1994年_2004年杭州地区O139群霍乱弧菌携SXT元件和整合子的特征

文章编号: 100128689 (2007) 1020631205 1994 年～ 2004 年杭州地区O139 群霍乱弧菌 携 SXT 元件和整合子的特征 潘劲草　叶榕　张蔚　孟冬梅　汪皓秋 (杭州市疾病预防控制中心, 　杭州 310006) 　　摘要: 　目的　了解杭州地区O 139 群霍乱弧菌菌株携带 SXT 元件和整合子的特征。方法　对 1994 年～ 2004 年杭州地区腹泻 患者分离的 ctxA 阳性霍乱弧菌O 139 群菌株 25 株 (1994 年～ 2004 年)、O 1 群菌株 (1997 年～ 2001 年) 18 株, 应用 PCR 进行 SXT 元件和 I类整合子检测, 并对 I类整合子携带的基因盒进行核酸序列测定, 同时检测菌株对 10 种抗生素的耐药谱。结果　1994 年分 离的浙江省首株O 139 群菌株即开始携带 SXT 元件。1994 年～ 2004 年分离的 25 株O 139 群菌株中, SXT 元件携带率为 96100% ( 24ö25) ; 18 株O 1 群菌株 (1997 年～ 2001 年) 均属O 139 群出现后分离的, SXT 元件为 83133% (15ö18)。 I 类整合子最早出现于 1998 年分离的O 139 群菌株, 总阳性率为 60100% (15ö25) ; 在 2000 年以后检出的O 139 群菌株中, 携带率为 81125% (13ö16) ; I 类 整合子中的基因盒阵列有两种: 一为 aadA 2, 占 93133% (14ö15) ; 另一为 df rA 12+ orf F + aadA 3c, 占 6167% (1ö15)。18 株O 1 群菌 株 (1997 年～ 2001 年)中未发现有 I类整合子。结论　SXT 元件在O 139 群 (1994 年～ 2004 年)和O 1 群 (1997 年～ 2001 年)霍乱弧 菌中有较高的携带率。I类整合子在 2000 年以后检出的O 139 群菌株中有较高的携带率。携带的基因盒提示,O 139 群菌株与其他细 菌可能通过 I类整合子途经交换对抗生素耐药基因。 关键词: 　霍乱弧菌; 　SXT 元件; 　整合子; 　耐药性 中图分类号: R 965　　　文献标识码: A SXT elem en t and cla ss 1 in tegron in V ibr io cholerae O 139 isola tes in Hangzhou area dur ing 1994～ 2002 Pan J ing2cao , 　Ye Rong, 　Zhang W ei, 　M eng Dong2m ei　and　W ang H ao2qiu (H angzhou Cen ter fo r D isease Con tro l and P reven tion, 　H angzhou 310006) 　　ABSTRACT　Objective　To invest iga te the characterist ic of SXT elem en t and in tegron in V ibrio cholerae O 139 serogroup iso la tes in H angzhou. 　M ethods　 In ctxA 2po sit ive V . cholerae O 139 iso la tes fo r an 112year period (n = 25, 1994～ 2004) and O 1 iso la tes (n = 18, du ring 1997～ 2001) from diarrhoea pat ien ts, SXT elem en t w as exam ined by PCR specif ic to the in tegrase gene in tsx t, and class 1 in tegron w as tested by th ree PCR sets ta rget ing the 5′2con served segm en t (5′2CS) , the 3′2CS, and the casset te reg ion of class 1 in tegron. T he gene casset te of class 1 in tegron w as iden t if ied by sequencing the PCR p roducts covering the casset te reg ion. M eanw h ile the resistance pa t tern s of these O 139 iso la tes to 10 an t ib io t ics w ere determ ined by the d isc d isfu s2 sion m ethod. 　