Leber遗传性视神经病变11778突变家系异质性的研究

582 Chin Ophthal Res，July 2009，Vo1．27，No．7 · 调 查 研 究 · Leber遗传性视神经病变 1 1778突变家系异质性的研究 杜利平 马 旭 金学民 Heteroplasmy of Leber’S hereditary optic neuropathy families with 1 1778 m utation Du Liping，Ma Xu，Jin Xuemin．Department of ophthalmology，Affiliated First Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052，China Abstract Objective Leber’S hereditary optic neuropathy (LHON)is a maternally inherited blindness occurring predominantly in young adult males．The disease is typically characterized by acute or subacute visual loss，and penetrance vary among different pedigrees and even members in the same family．The gene mutation，other factors such as secondary gene，level of mtDNA mutation and／or environment also are associated with the development of the disease．This study was to investigate the heteroplasmy of 1 1778 mutation families in LHON and analyse its influence on prevalence and vision． Methods Five families of LHON with 1 1 778 mutations，including 68 maternal members and 27 affected patients，were studied，in which 66 maternal members with symptom were examined．Polymerase chain reaction(PCR)，restriction endonuclease digestion，denaturing high performance liquid chr0matography(dHPLC) were used to study the heteroplasmy in the maternal members，and the correlations between heteroplasmy and prevalence or vision were analysed． Results In the 5 families，2 families were homoplasmic mutation，including 24 maternal members and 1 0 patients，and 3 families were beteroplasmy which included 42 maternal members and 1 7 patients．No statistical difference was found in the prevalence between heteroplasmic and homoplasmic material members ()( =0．159，P =0，690)．No significant difference was detected in the IogMAR vision between the heteroplasmic and homoplasmic patients(t：0．543，P：0．