实时荧光PCR检测肠产毒性大肠埃希菌耐热肠毒素基因

[基金项目 ]　杭州市科技发展计划 (2003133B35) [作者简介 ]　于新芬 ( 1977 - ) ,女 ,硕士 ,技师 ,主要从事微生物 检验研究。3 通讯联系人 , E - mail: jingcaopan@ sina1com 【论著 】 实时荧光 PCR肠产毒性大肠埃希菌耐热肠毒素基因 于新芬 ,潘劲草 3 ,汪皓秋 ,孟冬梅 ,郑伟 ,张蔚 (杭州市疾病预防控制中心 ,杭州 　310006) [摘要 ]　目的 :建立实时荧光 PCR的方法检测肠产毒性大肠埃希菌 ( ETEC)耐热肠毒素 ( ST Ia和 ST Ib)基因。方法 :设 计引物和探针 ,优化实时荧光 PCR检测 ST Ia和 ST Ib基因的反应条件。检测 ST阳性或阴性的 20株大肠埃希菌和 2株 霍乱弧菌以评估方法的特异性。对 90份腹泻病人肛拭子标本 ,经 BP增菌 4 h后以煮沸法提取 DNA模板 ,直接检测 ST Ia和 ST Ib基因 ,阳性标本以普通 PCR检测 ST基因进行复核 ,并从阳性的初始肛拭子标本中分离鉴定携带 ST的菌株。 结果 :实时荧光 PCR具有较高的特异性。90份腹泻病人标本中 , 9份标本 ST Ib基因阳性 (1010% ) , 2份标本为 ST Ia基 因阳性 (212% ) ;阳性标本以普通 PCR复核 ,符合率为 100%。在 9份 ST Ib基因阳性和 2份 ST Ia基因阳性的初始肛拭 子标本中 ,分别有 8份和 2份分离到 ST Ib基因阳性的 ETEC和 ST Ia阳性的 ETEC。结论 :建立的实时荧光 PCR方法 ,可 用于 ETEC菌株 ST毒力基因鉴定和临床腹泻粪便标本的直接快速筛检。 [关键词 ]　实时荧光 PCR;耐热肠毒素 ;大肠埃希菌 [中图分类号 ]　R392111　　　　[文献标识码 ]　A　　　　[文章编号 ]　1004 - 8685 (2007) 05 - 0802 - 03 D evelopm en t of rea l - tim e PCR for detection of hea t - stable en terotox in gene of en tero2 totx igen ic Escherich ia co li Yu X in2fen, Pan J ing2cao3 , W ang Hao2qiu, M eng D ong2m ei, Zheng W ei, Zhang W ei (Hangzhou Center for D isease Control and Prevention, Hangzhou 310006, China) [ Abstract] 　O bjective: To develop a specific and quick assay for detection of heat - stable enterotoxin gene ( ST Ia and ST Ib) of enterotoxigenic Escherich ia coli ( ETEC) 1M ethods: Two sets of specific p rimers and fluorogen - labled p robes were designed to amp lify and quantify ST Ia and ST Ib genes in real - time PCR1The specificity of the real - time PCR was evaluated by detection for the two genes in 20 E1coli strains and 2 V ibrio cholerae strains with or without the two genes which were identified by routine PCR1To estimate the detection efficiency of the real - time PCR in fecal samp les, fecal swabs from 90 diarrhea patients were col2 lected to exam ine ST Ia and ST Ib genes after enrichment in BP broth for 4 h at 37℃, in which the positive results were checked by additional routine PCR1And the isolation of ST positive strains was performed in the PCR - positive swabs by culture1Results: This real - time