Results　SXT elem en t w as found in the first O 139 iso la tes in Zhejiang co llected in 1994. 9610% ( 24ö25) of O 139 iso la tes du ring 1994～ 2004 and 8313% (15ö18) of O 1 iso la tes du ring 1997～ 2001 harbo red SXT elem en t. C lass 1 in tegron w as found in 6010% (15ö25) of O 139 iso la tes (1994～ 2004) , em erg ing first in one O 139 iso la te co llected in 1998. In O 139 iso la tes co llected after 2000, class 1 in tegron2po sit ive ra te increased to 8113% (13ö16). Tw o arrays of gene casset te w ere iden t if ied in the 15 O 139 iso la tes harbo ring class 1 in te2 gron. O ne has one casset te w ith aadA 2, found in 14 O 139 iso la tes (9313% ). A no ther has th ree casset tes w ith df rA 12+ orf F + aadA 3c, found in one O 139 iso la te (617% ). N one of the 18 O 1 iso la tes (1997～ 2001) w as detected po sit ive fo r class 1 in tegron. 　Conclusion 　SXT elem en t p reva iled bo th in O 139 iso la tes (1994～ 2004) and O 1 iso la tes (1997～ 2001) in H angzhou. C lass 1 in tegron p reva iled in the O 139 iso la tes after 2000. 收稿日期: 2006211220　　修回日期: 2007204211 作者简介: 潘劲草, 男, 生于 1965 年, 博士, 主任技师。研究方向: 肠道致病菌耐药分子耐药机制。　Em ail: jingcaopan@ sina. com ·136·中国抗生素杂志 2007 年 10 月第 32 卷第 10 期 Based on the gene casset tes iden t if ied, t ran sfer of resistance gene betw een V . cholerae O 139 serogroup and o ther bacteria m igh t occu r th rough the m echan ism of class 1 in tegron. KEY WORD S　V ibrio cholerae; 　SXT elem en t; 　 In tegron; 　R esistance 　　近年,O 139 群霍乱弧菌多重耐药菌株在各地频繁 检出[ 1, 2 ]。多重耐药菌株的形成可能有多种机制, 细菌 可移动遗传元件 (m ob ile genet ic elem en ts,M GE)可以 在同种甚至于不同种菌株间水平转移, 加速了临床上 耐药及多重耐药菌株产生。有报道在O 1 群霍乱弧菌 中检出多重耐药性的接合性质粒。另外, 1996 年在 O 139 群霍乱弧菌中发现一种整合性接合元件 ( in te2 gra t ing con juga t ive elem en t, ICE) , 该元件整合于细菌 染色体上 p a rC 基因内, 长约 100kbp , 编码对磺胺甲 口恶唑 ( su lfam ethoxazo le) 和甲氧苄啶 ( t rim ethop rim ) 的耐药性, 并因此称为 SXT 元件[ 3 ]。近年来, 多项研究 在O 1 和O 139 群霍乱弧菌株的 SXT 元件中发现多重 抗生素耐药基因。