热处理对鲜豆奶中胰蛋白酶抑制子活性的影响

巷盘豳 2001年第三期 Food Science and Technology No．3，2001■ 热处理对鲜豆奶中胰蛋白酶抑制子活性的影响 黄惠华 周春晖 (华南理工大学食品与生物学院 广州 -510640) Effect of Thermal Treatment on Trypsin Inhibitor Activity of Soybean ItUANG HIII-him Z#tOU CbuJa-II~ (South China L'niversity of Technology，Cuangzhou，510640) b．b61ruct：Soy ,milk sample~ re日ubjee~edto heating Bt 95 ．I2O and140％in o~ler findthe effect ofthemmltreBt~ult otl坪p nj孔hi 10r aeti~ty．The expere~enfion Te~ult indicated that the holding【im to inactivate 90％ of soy bean inhibitor aeti~ Bt 95 120℃ and 140屯 ere 35 mln，7 IⅡjn a 60螗c respectively The them~l deⅡ fine(11玎) e inaieatedⅡm the ho]dlng time required to inactivate 90％ of帅ybeat tryl~in inhibitor o伽 be duced teD folds by T丑ismg temperatrue about 3O屯 Key words：~ymillk，thermal Lm ％t ． 时 p 口 inhil~itor 摘要：分别以95℃、120℃、140~C三种温度处理 鲜豆奶，研究热处~g-lt蛋白酶抑制子活性的影 响。测定结果表明要达到胰蛋白酶抑制子90％的 失活率，95℃时需要35rain；120℃时需要7rain；而 140℃时只需要 60s左右。胰蛋白酶抑制子的热致 死时问曲线表明，加热温度增加 3O℃，钝化腱蛋 白酶抑制子90％的热处理时间可缩短 l0倍。 关键词 ：大豆；胰蛋白酶抑制子；热处理 中图分类号：TS214．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005—9989(2001)03—17007—03 0 前言 大豆中的抗营养困子主要是胰蛋白酶抑制子 。已 经证实大豆胰蛋白酶抑制子会导致许多动物的生长抑 制作用，例如鸡、老鼠及兔子的胰腺肥大 (Rackis et a1．， 1963) 因此 ．豆奶的加工必需考虑对胰蛋白酶抑制子 的失活以消除毒性和改善营养价值。胰蛋 白酶抑制子 的失活，通常可以通过物理或化学的，例如加热及 超声波处理可 以失活胰蛋 白酶抑制子 (Kowk et a1． 1993；Hour et a1．，1998；Rouhana et o1．，1996；杨汝德等， 1998j，化学方法主要是对胰聋 白酶抑制子活性中心的 某 些基 团进行化 学修 饰 、还 原 、封闭及 酶解等 等 (Friedman et o1．．1982；Kat0＆Natsuda．1997；Jiao et o1．， 1992；Steiner,1965；Vaintmub et al，1995)。从豆奶加工 的角度来看 ，加热是钝化胰聋白酶抑制子最佳的技术 。因为加热法简单易行 ；另外，通过适当的温度，还 可以同时达到灭菌的作用。因此本试验用三种不同温 度处理大豆水浸提液 ，从而探讨 出热处理过程对鲜豆 奶 中胰蛋白酶抑制子活性的影响。 1 材料和方法 1．1 大豆水浸提液的制备 市售大豆，按大豆：水 =1：10的比例加水 ，于 5℃ 的冰箱内浸泡过夜 ，然后用打浆机将大豆打碎 、打匀。 收藕 日期 ：201)I一03一I1 基盒项目 广东省 自然升学差奎硬目(0oo454)。 作者筒介：黄惠单(1959一)，男，广西人，博士，刮教艘 ，从事食品分 离技术和食品生物技术方面的研克。 所得 的混合浆用尼龙袋过滤两次 ，弃去滤渣，所得即为 鲜豆奶 其 固形 物含量 为 6 7％ ，蛋白质 含 量为 3 1％ 。该浸提液可放人冷冻室保藏待用。 1 2 豆奶的热处理 豆奶的热处理是在一个特制的螺旋状铜制 毛细管 (自制)中进行的，管的两端安装有小阀门。装好物料后 的毛细管，关上两端阀门，于22cm直径的铝锅中，浸没 于已预热至预定温度的传热介质 (聚乙二醇 4OO)中， 加热过程中不断摇动毛细管，使管内物料迅速升温至 所要温度。达到预定时间后 ．立即将毛细管移至冷水中 冷却。冷却后的样品可以放在冷冻室 内储藏备用。 1．3 胰蛋 白酶活性爱胰蛋白酶抑制子活性 的测定 一 个胰蛋 白酶 的活性定义为在规定 的实验条件 下，每 lOmL反应混合液在 410nm处所增加 0．