59)． Conclusion Heteroplasy in LHON with 1 1778 mutation does not influent the prevalence and the prognosis of vision． Key words Leber’S hereditary optic neuropathy；gene mutation；heteroplasmy 摘 要 目的 研究 Leber遗传性视神经病 变(LHON)11778点突变家系 的异质性 ，分析异 质性对 LHON的发病率和 患者视力的影响。 方法 研究 5个 11778点突变 LHON家系，其中母系成员 68例，发病者 27例；除2例携带者外，66 例母系成员接受检查。应用聚合酶链式反应、限制性核酸内切酶酶切、变性高效液相色谱分析等技术，分析家系之间突 变的异质性以及异质性与发病和视力预后的关系。 结果 在 5个家系中，2个家系为同质突变(纯合突变)，包括 24例 母 系成员和 10例患者 ；3个家系为异质突变 (杂合突变 )，包括 42例母 系成员和 l7例 患者。同质突变 和异质突变母 系 成员之间 LHON 的发病率 比较 ，差异 无统计 学意义 ；2种突变 患者 之间 的视 力 比较 ，差异亦 无统 计学意 义。 结 论 LHON患者 l1778的突变存在异质性 ，但其异质性对发病和视力预后均无影响。 关键词 Leber遗传性视神经病变 ；基因突变；异质性 分类号 R 774 Q 812 文献标识码 A 文章编号 l003．0808(2009)07—0582-05 Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及青年人的常见的遗 传性致盲性眼病。约 95％的 LHON携带 3个原发线 粒体 mtDNA点突变中的一种，即 11778 、14484 和 作者单位：450052郑州大学第一附属医院眼科[杜利平(博士研究 生，现在中山大学中山眼科中心，广州510060)、金学民]；100088北京， 国家人口计生委科学技术研究所(马旭) 通讯作者 ：金学民(Email：jinxuemin@yahoo．com．clq) 3460[3 3 。 但并非所有携带此突变位点者都会发病 ，而 且在同一突变位点的不同家系或个体之间，其发病和 临床表现也有差别。提示除 mtDNA点突变外可能还 有其他的因素对 LHON的发病起到促发作用或者决 定性的作用。国外有关报道显示 ，多数 LHON母系成 员均携带纯合点突变的 mtDNA，即个体的每个细胞 的 线粒体的基因都是突变的，约 15％的 LHON家系携带 异质线粒体 突变 ，即只有部 分细胞 的线 粒体发生突 眼科研究 2009年 7月第 27卷第 7期 变 。家系或个体之间 的异 质性 可能影 响 LHON的 发病和预后。本研究应用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)、限制性核酸内切酶酶切、变性高效液 相色谱 (denaturing high performance liquid chromatography， dHPLC)分析技术，分析 DNA测序已确诊的5个 11778 点突变家系的异质性 。 1 与方法 1．1 研究对象 本研究中 5个 LHON家系的母系成员均来 自河南 省，所有母系成员 均经 DNA测序 确诊为 1 1778点突 变 -6j(北京华大中生生物技术有限公 司、上海 申 能博采生物技术有 限公司 、上海基康生物技术有 限公 司)。5个家系中母系成员组成及发病情况见表 1。 表 1 5个 LHON家 系的母 系成 员发病情 况 Table 1 Pentration information of materal members in the 5 LHON families 1．2 DNA提取 、PCR扩增及基因测序 68例母 系成员 ，2例(家系 1，携带者 )因外出未采 集到血样。1例正常人血样来 自患者配偶 ，DNA测序 结果显示为未携带 1 1778点突变的野生型。常规蛋 白 酶 K裂解 、酚 一氯仿抽提 、盐沉淀法提取基因组 DNA。 PCR扩增所用引物为大连宝生物工程有 限公 司合成。 上游 引物 5’．TAGCCCTCGTAGTAACAGC一3’，下游 引 物 5’一GCGAGGCTTGCTAGAAGT一3’，产物长度为 214 bp。 50 L PCR反应体 系包含 1．5 U的 TaqDNA聚合 酶、 0．2 mmol／L的 dNTP、2 mmol／L 的 MgSO 、10 mmol／L 的 KC1、8 mmol／L的 (NH4)2 SO4、10 mmol／L的 Tris— HC1(pH：9．0)、上下游引物 400 nmol／L和 50 ng的基 因组 DNA。反应 条件 为：94℃ 5 min预变 性 ，94℃ 30 S、52．