整合子为革兰阴性细菌中的一种基 因捕获和表达的遗传单位, 也有报道在霍乱弧菌中检 出携带抗生素耐药基因 I类整合子[ 4 ]。 O 139 群霍乱弧菌的暴发流行是于 1992 年在印度 和孟加拉首次发现, 随后波及邻近亚洲国家。我国于 1993 年首次在新疆发现该菌, 浙江省于 1994 年首次 在杭州市检获O 139 群霍乱弧菌株[ 5 ] , 至今已成为霍 乱流行的优势菌, 并且出现了多重耐药菌株流行[ 2, 6 ]。 本文对 1994 年～ 2004 年杭州地区O 139 群和O 1 群 霍乱弧菌部分菌株进行 SXT 元件和整合子进行检测, 探讨它们与菌株耐药性的关系。 1　材料和方法 1. 1　菌株 选取自杭州市腹泻患者分离的 ctxA 阳性霍乱弧 菌O 139 群菌株 25 株 (1994 年～ 2004 年)、O 1 群菌株 (1997 年～ 01 年) 18 株。所有菌株来自无关的散发或 暴发病例, 核糖体基因分型 ( ribo typ ing) 结果按文献[ 2 ] (表 1)。 1. 2　药物敏感性试验 药敏试验采用W HO 推荐的改良 K irby2Bauer 纸 片法, 其结果判定参照卫生部制订的《纸片法抗菌药物 敏感试验标准》(W SöT 12521999)。药敏试验质控菌株 为大肠埃希菌A TCC25922 株。M H 琼脂和药敏纸片 购自杭州微生物试剂厂。11 种药敏纸片包括: 氨苄西 林 (AM PC)、链霉素 (SM )、庆大霉素 (GM )、阿米卡星 (AM K)、四环素 (T ET )、多西环素 (DOX )、氯霉素 (CHL )、复方磺胺甲口恶唑 (SM ZöTM P, SXT )、诺氟沙 星 (N FL X)和环丙沙星 (CPL X)。 1. 3　SXT 元件的 PCR 检测 PCR 扩增 SXT 元件中的整合酶 ( in tegrase) 基因 ( in tsx t ) 以检测 SXT 元件, 引物 IN T 1 和 IN T 2 按文 献[ 7 ]。PCR 引物由上海生物有限公司合成, PCR 试剂购自上海生物工程有限公司。 PCR 仪为德国 B iom etra 公司的 T Gradien t。模板DNA 用细菌过夜培 养肉汤煮沸法制备。PCR 反应体积为 25Λl, 含 1×缓冲 液、M gC l2 115mm o löL、dN T P s 012mm o löL、一对引物 各 014Λm o löL、T aq 酶 25U öm l 及 1Λl 模板DNA。反应 程序为: 94℃ 4m in 预变性DNA 后, 按 94℃变性 20s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 30s, 进行 32 个循环, 最后一 个循环结束后, 72℃延伸 4m in; 用含 015Λgöm l 溴化乙 锭的 110% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 1. 4　 I类整合子的检测及基因盒的鉴定 应用 3 对引物 ( in t I1L 和 in t I1R [ 8 ]; in2F 和in2B [ 9 ]; qacE∃12F 和 su l12B [ 9 ] ) 扩增 I 类整合子 5′保守区段 (in tI 1)、可变区段 (基因盒区) 及 3′保守区段 (qacE ∃1 和 su l1)。反应程序为: 94℃ 5m in 预变性DNA 后, 按 94℃变性 30s, 68℃退火 30s, 72℃延伸 60s, 进行 10 个 循环, 其中退火温度每一循环降 114℃; 然后再按 94℃ 变性 30s, 52℃退火 30s, 72℃延伸 60s, 进行 35 个循 环, 最后一个循环结束后, 72℃延伸 4m in。当进行 I类 整合子可变区段扩增时, 每个循环 72℃延伸时间均为 4m in。其余 PCR 条件与上节相同。对基因盒区的扩增 产物, 用限制性内切酶 H indË 进行鉴定; 并将基因盒 区的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后, 切取阳性条带, 用 胶回收试剂盒纯化后, 寄送上海生工进行直接测序。 1. 5　核酸序列分析 由网上分析工具 (h t tp: ööwww. ncb i. n lm. n ih. govöBLA ST ö) 执行。2 株O 139 群代表菌株 (0419 株 和 99105 株) 的 I 类整合子基因盒区的序列的 Gen2 Bank 登录号为DQ 789597 和DQ 789598。 2　结果 2. 