01个吸 光度 ，用TU表示。每抑制一个胰蛋 白酶活性单位 ，定 义为一个单位的胰蛋白酶抑制子活性 ，用 TlA表示。胰 蛋 白酶及胰蛋白酶抑制子活性的测定参照 Smith 和 美 国化学学会 (AACC)推荐的方法进行 。胰蛋白酶 (EC3．4．21．4)为猪胰脏胰蛋白酶 ，Sigma公司产品。底 物 为 BAPNA(N—d—Benzoyl—DL—Arginine—P—Ni- troanilide—Hydroehloride，苯甲酰 一DL一精氨酸 一P一 硝基酰替苯胺盐酸盐 Acros Ogenics公司产品)。胰蛋 白酶用0．001mol／L的 HCI配制成 201~g／mL的溶液。 BAPNA 用 适 量 二 甲基 亚砜 溶 解 后 ， 用 pH8 2、 0．05mol／L的 Tris缓冲液配制成 0．4mg／mL的溶液。 测定时进行的加样量试验表明，测定系统中无鲜豆奶 样品存在时．胰蛋白酶的活性是 1590TU／mg，此时抑 制率为零 ；加人不同的鲜豆奶样品，胰蛋白酶活性下 降。当鲜豆奶加样量达到 201~L时，反应混合液 中测不 出410nm处的吸光度 ，此时胰蛋白酶的活性为零，而 胰蛋 白酶抑制子的活性残留率和对胰蛋 白酶活性的抑 制率为100％ (通过计算得到鲜豆奶中的胰蛋白酶抑 制子的活性为 3180TIA／rn【_)。热处理后样品中胰蛋白 酶抑制子的残留活性、残留率及对胰蛋 白酶活性的抑 制率介于上面的范围中，困此 ，测定样品的加样量确定 为 201~L。测定按如下程序进行 ：测定中所有用到的溶 液均预热至 37℃ ，吸 2mL胰蛋白酶溶液于具塞试管 ■ FoDd Science d Techn。 No．3 2001 中，加^ 2{) L经不同温度与不同时问热处理 的鲜豆 奶样品、1．98mLlrris缓冲液和 5mL BANPA溶液 ，于 Tempunite Tu一16A型水 (油)浴锅中用 37℃保温反应 ]0min，中间摇动3次，然后加人 lmL30％的乙酸溶液 终止反应，反应混合液用定量滤纸过滤后 ，用 lcm比色 杯 在 HITACHI U20OOUV／VIS分光 光 度计 上测定 其 410nm的吸光度 空白为把乙酸溶液与BAPNA溶液的 加^顺序对换，即胰蛋白酶先与乙酸混合失活，BAPNA 溶液作最后加入，其它过程保持不变。通过样 品测定的 吸光率与空 白读数相减 ，所得值与样 品加八量 为零时的 吸光率的差值，即可算出样品中残留的胰蛋 白酶抑制子 活性，测定重复 3次。 2 结果与讨论 2 1 胰蛋 白酶抑制子的活性测定结果 根据对胰蛋 白酶活性及胰蛋 白酶抑制子活性的定 义 ，本实验测到的鲜豆奶 中胰蛋白酶抑制子的活性为 3180TIA／mL，如果换算成另 种单位 ，即按每克大豆干 样 品所抑制的纯胰蛋白酶毫克数来表示胰蛋白酶抑制 子 活 性 的话 ，根 据测 到 的 胰蛋 白酶 制剂 的 活性 (159OTU／mg)及鲜豆奶的固形物含量 (6．7％)，换算后 的胰蛋白酶抑制子活性是30 76mg／g左右。此测定值与 杨汝德、Smith等人的报道相近。 2．2 95℃热处理下胰蛋白酶抑制子失活状况 率实验中，鲜豆奶经热处理后 ，胰蛋白酶抑制子活 性明显下降， 样品中胰蛋白酶抑制子残留活性的百分 率表示，不同温度处理不同时间后的胰蛋白酶抑制子活 的残留情况。95cc的热处理中，胰蛋白酶抑制子的失 活曲线表现为 3个部分 ，如图 1所示 在开始的3min，胰 蛋白酶抑制子活胜下降甚微，说明用95℃热处理，开始 的3rain几乎影响不到胰蛋白酶抑制子的活性。这一现 象在 前的报道中是极少提到的，可能是 由于研究者对 取样的时问间隔划分得不够详细 ，从而掩盖了胰蛋 白酶 抑制子的这段表现。 枣 划 蛙 霜 卜 蓐 量 逮 Ⅲ 踟 鼙 加 热时 间tmin J 图 1 95℃热处理对胰蛋白酶抑制子活性的影响 从加热的第 3min至第 5min，热的失活作用显著加 大，胰蛋 白酶抑制子活胜表现出直线下降，此时胰蛋白 酶抑制子活性的残留率只有 35．4％左右。5rain以后 ，胰 蛋白酶抑制子的失活减缓 ，这一部分的胰蛋 白酶抑制活 性具有较强的耐热性，据认为通常是 Bowman—Birk胰 蛋白酶抑制子 ；而易于受热影响而失活的那一部丹，通 常是 Kunitz胰蛋白酶抑制子。两种耐热性不同的胰蛋 白 酶抑制子，形成了上述的热失活曲线。对于豆奶 中胰蛋 白酶抑制子活性的失活程度，据认为失活率为 ％时的 效果最适宜 ，因为这还涉及到大豆蛋白的提取率 、营养 价值 以及加工过程的能耗等等。从图 1中可以看 出， 95℃热处理时要达到失活9O％的胰蛋 白酶抑制子活性 ， 需要 35mi ra左右 此结果与 Van Buren所报道的结果相 一 致，Van Buren的研究发现，用 93℃热处理豆奶，失活 90％的胰蛋 白酶抑制子活性所需要的时间在 30～75rain 之问，因不同的物料批次而有所差别。 