7℃ 30 S、72℃ 30 S，共 30个循环 ，72℃ 7 nlin 延伸。紫外吸收分析仪测定样品的 DNA浓度和纯度。 将 PCR扩增产物送北京华大中生生物技术有限责任 公司测序 ，以证实为 目的片段。 1．3 酶切 PCR产物 11778点突变的检测使用限制性内切酶 Tsp 4 I酶切， 正常的mtDNA在 11778位点附近未携带内切酶 BI的识别 序列，而点突变(G—A)使 11778位点附近出现了该限制 性内切酶的识别序列，所以突变后的目的片段可以被 BI 识别并切开剪切成为 138 bp和 76 bp 2个片段。酶切反 应体系 20 L，包括 10 mmol／L Bis Tris Proprane—HC1、 10 mmol／L MgC1： 1 mmol／L DTT 1 ng PCR DNA 2 U 限制性内切酶。56℃反应 12～16 h。 1．4 dHPLC仪检测线粒体突变异质性 采用 2100型 dHPLC分析仪 (美 国 Transgenomics 公司)在 50℃不变性 的温度条件下 ，将 PCR产物及 PCR酶切产物按顺序置于 96孔低温样品架内。在进 行变异检测之前 ，需以系统 内置的 50℃非变性方法分 析样品，要求色谱 图中的主峰呈对称而锐利的单峰，若 有其他更多的峰 出现或 出现肩峰 ，则需重新优化 PCR 条件。此步骤一般仅用于实验初期 ，仅需检测一个样 本的 PCR产物 ，确认 PCR产物的质和量符合 dHPLC 检测要求即可。 设定条件后 ，启动 dHPLC分析仪开始检测 ，恒温 自动取样器将 5 L PCR产物或 5 txL PCR酶切产物注 入 WAVE DNA片段分析 系统 ，PCR产物被流动相 A 液(0．1 mmol／L TEAA，0．025％乙腈)和 B液(0．1 mmol／L TEAA，25％乙腈)带至分离柱洗脱分离 。流动相流速 为 0．9 mL／min，柱温设置为 50 cIC。由于各个样本 PCR 酶切产物 中的组成不同以及酶切片段 长度 的差异，每 个样本 PCR酶切产物中不同长度 的酶切 片段按长度 大小 ，由小到大依次被洗脱 ，每个片段被洗脱 的同时 ， 在 Wave Maker软件上产生 1个洗脱峰 ，检测出每个样 本的不同洗脱峰型可以判断出该样本突变的异质性 。 1．5 统计学方法 采用 SPSS 10．0统计学软件进行统计学分析。在 进行视力有关的统计学分析时 ，将矫正标准视力转换 成 logMAR视力 (1ogMAR=logl／标准视力 )，数指相当 于标准 Snellen视力的 6／600(1ogMAR：2．0)，手动相 当于标准 Snellen视力 的 6／6 000(1ogMAR=3．0)。纯 合突变母系成员中发病率与异质突变母系成员 中发病 率 的比较采用 X 检验 ，患 者视力 检测 的数 据资料 以 ±s表示，纯合突变患者与异质突变患者 logMAR视力 的比较采用独立样本的 t检验。P<0．05为差异有统 计学意义。 2 结果 2．1 DNA测序结果 正常对 照 未见 突变 。所 有 母 系 成 员 均 检测 出 1 1778 点 突变 ， G — A (图 1 ， 2 )。 ^ r．． ，l ltT itillltqlt ■u t ●l " tg lI ‘ f l饽 o f l82 图 1 野 生 型 1 1778 位 点 D N A 测 序 的 突 变 位 点 (箭头 ) F ig． 1 T he m u tation site ofD N A sequencin g ofnovel11778 location (arrow ) ? ~ 0 4 0 8 0 0 6 【1 】． Z h fl ． F 1 ， r - ?， t 曩 t ■ 一 ● tT 5 ． 1 m 1 T s ? f 3 ‘ 图 2 突 变 型 1 1 778 位 点 D N A 测 序 的 突 变 位 点 (箭 头 ) F ig． 2 T he m u tation site ofD N A se qu en cin g of1 1778 m u tation (arrow ) 2 ． 2 野 生 、 突变 及 酶切 目的 片段 的 dH P L C 色谱 图 P C R 产 物 及 携 带 野 生 1 1778 G 样 本 的 P C R 酶 切 产 物 dH P L C 色谱 图 检 测 均 为 单 一 214 bp 片 段 的 洗 脱 峰 ， 所 有 样 本 的 图 形 及 出 峰 时 间 一 致 (图 3 )。 