1　SXT 元件的携带情况 ctxA 阳性的O 139 群和O 1 群霍乱弧菌株均有较 高的 SXT 元件携带率 (表 1)。 25 株 O 139 群菌株 (1994 年～ 2004 年) 和 18 株 O 1 群菌株 (1997 年～ 2001 年) 中, SXT 元件 in tsx t 基因的阳性率分别为 96100% (24ö25) 和 83133% (15ö18)。包括 1994 年分 离的浙江省历史上首株O 139 群 94297株即开始携带 ·236· 1994 年～ 2004 年杭州地区O 139 群霍乱弧菌携 SXT 元件和整合子的特征　潘劲草等 　　　　表 1 　　　　O 139 群霍乱弧菌菌株的可移动元件携带情况及耐药性 菌株 年份 ctxA 核糖分型 SXT 元件 I　类 整合子 基因盒 耐　　药　　性 AM PC SM GM AM K T ET DOX CHL SXT N FL X CPL X 0419 2004 + II + + aadA 2 R R R S R R R R S S 048 2004 + II + - - S R S S S S S S S S 045 2004 + N T + + aadA 2 S S S S S S S S S S 044 2004 + II + + aadA 2 R R R S R I R R S S 037 2003 + II + + aadA 2 R R R S R R R R S S 032 2003 + II + + aadA 2 R R R S R S R R S S 026 2002 + II + + aadA 2 R R R S R S R R S S 023 2002 + II + + aadA 2 R R R S R S R R S S 0134 2001 + II + + aadA 2 R R R S R R R R S S 0130 2001 + II + - - R S S S S S I R S S 0118 2001 + II + + aadA 2 R R S S R R R R R R 0115 2001 + II + + aadA 2 R S S S S S S R R R 011 2001 + II + + aadA 2 R R R S S S R R S S 0027 2000 + II + + aadA 2 R R R S R I R R S S 0024 2000 + II + - - I R S S S S S R S S 001 2000 + N T + + aadA 2 R R R S R S R R S S 99105 1999 + IV + + df rA 12+ orf F R R S S R R R R S S + aadA 3c 9972 1999 + V II + - - S S S S S S S R S S 9887 1998 + IV + - - S I S S R S I S S S 9868 1998 + IV + + aadA 2 R R S S R R R R S S 9796 1997 + IV + - - R R R S R I R R S S 976 1997 + IV - - - R R S S S S I R S S 975 1997 + IV + - - S R S S S S I R S S 9613 1996 + V + - - R I S S S S S R S S 94297 1994 + I + - - R S S S S S I R S S 　　N T: 未检测。　　3 R: 耐药; 　 I: 中介; 　S: 敏感。 SXT 元件。 2. 2　 I类整合子的携带情况 25 株O 139 群菌株 (1994 年～ 2004 年) 中, I 类整 合子的阳性率为 60100% (15ö25)。携带 I类整合子的 O 139 群菌株首先于 1998 年出现。 I 类整合子中的基 因盒阵列有 2 种: 一种仅含一个基因盒, 包含一个开放 读码框 aadA 2 及一个 a ttC 位点, 该种基因盒阵列占 检出的 I 类整合子总数的 93133% (14ö15)。另一种含 三个开放读码框, 依次分别为 df rA 12、orf F 和 aadA 3c; 其中 df rA 12 和 aadA 3c 的下游均有各自的 a ttC 位点, 各自构成了完整的基因盒, 而 orf F 下游未 发现有典型的 a ttC 位点; 该基因盒阵列仅占检出的 I 类整合子总数的 6167% (1ö15)。