2．3 120℃ 140~C时胰蛋白酶抑制子失活效果 图 2中，用 120℃和 140℃热处理大豆水浸提液 ， 大豆胰蛋 白酶抑制子的热失活显著加快。胰蛋 白酶抑 制子的失活，基本上表现为两部分 ，在热处理的头60s， 胰蛋白酶抑制子活性呈线性下降。120℃热处理 60s，胰 蛋白酶抑制子活性残留率为30 3％；而 140℃热处理 60s，胰蛋白酶抑制子活性残留率为 10 6％。60s后 ，胰 蛋白酶抑制子热失活速度减缓。 些 君 再 露 谨 皿 盛 0 200 40o 60o 加热时 问(s) 图2 越高温热处理对豆奶中的胰蛋白酶抑制子活性的影响 2．4 热致死时间曲线探讨 图 2表 明，失插 90％ 的大豆胰蛋 白酶抑制子活 性，120℃需要 7rain，而 140℃只需要 60s左右。根据这 些结果 ，以 95℃ 、120℃和 140~C三种温度作为横坐标， 热处理时失活 90％胰蛋白酶抑制子 活性所需要的时 间 (对数形式)为纵坐标作图，得到一条胰蛋 白酶抑制 子失活 90％的热致死时问曲线 (TDT曲线 ，Thermal Death Time Cur,re)，见图 3。此图表示了失活 ％胰蛋 白酶抑制活性时温度与热处理时问之间的关系。热致 死时间曲线表明，加热温度增加 30℃，热处理所需要 的时间可缩短 10倍。 3 结语 对豆奶的热处理具有重要的现实意义，它不仅能 有效的钝化大豆胰蛋 白酶抑制子 ，从而改善大豆蛋白 的营养价值，而且可 以解决豆奶灭菌和豆腥味的去除 问题 但加热过程中不能造成对豆奶的不良影响．因为 它影响到大豆蛋 白的营养价值 、抗营养因子与微生物 的杀灭 及产 品的色泽、香气。过度的加热通常会导致 氨基酸与维生素的破坏 ，同时会产生揭变与焦味；而加 ∞ 帅 ∞ 砷 鲫 轴 蚰 如 m 0 ∞ 帅 加 加 ∞ 如∞ ∞ 加 m 0 2001年第三期 ／Cood Sc n and TechnoIo No． ．2∞， 固 3 ： 巨 苗 曩 处理 温度 lcc) 90幢时熬处理温度与时 的关系 热不够，则达不到灭菌和钝化抗营养因子的 目的。所以 加热条件是豆奶加工过程中最重要的参数，温度 的控制是实践中的关键问题。 参考文献： [1 1 Kwok K C，Niranjan K．Effect of thermal processing on soymilk．Interrmtional Journal of Food Science and Technology．1995，30：263～295 【2]Hackler L R，"Van Buren J P，Streinkraus K H，E1 Rawi L． Hand D B．Effect of heat treatment on nu— trifive value of sovmilk protein fed to weanling rats．Joumal of Food Science，1965．30：723～728 【3]Saio K．Tofu． Relationship beween texture and fine structure．Cereal Foods World，1979，24：342～346 [41 Van Buren J P．Streinkraus K H．Hackler L R EI。Rawi L Hand D B E1．Heat effect on soymilk—Indices of protein quality in dried soymilk．Jottrrtal of Agricul— tur al and Food Chemistry．1964，12(6j：524～528 [5]Rackis J J，Smith A K．Nash AM．Robbins D J，Booth A N．Feeding studies on soybeans growth an d pan — creatic hypertrophy in rats fed soybean meal frac— tions．Cereal Chemistry．1963，40：53 1～538 [61 Kwok K C，Qin w H，Tsang J C．Heat Inactivation of trypsin inhibitor in soymilk at ultra—high tempera- tures．Journal ofFood Science，1993．58(4J：859～862 f7]HourffV D，Pouw M．GruppenHRietKV．Inactivation kinetics studv of the Kunitze soybean t~33sin inhibitor and the Bowman —Birk inhibitor．Journal of Agricul- tural and Food Chemi8ti-~．