备用。 D．3．2PCR 以第D．2章中提取的细胞DNA为模板，扩增ALV—J的囊膜蛋白基因(env)特异性2．2kb条带，其 PCR反应体系(50pL)见表D．1。 8 表D．1ALV-Jenv基因PCR反应体系 GB／T26436—201 0 组 分 体积／儿 双蒸水 30．5 10×缓冲液(无Me+)(成分：100mmol／LTris．CIpH8．0，500mmol／L氯化钾，1％明胶) 5 氯化镁(15retool／L) 4 dNTPs(2．5retool／L) 4 正向引物(25pmol／t-L) 2 反向引物(25pmol／t-L) 2 DNA聚合酶(5U／t1L) 0．5 模板DNA(约100ng／／1L) 2 总体积 50 将上述成分分别加入灭菌的PCR管中，轻轻混和均匀，离心后置于PCR扩增仪。按照以下扩增程 序进行反应： 首轮循环：95℃5rain，50℃1min，72℃1min； 中间循环：95℃1min，50℃1min，72℃2min30s，进行30个循环； 72℃延伸10rain；4℃保存。 D．3．3PCR产物DNA电泳 用微量移液器取4．5止PCR产物加入0．5儿的10×进样缓冲液(o．25％溴酚蓝，0．25％--甲苯 苯胺，15％聚蔗糖400)，在浓度为0．8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，同时在另一加样孔加入5tLL DL2000DNAMarker。在TAE电泳缓冲液中，90v电压，电泳50min后，于紫外光凝胶成像分析系 统中观察并结果。 D．3．4PCR产物的回收与定量 可采用商品化PCR产物回收试剂盒进行回收。 1)将病毒e”。基因的PCR产物在0．8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，90V电压，电泳50rain。 2)将目的条带切割下来，置于已经称重的1_5mL离心管中。 3)再次称重，计算含目的条带的凝胶块的质量。 4)按每毫克加入100tLLUltraSalt，在55℃～65℃水浴锅中使琼脂糖凝胶融化。 5)加入5pLGlassMilk，混匀后室温下放置5min。 6) 12000r／min离心，去掉上清液。 7)加人1mLUltraWash洗涤沉淀。 8) 12000r／min离心，去掉上清液。再次离心，用微量移液器吸出剩余液体。 9)干燥后，加入15pL双蒸水，用微量移液器吹打混匀后，室温下放置5min，12000r／min离心， 将上清液转移至另一离心管中。 10)取1pL回收产物在0．8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，另加5pLDL2000DNAMarker，用以 估计回收DNA的浓度。 GB／T26436—2010 D．4 PCR产物的克隆 D．4．1连接反应 将载体与纯化回收PCR产物于16℃下连接6h～8h。 连接体系为： 载体 25ng 纯化Pn"基因PCR产物 100ng 溶液I 5pL 加双蒸水至 10pL D．4．2质粒转化用感受态大肠杆菌的制备 用氯化钙法制备大肠杆菌TGl菌株的感受态细胞，步骤简述如下： 1)一个盛约50mLLB液体培养基的锥形瓶，接种大肠杆菌TGl菌株，在37℃恒温振荡器中振 荡培养至半浑浊半透明状态。 2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的--20℃保存的50mL离心管中，冰上放置10rain，使 培养物冷却至0℃。 3)4℃以4000r／min离心10min，回收细菌细胞。 4)倒出上清液，将管倒置1min，以使残余的培养液流尽。 5)用10mL用冰预冷的O．1mol／L氯化钙重悬每份沉淀，冰浴上放置30min。 6)4℃以4000r／min离心10min，回收细菌细胞。 7)倒出上清液，将管倒置1min，以使残余的培养液流尽。 8)每50mL初始培养物用lmL用冰预冷的0．1mol／L氯化钙重悬每份沉淀，4℃保存备用。 D．4．3质粒的转化 将D．4．1中得到的连接产物转化大肠杆菌，步骤简述如下： 1)10pL连接产物加入200pL新鲜制各的TGl感受态细胞中，混匀内容物，冰浴上放置 30min。 2)放人42℃循环水浴中，准确热激90s。 3)快速转移到冰浴中，使之冷却2min～3min。 4) 每管加LB培养基800pL，在37℃摇床上(转速不超过225r／min)，温育45min，使细菌复苏。 5)取200pL菌液均匀涂布到含有100pg／pL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。 6)将平板置于37℃温箱中培养12h，挑取单个菌落培养后，进行质粒DNA的制备与鉴定。 D．5质粒DNA的提取和鉴定 D．5．1质粒DNA的提取 挑选平板上的白色菌落，接种至氨苄青霉素浓度为50t-g／mL的5mLLB液体培养基中，于37℃ 摇床上振荡培养6h，提取质粒。 1)菌体的收集： a)将培养液倒人1．5mL离心管中，12000r／min，离心1min，倒掉上清液。 b)用1mLTE缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。 】O GB／T26436—201 0 2)将沉淀悬浮于100pL用冰预冷的溶液I，在振荡器上强烈振荡混匀。 3)加200pL溶液1I(不超过5min，溶液Ⅱ需现配)，颠倒5次(不要强烈振荡)，冰浴中放置 3min。 4)加150pL溶液Ⅲ，温和振荡10S，冰浴中放置3min～5min。 5)12000r／min离心5min，将上清液转移至另一离-Ii,管中，加入等体积的苯酚一三氯甲烷，在振 荡器上振荡混匀。 6) 12000r／min离心5min，将上清液转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。 7)12000r／min离心10min～15min，用1mL70％乙醇漂洗沉淀，干燥DNA沉淀。 8)用50pL双蒸水或TE缓冲液溶解沉淀，同时加入0．5btL～lpLRNase。--20℃保存备用。 D．5．2重组质粒DNA的酶切鉴定 质粒以EcoRI和HindⅢ这两种酶进行双酶切鉴定。 酶切体系如下： 总体积 20pL 质粒DNA 双蒸水 lo×缓冲液K EcoRI HindⅢ 10“L 7“L 2uL 0．5“L 0．5“L 以上组分混匀后，轻微离心，37℃酶切2h。于0．