基因盒中 df rA 编码 二氢叶酸还原酶 (d ihydrofo la te reductase) , 赋予菌株 对三甲氧苄二氨嘧啶 ( t rim ethop rim , TM P) 的耐药性; aadA 编码氨基糖苷腺苷酰基转移酶 (am inoglyco side adenylylt ran sferase) , 赋予菌株对链霉素和大观霉素 的耐药性。在所有 18 株O 1 群菌株 (1997 年～ 2001 年)中未发现有 I类整合子。 2. 3　菌株的耐药性 检测的 25 株O 139 群菌株仅对阿米卡星均敏感, 对其他 9 种抗生素有不同比例的菌株呈耐药。有 2 株 2001 年分离的菌株对两种喹诺酮类抗生素 (诺氟沙星 和环丙沙星)耐药, 其余菌株均呈敏感。3 株携带 SXT 元件的菌株对 SXT 呈敏感, 21 株携带 SXT 元件的菌 株和 1 株无 SXT 元件的菌株对 SXT 耐药。14 株携带 aadA 2基因盒的菌株中, 有 12 株对链霉素耐药, 2 株 敏感; 1 株携带 df rA 12+ orf F + aadA 3c 基因盒的菌 株对链霉素耐药; 10 株不携带 I 类整合子的菌株中, 对链霉素呈耐药和中介的分别有 5 株和 2 株, 呈敏感 的有 3 株。 3　讨论 O 139 群霍乱弧菌株于 1992 年出现后至今, 一般 均携带 SXT 元件[ 3, 10 ]。杭州地区于 1994 年首次检出 O 139 群霍乱弧菌。本文检测的杭州地区 1994 年～ 2004 年分离的 25 株O 139 群菌株中, SXT 元件有较 高的携带率[96100% (24ö25) ], 仅 1 株 1997 年分离的 菌株未携带。在O 1 群霍乱弧菌菌株中, SXT 元件或 SXT 有关的 ICE 主要是在O 139 群菌株出现后分离 的菌株中出现。有报道, 在印度加尔各答 SXT 元件主 要在O 139 群霍乱暴发后 (即 1993 年后)的O 1 群菌株 中检出, 之前的O 1 群菌株中检出极少[ 11 ]; 检测老挝的 ·336·中国抗生素杂志 2007 年 10 月第 32 卷第 10 期 O 1 群菌株, 发现 1993 年到 1996 年分离的菌株未发现 有 SXT 元件, 而 1997～ 2000 年的菌株均检出 SXT 元 件[ 4 ]。本文检测的杭州 18 株O 1 群菌株 (1997 年～ 2001 年)均属O 139 群出现后分离的, SXT 元件也具 有高携带率, 达 83133% (15ö18)。 SXT 元件或 SXT 有关的 ICE 并不仅限于霍乱弧 菌中被发现, 在雷氏普罗威登斯菌 ( P rov id encia rettg eri)中发现的一种整合于染色体上的接合性元件 R 391 与 SXT 元件密切相关[ 12 ] , 至今有超过 25 个 SXT öR 391 ICE 家族成员在变形细菌纲 (P ro teobacte2 ria) Χ亚纲中的许多种内发现[ 13 ]。与 R 391 相比, SXT 元件上有数个可插入外源 DNA 片段的热点 (ho t spo t) , 插入的片段往往含有抗生素耐药基因; 在不同 来源的 SXT 元件间, 携带的抗生素耐药基因可有不 同[ 4, 7 ]。携带抗生素耐药基因的 SXT 元件或 SXT 有关 的 ICE 在细菌种甚至属间的传播, 导致临床上耐药及 多重耐药菌株的出现。最初鉴定的O 139 群菌株中 SXT 元件编码对 SXT、TM P 和 SM 的耐药性[ 3 ] , 然而 在本文检测的杭州携带 SXT 元件O 139 群菌株中, 尽 管对 SXT 和 SM 有较高的耐药率, 但在个别菌株中仍 发现对两者敏感, 可能的解释之一是: 其 SXT 元件中 有关的耐药性基因缺失。有报道, 1992 年和 1993 年孟 加拉暴发O 139 群菌株对 SXT、TM P 和 SM 有耐药 性, 而 6816% 的 1995 年的暴发O 139 群菌株却敏感, 进一步的分子分析揭示了后者的 SXT 元件有约 316kbp 片段的缺失[ 14 ]。杭州O 1 群和O 139 群霍乱弧 菌 SXT 元件上“热点”中携带的抗生素耐药基因的特 征有待阐明。 检测的杭州地区 1994 年～ 2004 年O 139 群菌株 中, I 类整合子最早出现于 1998 年分离的菌株; 在 2000 年以后检出的菌株中, 有较高的携带率, 为 81125% (13ö16)。杭州 18 株 O 1 群菌株 (1997 年～ 2001 年)均未检出 I类整合子。I类整合子在临床和环 境来源的霍乱弧菌中均有不同程度的检出[ 4, 11, 15 ]。