携 带 突 变 1 1778 A 样 本 的 P C R 酶 切 产 物 经 dH P L C 色 谱 图 检 测 均 显 示 为 2 个 洗脱 峰 ， 分 别 指 示 76bp 和 138 bp 2 个 片段 (图 4 )。 同时携 带 野 生 型 1 1778 G 和 1 1778 A 样 本 的 P C R 酶切 产 物 经 dH P L C 色 谱 图 检 测 均 显 示 为 3 个 洗 脱 峰 ， 分别 指 示 76 、 138、 214 bp 片 段 (图 5 )。 3 P C R 产 物 及 野 生 型 样 本 酶 切 产 物 dH P L C 峰 (214 bp) F ig． 3 dH P L C peaks from P C R produ cts and en zym e digested n ovelsam ple (2 14 bp) 异 质性 分 析 所 测 的 5 个 家 系 66 例 母 系 成 员 均 携 带 1 1778 A 图 4 突 变 型 样 本 P R C 酶 切产 物 dH P L C 峰 (76 bp 和 13 8 bp) F ig． 4 dH P L C peaks ofe n zym e dige sted P C R produ cts from m u ta tion sam ple f76 bp and 13 8 bp) C hin O phthalR es ， J u ly 2009 ， V 0 1． 27 ， N o ． 7 图 5 杂 合 型 样 本 P C R 酶 切 产 物 dH P L C 峰 (76 、 138 、2 14 hpl F ig． 5 dH P L C peacks ofen zym e digested P C R products con tain 1 1778 G and 1 1778 A (76 bp， 138 bp and 214 bp) 点突 变 。 在 家 系 2 和 家 系 4 的 24 例 母 系 成 员 中 ， dH P L C 结 果 均 为 2 个 峰 且 与 图 4 对 应 峰 时 一 致 ， 即 为 纯 合 突 变 。 而 所 测 家 系 1 、 3 、 5 的 4 2 例母 系 成 员 中 ， 4 1 例 dH P L C 结 果 均 为 3 个 峰 ， 与 图 5 对 应 峰 时 一 致 ， 即 为 异 质 突变 ， 但 家 系 1 中的 1 例患 者 为 2 个 峰 且 与 图 4 对 应 峰 时 一 致 ， 此 患 者 为纯 合 突 变 。 2 ． 4 突 变 异 质性 与 发病 和 视 力 的 关 系 在 25 例 纯 合 突 变 的母 系成 员 中 ， 发病 者 1 l例 ， 发 病 率 为 4 4 ． 0％ 。 4 1 例 异 质 突 变 的母 系 成 员 中 ， 16 例 发病 ， 发病 率 为 39 ． 02％ 。 前 者 发 病 率略 高 于 后 者 ，但 差 异 无 统计 学 意 义 (x 。 = 0． 15 9 ， P = 0． 690 )。 从 表 1 可 以 看 出 ， 虽 然 所 有 患 者 均 为 1 1778 点 突 变 ， 但 其视 力 预 后 明 显 与 所 在 家 系有 关 。 家 系 2 和 家 系 4 虽 然 均 为纯 合 突 变 ， 但 家 系 4 中患 者 视 力 明 显 好 于 家 系 2 。 同样 ， 在 异 质 突 变 个 体 家 系 中 ， 家 系 3 中患 者 的视 力 明 显 好 于 家 系 1 和 家 系 5 中患 者 的视 力 。 将 标 准视 力 转 换 成 logM A R 视 力 后 ， ll例 纯 合 突 变 患 者 的视 力 为 3 ～ 0 ． 04 ， 平 均 1 ． 35 ± 0 ． 97 ；16 位 异 质 患者 视 力 为 3 ～ 0 ， 平 均 1 ． 16 ± 0 ． 82 ，2 组 视 力 比较 ， 差 异 无 统 计 学 意 义 (t = 0． 54 3 ， P = 0． 5 9 )。 3 讨 论 L H O N 由德 国 眼 科 医 师 T heodor L eber 于 187 1 年 首 先 报 道 M 。 ， 故 又 称 L eber 病 、 L eber 视 神 经 炎 及 L eber 视 神经 萎缩 等 。 之 后 ， 很 多学 者 对 其病 因 、 发病 机 制 和 治疗 等进 行 了 相 关 的研 究 ， 并 提 出很 多致 病 学 说 ∞ 。 0 。 