PCR method was showed to have high specificity1 In 90 fecal samp les, 9 were found positive for ST Ib gene, and 2 were found positive for ST Ia gene1Eight E1coli strains positive for ST Ib gene and two E1coli strains positive for ST Ia gene were isolated from the PCR - positive swabs1Conclusion: The real - time PCR can detect ST Ia and ST Ib in a single reaction1 It is powerful not only to detect ST Ia and ST Ib genes in ETEC strains but also to screen ETEC in fecal specimens from diarrhea and food poisoning patients1 [ Key words] 　Real - time PCR; Heat - stable enterotoxin; Escherichia coli 　　肠产毒素性大肠杆菌 ( enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是婴幼儿和旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC常可 在学校、餐馆和军队中引发食物中毒。ETEC携带的耐热肠毒 素 ( heat - stable enterotoxin, ST)和 /或不耐热肠毒素 ( heat - la2 bile enterotoxin, LT)可引发或轻或重的水样腹泻 ,检测肠毒素 对大肠杆菌腹泻病的诊断有着重要意义 [ 1 ]。ST有二个类型 , 即 ST I和 ST II(分别又称 STa和 STb)。感染人类 ETEC的主 要为 ST I,并可分为 ST Ia (又称 STp)和 ST Ib (又称 STh)二个 变种。目前检测 ETEC肠毒素的方法主要有动物实验、免疫学 方法和常规 PCR [ 2, 3 ]等等 ,这些方法费时费力 ,且具有一定的 局限性。国外已有实时荧光 PCR检测 ST基因的报道 [ 4, 5 ] ,本 研究建立了复合实时荧光 PCR的方法检测 ETEC菌株的 ST Ia 和 ST Ib基因 ,并应用于腹泻病人大便标本中 ST Ia和 ST Ib基 因的直接筛检。 1　与方法 111　菌株及标本 22株菌株其中 20株为本实验室自主分离鉴定或保存 : 5 株 ETEC (其中上海 142株为 ST Ia +和 ST Ib -菌株 ,其它 4株 208 中国卫生检验杂志 2007年 5月 第 17卷 第 5期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology,May 2007; Vol 17　No 5 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 为 ST Ia -和 ST Ib -菌株 ) , 5株 ST Ia -和 ST Ib -的肠侵袭性 大肠埃希菌 ( E IEC) , 8株 ST Ia -和 ST Ib -的肠致病性大肠埃 希菌 ( EPEC) , 2株 ST Ia - 和 ST Ib - 的霍乱弧菌 (小川型和 O139) ;另外 2株 ETEC分别为 44 814株 ( ST Ia +和 ST Ib - )、 44815株 ( ST Ia - ST Ib + ) ,均购于中国医学细菌保藏管理中 心。90份肛拭子样品来源于 2006年 8月杭州市一医院和杭 州市儿童医院就诊的腹泻病人。 112　引物和探针 引物及探针见表 2,根据 TaqMan复合荧光探针设计原则 设计。引物和探针组合 1 (引物 ST Ia F、ST Ia R和探针 ST Ia P)和组合 2 (引物 ST Ib F、ST Ib R和探针 ST Ib P)分别用于实 时 PCR扩增 ST Ia基因和 ST Ib基因。引物 STf和 STr[ 1 ]用于 普通 PCR扩增 ST基因。引物由上海生工合成 ,探针由大连 TaKaRa生物公司合成。 113　实时荧光 PCR方法的建立 荧光定量 PCR仪为 Rotor Gene公司产品 ,型号为 RG - 3000。用矩阵法优化引物、探针和 MgCl2 浓度。PCR反应试剂 为 TaKaRa生物技术公司的 EX Taq酶。