在 印度加尔各答 1992 年～ 2000 年的O 139 群菌株中, I 类整合子携带率 2122% (1ö45) [ 16 ]; 而另一个对印度加 尔各答O 1 群分离菌株的研究发现, I 类整合子主要在 O 139 群霍乱暴发前 (即 1992 年前) 的O 1 群菌株中检 出, 之后的O 1 群菌株中检出极少[ 11 ]。老挝 1993 年到 1996 年分离的 26 株O 1 群菌株中, 24 株 (92131% ) 携 带 I类整合子, 而在 1997～ 2000 年的 24 株O 1 群菌株 均未检出[ 4 ]。 至今在霍乱弧菌菌株中发现的 I 类整合子基因盒 主要为 df rA 和 aadA 家族成员, 也有一些菌株发现有 aac (6′)、ereA 、aa r、blaP 和 qacH 家族成员及少量不 知功能的开放阅读框[ 15, 17, 18 ]。检测杭州O 139 群菌株 中 I类整合子基因盒主要为 aadA 2, aadA 赋予菌株对 链霉素和大观霉素的耐药性。有 2 株菌株尽管含有 aadA 2, 但仍对链霉素敏感; 类似地, 我们在志贺菌整 合子的研究中也发现, 有些 I 类整合子尽管含有 aadA 家族成员, 但可能并不赋予菌株对链霉素的耐药 性[ 19 ] , 其原因有待阐明。 含有 aadA 2 基因盒的 I 类整合子已在非常多的 革兰阴性菌中发现。本文中检出的另一种 I 类整合子 基因盒为 df rA 12+ orf F + aadA 3c, 类似的基因盒在 1996 年～ 1997 年几内亚比绍分离的O 1 群中霍乱弧 菌中也被发现 (被鉴定为 d hf rX I I + orf F + an t (3" ) 2 1a) , 位于一个约 150kbp、编码多重耐药的接合性质粒 上[ 20 ]。此外 df rA 12+ orf F + aadA 3c 样基因盒也有在 许多肠杆菌科细菌、金葡菌和铜绿假单胞菌的分离株 中检出。结果提示耐药基因盒通过整合子的捕获机制 在霍乱弧菌间及与其他细菌间传递。 参 考 文 献 [ 1 ] 陈拱立, 陈亮, 陈爱平, 等. 1995～ 1998 福建省O 139 群霍 乱弧菌的药物敏感性的检测 [J ]. 中华流行病学杂志, 1999, 20 (霍乱专辑 1 号) : 397～ 401. 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(上接第 607 页) 6h 后, 产率增长不明显。我们选定反 应时间为 6h。 大量实验结果表明, DM A P 用量为醇用量的 3% 左右、脱水剂DCC 和反应物等摩尔、反应温度低于室 温, 酯化效果较好。 4　结论 以 (22氨基噻唑242基) 乙酸甲酯为起始原料制得 头孢布烯的关键中间体 22(22苄氧羰基氨基噻唑242 基) 252(32甲基222丁烯氧羰基) 222戊烯酸。该工艺具有 原料易得、操作简单可控、产品质量好、收率高等特点, 适合工业化生产。 参 考 文 献 [1 ] Bauernfeind A. Ceft ibu ten and bacteria l k inet ics, compar2 at ive in v itro act ivity again st en terobacteriacae p roducing ex tended spectrum Β2lactam ases [ J ]. D iag n M icrobiol Inf ect D is, 1991, 14 (1) : 89～ 92. [2 ] Barry A , Fuch s P C, Pfaller M A. Suscep tib ilit ies of Β2 lactam ases p roducing and nonp roducing amp icillin2resis2 tan t stra in s of H aemoph ilu s influenzae to ceft ibu ten, cefa2 clo r, cefu rox im e, cefix im e, cefo tax im e and amox icillin2clavu lan ic acid [J ]. A ntim icrob A g en ts Chem other, 1993, 37(1) : 14～ 18.[3 ] Bernascon i E, L ee J , Sogli L , et a l. Ceft ibu ten: develop2m ent of a comm ercial p rocess based on cephalo spo rin C.Part III. 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