1988 年 ， W allace 等 ¨ 0发 现 患 者 氧化磷 酸 化 复合物 I 的 N D 4 亚 单 位 基 因 第 1 1778 位 点 的 碱 基 由 G 置 换 为 A (G 1 1778A ， 称 W allace 突 变 )， 使 N D 4 的第 34 0 位上 1 个 高度保 守 的氨基 酸精 氨酸 被 组 氨 酸 取 代 (W allace 突 变 )， 导 致 N A D H 脱 氢 酶 活 性 降低 和 线 粒 体 产 能 效 率 下 降 ， 视 神经 细 胞 提 供 的 能 量 不 能 长 期 维 持 视 神 经 的 完整 结 构 ， 引起 神 经 细 胞 退 行 性 变 而 使视 力 受 损 。 除 1 1778 位 点 外 ， 近 年 来还 发现 34 60 位 点 、 14 4 84 位 点 及 其 他 位 点 突 变 也 与 L H O N 发 病 有 关 ， l1778 、 34 60 、 眼科研究 2009年 7月第 27卷第 7期 14484位点突变占所有 LHON患者的95％以上 。这 些研究奠定 了 mtDNA点突变决定 LHON发病的遗传 学基础 ，即母系遗传 ，并从遗传 学角度解释 了 LHON 的遗传规律。但是 ，在 LHON发病 和预后方 面，仍有 很多难以解释的问题。主要表现为 ，母系成员中，虽然 都携带致病基因，但并不都发病 ；不仅携带 3种不同点 突变患者的发病和视力预后 不同，同一突变位点的不 同家系和个体之问，其发病率 、发病后视力和预后也有 差别。因此推测 ，除点突变外还有其他致病因素 ，如性 别 、年龄 、环境、地域、生活习惯 、突变类型、突变量 、核 DNA影响等 。 mtDNA是细胞质中唯一的遗传成分 ，能 自身复制 作为独立 于核染色体 以外 的遗传系统 ，因此 ，mtDNA 的突变类型和突变量 与 LHON发病之 间的关系受到 关注 。Lott等 和 Holt等 的研究表明，白种人 杂合性 mtDNA11778突变常见 ，且其突变率与发病 以 及疾病预后有关 。而有研究表明，中国大陆、台湾和 日 本的 1 1778点突变者均为纯合突变 ” 。本研究中， 5个 LHON家系中，有 3个家系携带异质的线粒体 ，与 泰国的研究 结果 37％相 近 。造成 这些差 异 的原 因，除与家系选择有关外 ，样本量 、人种差异和地域因 素也不可忽视。 本研究结果还显示 ，家系之问的异质性对发病 率 及视力的影响均无明显影响。家系 1为异质性 突变 ， 家系 2为纯合突变 ，但两家系的外显率相近且视力都 很差 ；而家系 3和家系 4虽然也分别为异质和纯合 突 变家系，但两者的外显率一致，且视力预后均较好。说 明异质性对发病和视力预后均无明显影响，提示在线 粒体突变这个 LHON发病 的基本条件之外 ，异质性并 不影响 LHON的视力预后。这一结果 与文 献报道 的 结论不尽相同 。 另外 ，本研究还发现 ，在 同一个家系中，既可有异 质突变，也可有 纯合 突变。在家系 1中，30例被检母 系成 员 中，1例患 者为 纯合 突 变。这 种现 象 Howell 等 也报道过 ，与线粒体 的遗传规律有关系。 dHPLC是近年发展起来 的一种简便 、快速 、高效 地检测 DNA突变的方法，具有 自动化程度高 、敏感性 高、PCR产物不需任何处理即可用于分析 以及适合大 片段 PCR产物等特点 ¨ 。在部分变性温度和洗脱 条件下，利用异源双链 和同源双链对 DNASep柱的不 同结合力进行分离。因此对于单个纯合突 变型 DNA 片段与单个纯合 野生型 DNA片段 ，dHPLC不易分 辨 (均为单峰 ，出峰时 间稍 有差别 )。混合样 品在 PCR “共”反应过程 中易于促使突变型产物与野生型产物 之间形成不匹配的异源双链 ，从而提高了 dHPLC的突 变检出率 ，同时也提高 了 dHPLC分析 的效率。但是 ， dHPLC只能定性检测有无突变的存在 ，而且在突变率 过低时可能漏诊。本研究 中，虽然我们只对异质性进 行分析 ，为避免突变率低时影响检出率 ，我们通过酶切 反应 ，把突变片段切成 2个不同大小更易辨认的片段， 以提高检 出率 。 受样本来源的影响，本研究结果只能反应局部地 区 mtDNA11778突变存在异质性，而且异质性和发病 率及视力预后无相关性。但在异质性个体中，突变量 和发病的关系尚有待进一步研究。 参考文献 1 W allace DC，Singh G ，Lott MT，et a1．Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy[J]．Science，1988， 242(4884)：1427—1430 2 Johns DR．