199 8．46：28 1～285 【8]Rouhana A，Jens A N，Cogan U．Hanne F Heat inaeti- vation kinetics of tryps n inhibitors during high tent- perature——short time processing of soymilk Journal of Food Science．1996．61(2)：265～269 [9]橱汝德，梁汉华，郭乾初 ．低频率超声波处理时大 豆胰蛋白酶抑制素的影响．华南理工大学学报， 1998，26(6)：98～102 [10 J Friedman M， Grosjean O K K． Znhrdey J C Inactivation of soya bean trypsin inhibitors by 曲 ols．JotllTlal of Science of Food and A culture， 1982，33：165～172 [11 1 Kato Y Matsuda T GIycation of proteinous in— hibitors： Loss in trypsin inhibitory activity by the blocking of arginine an d lysine residues at their reactive sites Journal of Agricultural and Food Chemistry．1997．45：3826～3831 【l2]Jiao J A．Yes B C．Kobrehel K K，Buchanan B B．Effect of thioredoxin—linked reduction on the acd tv and stability of the Kunitze and Bo~anan— Birk SOVbean inhibitor proteins．Journal of Agricul— tulal and Food Chemistry，1992．40：2333～2336 [13]Steiner R F．The reduetion and reoxidation of disul— fide bonds of soybean trypsin inhibitor．Biochem Biophys Acta．1965．100：l1 l～121 [141 Vaintraub l A，Yattara H B Proteolysis of Kunitze soybean psin inhibitor Influence on its activi— ty Journal of Agricuhuml and F00d Chemistry． 1995．43：862～866 [15】Sathe S K，Lilley G G，~％ever CM．High—resolu— tion sodium dodecyl sulfate polycrylamide gel elec— trophoresis of soybean{Glycine max J seed pro- reins．Cereal Chemistry．1987．64：380～385 [161 Smith C，blegen W V．Twaalthovan L，Hitchcock C．The determination of trypsin inhibitor levels in f0odstuffs．Joumal of Science of Food and A cul— ture．1980．32：341～350 (上接第 3页) 利的食品产业，应给予适当的资金和政策支持。 8．加强和改善政府宏观调控能力，充分发挥行业 协会的作用。 美国等 西方国家行业协务和 中介组织非常发达 ， 其法规体 系很完善 中美签订协议 ，只解决了和美国政 府的关系，我 国的企业要进入还要相应击破各个 “关 卡”以及行业协会的一道行业关卡。 有专家指出：夸后一是加强和改善宏观调控，比如 变政府投资扩大内需为民间投资扩大内需，使市场调节 发挥主要作用；另一个是扎篱芭，加强地方和行为协会 的法律法规建设 ，行业自律保护和各项行业服务工作。 使行业协会在政府与企业之间发挥出应有的作用。 总而言之 ，加入世贸组织时我 国食品工业降低成 本，技术进步，提 高质量，优化结构，丰富市场、扩大出 口、满足国内外市场的消费需求，以厦促进食品工业整 体水平的提高是大有好处的。只要我们将挑战作为机 遏 ．压力变为动力，积极改革，扬优弃劣，不断增强产业 的竞争力和经济实力，一定能够将我 国食品工业的前 进步伐融入全球经济一体化的运行轨道 ，蓬勃发展，奋 发图强，为满足国内外消费者营养方便美味健康益寿 的饮食需求而不断作出新的奉献!为中国经济乃至世 界经济的繁荣和昌盛而贡献力量!