反应体积为 25μl,含 1 ×buffer、MgCl2 215 mmol/L、dNTPs各 012 mmol/L、三对引物 各 012μmol/L、三条探针各 0112μmol/L、Ex Taq酶 25 U /m l。 反应程序为 : 95℃ 2 m in变性后、94℃ 10 s, 60℃ 40 s进行 45 个循环。于 60℃检测 FAM通道的荧光信号。以 44814株和 44815株两种菌等浓度混合后煮沸 ,离心取 1μl上清为模板 , 进行实时荧光 PCR,并与单重实时荧光 PCR进行 ST Ia、ST Ib 基因扩增的 Ct值 ( threshold cycle)比较 ,各设 3个重复。Ct值 与起始产生荧光信号的 DNA浓度呈负相关性 [ 6 ]。单重 Real - time PCR即加入一种引物和探针 ,反应条件相同。 114　普通 PCR检测 ST基因 反应条件为 94℃ 3 m in, 94℃ 15 s, 56℃ 15, 72℃ 25 s进 行 6个循环 , 94℃ 15 s, 50℃ 15, 72℃ 30 s进行 28个循环 , 72℃延伸 2 m in。ST基因的检测引物见表 1,扩增的 ST基因 片段长度为 190 bp。 表 1　引物和荧光探针核酸序列 Primer or p robe Sequence (5′→3′) Nucleotide position GenBank accession no References ST Ia F TGA ATC AST TGA CTC TTC AAA AGA ( S = C or G) 351 - 374 M25607 Present study ST Ia R AAC ATG GAG CAC AGG CAG 499 - 482 ST Ia P FAM - ATT ACA ACA AAG TTC ACA GCA GTA AAA TGT - ECL IPSE 480 - 451 ST Ib F GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AA 88 - 110 M29255 Present study ST Ib R TAG CAC CCG GTA CAA GCA 239 - 222 ST Ib P FAM - ATT ACA ACA CAA TTC ACA GCA GTA ATT GC - ECL IPSE 219 - 191 STf ATT TTT MTT TCT GTA TTR TCT T(M =A or C) 46 - 67 M29255 Reference[ 1 ] STr CAC CCG GTA CAR GCA GGA TT(R = A or G) 236 - 217 115　实时荧光 PCR方法直接检测腹泻病人肛拭子样品 杭州市一医院和杭州儿童医院采集的 90份腹泻病人肛 拭子 ,分别接种于 4 m l BP增菌液 37℃ 200 r/m in增菌 4 h,取 1 m l增菌液 10 000 r/m in 离心 5 m in,去上清 ,加入 100μl ddH2O, 100℃煮沸 10 m in,离心 ,取上清 1μl作为实时荧光 PCR的模板。同时将标本分别划于麦康凯平板和大肠杆菌显 色平板 , 37℃过夜后 ,挑取 5个可疑菌落接种三糖铁斜面 , 37℃过夜 ,而后进行实时荧光 PCR检测菌株 ST Ia和 ST Ib基 因。实时荧光 PCR结果呈阳性的标本进行普通 PCR验证。 2　结果 211　复合和单重实时荧光 PCR扩增效率的评估 本研究表明 ,通过调整 dNTPs和 Mg+ 2浓度 ,优化实时荧 光 PCR反应条件 ,可在同一通道内同时检测 ST Ia和 ST Ib两 个基因 ,复合实时荧光 PCR Ct值平均值为 30125,而同等条件 下单重实时荧光 PCR检测 ST Ia和 ST Ib Ct值平均值分别为 29133和 30116。复合和单重实时荧光 PCR扩增效率差别较 小。反应效率为 10 - M - 1, 1 /M = 31322时 ,反应效率最高为 1。 212　多重 Real - time PCR检测的特异性评价 用优化后的反应条件对本实验室保存的 7株 ETEC、5株 E IEC、8株 EPEC、2株霍乱弧菌株进行了 ST Ia和 ST Ib基因的 实时荧光 PCR检测 ,阳性和阴性符合率为 100%。 213　对腹泻病人肛拭子标本进行直接检测 90份腹泻病人肛拭子 BP增菌 4 h后煮沸法提取 DNA模 板进行实时荧光 PCR检测 ST Ia和 ST Ib基因 ,其中 9份标本 为 ST Ib基因阳性 ,阳性率为 1010% , 2份标本为 ST Ia基因阳 性 ,阳性率为 212% ;对实时荧光 PCR阳性的标本进行普通 PCR鉴定复核 ,符合率为 100%。 