Neufeld MJ．Park RD．An ND．6 mitochondrial DNA mutation associated with Leber hereditary optic neuropathy[J]．Bioehem Biophys Res Commun，1992，187(3)：1551—1557 3 Huoponen K，Vilkki J．Aula P，et a1．A new mtDNA mutation associated with Leber hereditary optic neuroreti“opathy[J]．Am J Hum Genet， 1991，48(6)：1147—1153 4 Leber T．Veber hereditare and co“genitula“gel gte sehnervenleiden[J]． Graefe’s Arch Ophthalmol，1871，17：249—291 5 Eichhorn-Mulligan K ．Cestari DM．The genetics of leber hereditary optic neuropathy-- prototype of an inherited optic neuropathy with mitochondrial dysfunction[J]．Semin Ophthalmol，2008，23(1)：27—37 6 Smith KH，Johns DR，Heher KL，et a1．Heteroplasmy in Leber’s hereditary optic neuropathy[J]．Arch Ophthalmol，1993，111(11)： 1486—1490 7 Chinnery PF，Andrews RM ，Turnbull DM ，et a1．Leber hereditary optic neuropathy：Does heteroplasmy influence the inheritance and expression of the G1 1778A mitochondrial DNA mutation[J]．Am J Med Genet， 2001，98(3)：235— 243 8 Lott MT，Voljavec AS，Wallace DC．Variable genotype of Leber’s hereditary optic neuropathy patients[J]．Am J Ophthalmol，1990，109(6)： 625—631 9 Holt IJ．Miller DH．Harding AE．Genetic heterogeneity and mitochondrial DNA heteroplasmy in Leber’s hereditary optic neuropathy[J]．J Med Geaet，1989，26(12)：739—743 10张清炯，郭向明，贾小云．线粒体 DNA l1778突变所致 Leber遗传性 视神经病变 外显率 分析 [J]．中华医学遗 传学杂 志，2001，6： 44l一443 1 1 Yen MY，Lee HC，W ang AG ，et a1．Exclusive homoplasinie 1 1778 mutation in mitoehondrial DNA of Chinese patients with Leber’s hereditary optic neuropathy[J]．Jpn J Ophthalmol，1999，43(3)： l96—200 12 Nakanmra M，Fujiwara Y，Yamamoto M Homoplasmie and exclusive ND4 gene mutation in Japanese pedigrees with Leber’s disease[¨ ．Invest Ophthalmol Vis Sci，1993．34(3)：488—495 13 Chuenk0“gkaew W L，Suphavilai R，Vaeusorn L，et a1．Proportion of11778 mutant mitoehondrial DNA and clinical expression in a Thai population with Leber hereditary optic neuropathy[J]．J Neuro0phthalmol，2005， 25f 3)：173—175 14 Howell N ，Kubacka I，Keers SM ，et a1．