8％的琼脂糖凝胶中90V电泳45rain，在凝胶成 像系统下观察并记录结果。 D．6克隆序列的测定 将上一步经EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定的阳性克隆测序。所得序列与GeneBank中发布的 ALv的A亚群、B亚群、c亚群、D亚群、E亚群和J亚群的囊膜蛋白gp85基因做同源性比较分析，并 确定属于哪个亚型。可参考的GeneBank中序列编号分别为：M37980和DQ365814(A亚型)； AF052428(B亚型)；J02342(C亚型)；D10652(D亚型)；M12172、EF467236和AY013303(E亚型)； Z46390、AF247391、DQll6805、AY897219和EU264064(J亚型)。对于A亚群、B亚群、c亚群、D亚 群和E亚群，核苷酸或氨基酸的同源性应分别大于90％，与哪个参考亚型的同源性最高，即确定是这个 亚型。对于J亚群，应与大多数已知J亚群序列的同源性大于80％。 GB／T26436—2010 E．1试剂 附录E (规范性附录) 荧光定量PCR扩增ALv_J 引物和探针序列： 选择ALv—J特异性env基因序列作为ALv_J检测的靶序列，产物长度为138bp。 上游引物：5’AGAAAGACCCGGAGAAGAC3’； 下游引物：5’AcAcGTTTccTGGTTGTT3’； TaqMan探针：5’ATTTCCGTTGTccCAGGGGTGG3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ。 E．2样品采样和前处理 样品采样和前处理见3．3。 E．3 核酸抽提及荧光定量PCR检测 E．3．1注意事项 实验室注意事项参见附录G。 E．3．2核酸抽提 1)取n个灭菌的1．5mLEppendorf管编号(n为被检样品与阴性对照、阳性对照之和)。 2)每管加入600pL细胞裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200pL，再加入 200pL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混 匀)。于4℃、12000r／rain离心15min。 3)取与E．3．2的1)相同数量灭菌的1．5mLEppendoH管，加入400止异丙醇(--20℃预冷)， 做标记。吸取E．3．2的1)各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500pL，尽 量避免吸出中间层，颠倒混匀。 4)于4℃、12000r／rain离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去 上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干)}加人600／-L75％乙 醇，颠倒洗涤。 5)于4℃、12000r／min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去 上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干)。 6)4000r／min离心10s(EppendoH管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体 甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温下干燥 5min～10min。 7)加入15pLDEPC(焦碳酸乙二酯)水，溶解管壁上的RNA，5000r／min离心5S，冰上保存备 用。若需长期保存则需放置在一70℃冰箱。 E．3．3扩增检测 E．3．3．1扩增试剂准备 GB／T26436—2010 在反应混合物配制区进行。 取出J亚群禽白血病病毒一步法荧光定量RT—PCR检测试剂盒(参见附录H)，在室温下融化后， 6000r／rain离心5s，每个PCR反应按表E．1所示用量配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样 本个数+阴性对照+阳性对照+1)。 表E．1 PCR反应体系 试 剂 用量／pL RT-PCR反应液 14．5 Taq酶(5U／pL) 0．25 逆转录酶 0．25 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装15pL 转移至样本处理区。 E．3．3．2加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸10pL，盖上管盖，将PCR管放 人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。 E．3．3．3PCR扩增检测 在扩增检测区进行。 E．3．3．4反应条件 第一步：42℃30rain，95℃5rain； 第二步：95℃10s，55℃10s，72℃30s，5个循环 第三步：95℃5s，60℃30s，40个循环； 60℃时设置采集荧光。 E．3．3．5荧光素设定 基团(reportdye)设定为FAM，淬灭基团(quenchdye)设定为BHQ(或Tamra或Eclipse)，参 考标记物(referencedye)设定为None。 E．4分析条件设定及结果判定 E．4．1质控标准 E．4．1．1综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，周值 (threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情 况进行调整，选择FAM通道进行分析。 E．4．1．2ALV_J阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照有s型PCR扩增曲线，而且ct值(每个反 应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数)≤30；阴性对照无s型PCR扩增曲线，且ct 13 GB／T26436—2010 值为无。否则此次试验结果无效。 E．4．2结果判定及描述 E．4．2．1有S型PCR扩增曲线，且Ct值≤30的样本为阳性，表明ALv-J核酸阳性。无s型PCR扩 增曲线，且ct值为无的样本为阴性样本，表明ALV-J核酸阴性。 E．4．2．2对于30