将实时荧光 PCR阳性的原始标本划线于麦康凯平板和大 肠杆菌显色平板 ,各挑取 5个可疑菌落进行实时荧光 PCR检 测 ,其中 8份样品分离到 ST Ib基因阳性菌株 , 2份样品分离到 ST Ia基因阳性菌株 ,经 AP I鉴定系统鉴定均为大肠埃希菌 ,其 Ct值在 18161～30116之间 ;另外 1份 ST Ib基因阳性样品未 分离到相应菌株 ,其 Ct值为 34156。 3　讨论 本研究建立了实时荧光 PCR的方法检测 ETEC菌株 ST Ia 和 ST Ib毒力基因。国内对 ETEC菌株的检测主要是通过菌株 血清型的菌体抗原的鉴定和常规 PCR进行。依靠血清型进行 鉴定 ,不能区分菌株有无毒力 ;常规 PCR需通过凝胶电泳进行 结果的分析和判定 ,费时费力 ,且只能定性不能定量。实时荧 光 PCR较常规 PCR更为敏感和特异 ,操作简便快速。国外已 经采用实时荧光 PCR检测 ETEC或其它大肠埃希菌毒力基 因 , Reischl U等 [ 4 ]应用两重实时荧光 PCR检测了 ETEC的 LT 308中国卫生检验杂志 2007年 5月 第 17卷 第 5期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology,May 2007; Vol 17　No 5 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 基因和 ST基因 ; Grant MA等 [ 5 ]应用多重实时荧光 PCR从食 品中检测 ETEC的 LT基因和 ST基因。国内尚未见应用实时 荧光 PCR从腹泻病人大便中直接检测 ST Ia和 ST Ib毒力基因 的报道。本研究应用 Taqman荧光探针 ,其 5′端标记荧光基 团 , 3′端标记非荧光素的猝灭基团 (可以避免对荧光基团的干 扰 ) ,进行实时荧光 PCR检测 ,可增加反应特异性 ,提高了检测 效率。 本研究应用的普通 PCR检测引物 (内含有兼并碱基 )为 ST基因的通用引物 ,扩增 ST Ib基因具有较高的反应效率 ,但 扩增 ST Ia基因电泳荧光条带较弱 ,反应效率偏低。ST Ia和 ST Ib基因间变异较大 ,序列一致性相对低 ,而 TaqMan实时 PCR的特点是扩增序列的特异性高 ,故本研究设计了两组引 物和探针来分别扩增 ST Ia和 ST Ib基因 ,以保持检测的高效 性和高敏感性。 应用实时荧光 PCR直接检测粪便标本 ,本研究采用以 BP 增菌 4 h后煮沸法提取 DNA模板。适当时间的 BP增菌可稀 释粪便中的 PCR抑制物 ,并增加目的致病菌浓度 ;但过长的增 菌时间反而会造成检测效率的降低。我们曾应用此法进行粪 便标本中携带志贺毒素基因和 eae基因大肠埃希菌的检测 ,取 得较好的效果。本研究中直接实时荧光 PCR检测的 90份腹 泻病人肛拭子标本均来源于临床腹泻病人 ,结果 9份标本为 ST Ib基因阳性 , 2份标本为 ST Ia基因阳性。将原始标本划线 麦康凯平板和大肠杆菌显色平板 ,挑取菌落鉴定后 ,从 8份标 本中分离到 ST Ib基因阳性菌株 ,从 2份标本中分离 ST Ia基 因阳性菌株 ;菌株分离率极高 ,其可能原因 :携 ST的 ETEC为 引起腹泻病人致泻的主要致病菌 ,标本中致病菌含量较高 (反 映在直接实时荧光 PCR结果上是 Ct值较低 (18161～30116)。 1份 ST Ib基因阳性标本 ,未分离到阳性菌株 ,这份标本实时荧 光 PCR Ct值较大 (34156) ,细菌含量相对较低 ,故挑取 5个可 疑菌落进行实时荧光 PCR未分离到阳性菌落 ,但经普通 PCR 验证此标本确为 ST Ib基因阳性。 实时荧光 PCR可在 6 h (内含 BP增菌的 4 h)内判定标本 内有无相关毒力基因的菌株 ,且可对致病菌的含量作出评估 , 为突发卫生事件中致病菌的分离鉴定和溯源提供强有力的线 索 , 可应用于 ETEC菌株的鉴定和检测及食物中毒和临床腹 泻标本的快速筛检。 [参考文献 ] [ 1 ] Stacy - Phipp s S, Mecca JJ, W eiss JB1Multip lex PCR assay and sim2 p le p reparation method for stool specimens detect enterotoxigenic Esch2 erichia coli DNA during course of infection[ J ]1J Clin M icrobiol, 1995, 33 (5) : 1054 - 10591 [ 2 ] 马广强 ,张维军 ,栾婧婧 ,等 1直接从粪便中检测致犊牛腹泻产肠 毒素大肠杆菌的双重 PCR方法的建立与应用 [ J ] 1中国人兽共患 病杂志 , 2006, 22 (2) : 153 - 1561 [ 3 ] 张雪寒 ,何孔旺 ,张书霞 ,等 1ETEC肠毒素基因多重 PCR检测方 法的建立 [ J ]1中国人兽共患病杂志 , 2003, 19 (2) : 67 - 701 [ 4 ] Reischl U, Youssef MT, Wolf H, et a l1Real - time fluorescence PCR assays for detection and characterization of heat - labile I and heat - stable I enterotoxin genes from enterotoxigenic Escherich ia coli [ J ] 1J Clin M icrobiol, 2004, 42 (9) : 4092 - 41001 [ 5 ] GrantMA, Hu J, J inneman KC1Multip lex real - time PCR detection of heat - labile and heat - stable toxin genes in enterotoxigenic Escherichi2 a coli[ J ]1J Food Prot, 2006, 69 (2) : 412 - 4161 [ 6 ] J inneman KC, Yoshitom i KJ, W eagant SD1Multip lex real - time PCR method to identify shiga toxin genes stx1 and stx2 and Escherich ia coli O157: H7 /H - Serotype[ J ] 1App l Environ M icrobiol, 2003, 69 ( 10 ) : 6327 - 63331 (收稿日期 : 2006 - 12 - 05) (上接第 778页 ) 图 3　韭菜加标样品色谱图 11甲氰菊酯 ; 21三氟氯氰菊酯 ; 31氯氰菊酯 ; 41氰戊菊酯 ; 51溴氰菊酯 表 3　5种拟除虫菊酯类农药在韭菜样品中加标回收率 化合物 本底值 (μg/m l) 添加量 (μg/m l) 实测值 (μg/m l) 回收率 ( % ) 甲氰菊酯 未检出 011 0110094 100194 三氟氯氰菊酯 未检出 011 0109578 95178 氯氰菊酯 未检出 011 0110264 102164 氰戊菊酯 未检出 011 0109873 98173 溴氰菊酯 未检出 011 0108626 86126 3　小结 采用柱层析净化技术并结合毛细管气相色谱法在μ - ECD检测器上同时测定韭菜样品中 5种拟除虫菊酯类农药多 残留组分。方法线性范围较宽 ,最小检测限符合国家标准要 求 ,相对标准偏差均小于 10% ,其加标回收率在 86126% ～ 102164% 之间。本研究所建立的方法简便、快速、经济 ,具有 良好的灵敏度、精密度和准确度 ,可以满足韭菜样品中拟除虫 菊酯类农药多残留检测 ,同时对其他蔬菜中拟除虫菊酯 类农药多残留分析具有一定的参考价值。 [参考文献 ] [ 1 ] 陈剑刚 , 朱克先 , 张亦庸 , 等 1固相萃取 - 气相色谱 - 质谱联用 测定水体中拟除虫菊酯残留 [ J ]1现代预防医学 , 2005, 32 (6) : 648 - 6501 [ 2 ]张存政 , 徐金男 , 骆爱兰 ,等 1菊酯类农药在梨中的多残留测定方 法研究 [ J ]1现代农药 , 2004, 3 (4) : 16 - 181 [ 3 ] Chen ZM, Yan YH1Chromatographaphic methods for the determ ination of pyrethrin and pyrethrioid pesticide residues in crop s, foods and envi2 ronmental samp les[ J ]1Chromatogr A, 1996, 754 (1 - 2) : 367 - 3951 [ 4 ]李云春 , 易军 , 弓振斌 ,等 1反相高效液相色谱法测定茶叶中氯氰 菊酯和氰戊菊酯农药残留 [ J ] 1厦门大学学报 (自然科学版 ) , 2003, 42 (1) : 78 - 821 [ 5 ] 农业部农药检定所 1农药残留量实用检测方法 [M ] 1第 1 卷. 北京 :中国农业科技出版社 , 19951 (收稿日期 : 2006 - 12 - 21) 408 中国卫生检验杂志 2007年 5月 第 17卷 第 5期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology,May 2007; Vol 17　No 5 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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