Co—segregation and heteroplasmy of two coding—region mtDNA mutations within a matrilineal pedigree[J]． Hum Genet．2005，116(1—2)：28—32 15 van den Bosch BJ，de Coo RF，Seholte HR，et a1．Mutation analysis of the entire mitochondrial genome using denaturing high performance liquid chrom atography [ J ] ． N u cleic A cids R es ， 2000 ， 28(20 )：89 16 B iggin A ， H enke R ， B cnnetts B ， eta1． M utation screening ofthe m itoehon drial gen om e u sin g den atu rin g high— perform an ce liqu id chrom atography [ J ] ． M O lG en et M etab． 2005 ， 84 (1 )：6 1 — 74 (收 稿 ：2008 — 09 — 02 修 回 ：2009 — 03 — 13 ) (本 文 编辑 ：刘 艳 ) ? 短 篇 论 著 - 以 兔 自体 结膜 成 纤 维 细 胞 为饲养 细 胞 构建 上 皮 细 胞 植 片 牟式 鲁 姚 玉 峰 裘 文 亚 近 年来 用 以 组 织 工 程 技 术 制 备 的 角 膜 上 皮 或 口 腔 黏 膜 上 皮 细 胞 植 片 成 为 一 种 目前 治 疗 角 膜 缘 干 细 胞 缺 乏 性 疾 病 的 新 技 术 ¨ “ ， 能 够 改 善 角 膜 缘 的 功 能 ， 恢 复 角 膜 表 面 的 完 整 性 。 目前 的 构 建 体 系 常 用 小 鼠 胚 胎 组 织 来 源 的 3 T 3 成 纤 维 细 胞 作 为 饲 养 细 胞 ， 但 这 种 含异 种 细 胞 的植 片 可 成 为 异 种 病 原 向人 体 传播 的 潜 在 渠 道 ， 也 存 在 异 种 排 斥 反 应 的 可 能 性 。 “ 。 因此 寻 找 更 安 全 的饲 养 细 胞 成 为 完 善 现 有 技 术 的 一 个 关 键 。 本研 究 观 察 以 兔 自体结 膜 成 纤 维 细 胞 为 饲 养细 胞 、 兔 IS l腔 黏膜上 皮 细胞 为种 子 细 胞 构 建 上 皮 细 胞 植 片 的可 行性 。 1 材 料 与 方 法 1 ． 1 材 料 D M E M ／H am F 12 培 养 液 、 胎 牛 血 清 、 胰 岛 素 、 人 表 皮 生 长 因 子 (美 国 G ibco 公 司 )。 噻 唑 蓝 (M T T )(上 海 华 美 生 物 工 程 公 司 )；二 甲 基 亚 砜 (上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 )；丝 裂 霉 素 C (M M C ) ( 日本 K yow a H akko K ogyo 公 司 )；嵌 入 式 培 养 皿 (美 国 C o rn in g 公 司 )。 1 ． 2 方 法 1 ． 2 ． 1 兔 结 膜 成 纤 维 细 胞 的 原 代 培 养 新 西 兰 大 白 兔 4 只 麻 醉 后 取 约 4 m w t × 4 m m 的 结 膜基 质组 织 ， 剪 成 lm m x lm iT l 大 小 贴 至 直 径 60 m m 的 培 养 皿 ， 加 4 m L 含 10％ 胎 牛 血 清 的 D M E M 培 养液 37 oc 5 ％ C O ：培 养 。 1 ． 2 ． 2 M T T 比色 法 筛选 M M C 对 兔 结 膜 成纤 维 细 胞 的 1 ． 2 ． 4 去 上 皮 羊 膜 载 体 的制 备 采用 一 20 ℃ 保 存 的 血 清 学 检 查 阴 性 的 羊 膜 ， 使 用 前 将 其 解 冻 ， 0． 02％ E D T A 37 ℃ 处 理 1 h 后 ， 用 棉 签 擦 除 羊 膜 上 皮 。 显 微 镜 下 观 察 直 至 羊 膜 上 皮 完 全 清 除 。 完 成 的 羊 膜 载体 见 图 1 A 。 将 制 备好 的 去 上 皮 羊 膜 平 铺 至 嵌 入 式 培 养皿 (图 lB )。 ┏ ━━━ ━ ┓┃ ’“ oo ┃ ┣━ ━ ━━ ┫ ┃ D ┃ ┗ ━━ ━ ━┛ 图 1 无 上 皮 羊 膜 载 体 和 兔 口 腔 黏 膜 上 皮 细 胞 培 养 A ：无 上 皮 羊 膜 载 体 B ：第 7 天 时 ， 培 养 的 兔 口 腔 黏 膜 上 皮 细 胞 已 覆 盖 80％ 的 面 积 C ：融 合 的 兔 口 腔 黏 膜 上 皮 细 胞 大 小 均 一 、 边 界 清 晰 ， 相 互 连 接 紧 密 ( × 100 ) D ：兔 口 腔 黏 膜 上 皮 细 胞 形 成 4 — 5 层 分 化 良好 的 复 层 上 皮 片 (H E × 4 00 ) 安 全 质量 浓 度 将 第 1 ～ 2 代 兔 结 膜 成 纤 维 细 胞 接 种 于 96 孔 板 。 接 近 融 合 的 细 胞 分 别 用 含 0 、 0 ． 5 、 5 、 25 、 50 、 250 、 500 p~ g／m L M M C 的 培 养 液 37 ℃ 处 理 2 h。 移 除培 养 液 ， 用 P B S 浸 洗 后 加 入 正 常培 养 液 继 续 培 养 。 72 h 后 每 孔 加 入 5 m g／m L M T T 溶 液 20 “L ， 37 ℃ 孵 育 4 h 后 弃 去 上 清 液 。 每孑L加 入 150 斗L 二 甲 基 亚 砜 ， 振 荡 10 n?in 使 结 晶 物 充 分 溶 解 。 选 择 4 90 n m 波 长 测 定 各 孔 光 吸 收值 。 1 ． 2 ． 3 筛 选 抑 制兔 结 膜 成 纤 维 细 胞 增 生 的 最 佳 M M C 质 量 浓 度 将 兔结 膜 成 纤 维 细 胞 培 养 于 直 径 60 IllIll 的 培 养 皿 上 ， 至 90％ 融 合时 分别加 4 m L 含 有 0 、 0 ． 5 、 5 、 25 ~g／m L M M C 的 培 养 液 37 ℃ 孵 育 2 h。 移 除培 养 液 ， 0． 25 ％ 胰 酶 + E D T A 消 化 ， 离 心 重 悬 后 按2 × 10。个 细 胞 ／c m 。 的 密 度 接 种 至 6 孔 板 ． 每 2 d 更 换 培 养液 1 次 。 每 日观 察 细 胞 增 生 情 况 。 作 者单 位 ：3 100 t6 杭 州 ， 浙 江 大 学 医 学 院 附 属 邵 逸 夫 医 院 眼 科 浙 江 省 生 物 治疗 重 点 实 验 室 通 讯 作 者 ：姚 玉 峰 (E m ail：yaoyu f@ m ail． hz ． zj． cn ) 1 ． 2 ． 5 上 皮 细 胞 植 片 的 构建 新 西 兰 大 白兔 (n = 8)麻 醉 后 剪 取 3 m E x 3 IllIll 的 颊 部 口 腔 黏膜 组 织 。 切 成 1 m nl × 1 B IF I 的小块 后 ， 上 皮面 朝 上 贴 于 羊 膜 载 体 上 。 6 孔 板 中 提 前 接 种 5 斗罢／m L M M C 处 理 的饲 养 细 胞 (2 × 10 。 个 细 胞 ／cm 。 )。 在 6 孔 板 中加 入 2 m L 培 养液 ， 嵌 入 式 培 养 皿 内 暂 时 不 加 。 培 养 液 为 D M E M 和 H am F 12 培 养 液 按 3 ： I 混 合 ， 含 10％ 胎 牛 血 清 、 5 p． g／m L 胰 岛 索 、 10 n g／m L 人 表 皮 生 长 因 子 、 0 ． 5 ％ 二 甲 基 亚 砜 及 抗 生 素 。 37 ℃ 5 ％ C O ， 培 养 24 h 后 ， 向 嵌 入 式 培 养 皿 中 加 入 l m L 培 养 液 。 此 后 每 2 d更 换 1 次培 养 液 直至 细 胞 融 合 。 融 合 后 每 日更 换 培 养 液 。 浸 没 培 养 2 周 后 ， 停 止 向嵌 入 式 培 养 皿 中加 培 养 液 ， 非 浸 没 培 养 1 周 以 促进 细 胞 复 层 化 。 1 ． 2 ． 6 组 织 病理 学 与 电子 显 微 镜 检 查 样 品 用 10％ 中性 甲醛 周定 ， 石 蜡 包 埋 。 5 斗m 厚 切 片 ， 行 苏 木 精 一 伊 红 染 色 ， 光 学 显 微 镜 下 观 察 。 扫 描 电镜样 品 以 2． 5 ％ 戊二 醛 溶 液 4 ℃ 同定 过 夜 后 再 以 1 ％ 锇 酸 溶 液 固定 ， 经 逐 级 脱水 后 以 醋 酸异 戊 酯 处 理 。 临 界 点 干燥 ， 镀 膜 后 行 扫描 电镜 观 察 。 透 射 电 镜 样 品 固 定 方 法 与