三磷酸腺苷酶的化学模拟

多多 有机化学 YOUJI HUAXUE，1999，19，27—33 综述与进展 摘要 美■词 三磷酸腺苷酶的化学模拟 ． 三 ，． 塞 ,~tnt (复旦大学化学系 上海 200433) 综述了A'I'P酶的化学模拟的研究进展 - mmltsn， 解 ，大环多胺 ～ J 片 AT r酶 三磷酸腺苷(ATP)是从细菌、真菌到植物和包括人在内的动物等所有生命有机体的能量载体， 由于 ATP分子的存在 ，才有了生物体 内的能量转换 ，一切生物才得以生存和延续。ATP分子在中 性溶液中以负四价阴离子形式稳定存在。 但其在三磷酸腺苷酶(ATP酶)的催化下，可水解为ADP和正磷酸(Pi)，同时释放出大量的自由 能，用于推动生命活动。而 ATP又可在 ATP酶的作用下 ，由 ADP和 Pi合成。这个 ATP— ADP循 环，是生物体中能量交换的基本方式[ 。 A_rP ATP碡 ADP + Pi 为了了解这一生命过程的作用机制，人们对 ATP酶的结构与功能进行了大量的研究。在本世 纪50年代， y目首先提出了催化 ADP合成 ATP的ATP酶的作用模型：即电子的传递使酶构象发 生变化，从而驱动 ADP的磷酸化作用 2J。在此基础上 ，Walker和他的合作者进行了深人研究 ，发现 ATP酶是由1O个多肽链组成的复合体，分子量约为50万遭尔顿。当这种复合体处于分离状态时， 便能够水解 ATP；当处于正常位置时，则起相反作用，能够合成 ATP。并且在 1994年通过晶体结构 等方法得到了 A IP酶的结构，了 B er所提出的模型的正确性_3J。两人也因此获得 1997 年诺贝尔化学奖的一半奖金。但是 ATP酶仍有许多问题没有解决，如非催化区域的结构和作用等 问题HJ。获得 1997年诺贝尔化学奖另一半奖金的丹麦生物化学家 Skou则在 A IP酶 的另一领域作 出较大的贡献I4 J。在 1957年，他首先发现了利用 ATP水解为 ADP和 提供的能量进行离子转移 的 № ，K’一ATP酶(一种作为离子泵的 ATP酶)，并对它的结构、机理等进行 了广泛的研究L5J。正 是由于他的开创性工作而使人们发现了上百种的离子泵酶。他们的工作无疑会激励人们对 ATP 酶进行更深入的研究 ，并希望从分子水平上了解酶 的作用机理。而实际上 ，在八十年代初期，为了 1997—07—21收稿，1998—04一l0信回。 l0 o — O ． 一 丫^ P O¨ — O l0． o 一 ．O 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1999壤 从分子水平上了解 ATP酶的作用机理 ，特别是其水解过程的机理 ，人们就开始 了这方面的研究。 并在此基础上 ，出许多有效的酶模型化合物。本文将对 ATP酶催化水解或合成 ATP反应的化 学模拟作一综述 1 化台物[24】am (1】所衰现出的ATIP碡的性质 利用 P啪 t和 I-IPLC等方法 ，人们对许多多胺催化 A1P水解的反应进行 了研究。而其中的大 环多胺化合物，由于具有环效应作用、适当的电荷密度、较好 的亲核性以及可根据要求设计大小不 同的环结构等优点而倍受重视。在这些多胺化合物中，化合物[24]a N602(1)因其对 ATP强的结 合和催化作用并在许多方面都现出 ATP酶的性质而成为研究和设计催化模型的基础。 1 R =H 2 R=Po} 化合物 1首先表现出对 ATP强的结合作用。当 A1P分子加入 1的中性溶液时，滴定分析结果 表明，1与 A1P形成的化合物在 pH 3．5和 pH 7．5的条件下，主要以[1·A1P· ]“和[1·A1P· ]形 式存在。稳定常数分别为 7．0×l07和6．3 X104m0l·L～。这是 由于在水溶液 中，质子化的 1与多价 阴离子的ATP分子通过静电作用或氢键作用而形成了l：l的稳定化合物。而且化合物1对ATP的 结合作用明显大于对 ADP的结合_6 J。为了了解化合物 1与 A1P和 AIDP的结合方式 ，人们通过化合 物 1的盐酸盐以及 ATP、ADP的晶体结构分析和量化计算，知道只有当端基磷酸靠近化合物 1中的 二乙烯三胺的中间胺基时，才使能量得到最大降低L7J。实验结果还证明了化合物 1的结构更利于 结合 ATP分子 。 其次 P NMR动力学研究表明，化台物 1是催化 ATP水解效率最高的大环多胺之一。在适宜 的条件下 ，它可使 A1P的水解速率比在水溶液中提高 100倍L7J。而且在催化反应 中，不仅看到产物 AIDP和 Pi的磷谱信号 ，还在 10 p!mn左右发现 Ⅳ一磷酰化中间体 2的磷谱信号。这就表明 ，该催化 反应是通过共价催化和亲核催化进行的。即 ATP分子的端基磷酸 一 受到化合物 1的亲核胺基的 孤对电子的进攻，形成磷酰胺中间体2，中间体 2迅速水解生成AIDP和 PiLBJ。我们知道，许多ATP 酶的作用机理中都经过一个共价的酶 一磷酰化中间体。而且亲核催化也是酶高效的一个重要 因 素。因此可以说，化合物 1具有模拟 ATP酶的必要条件。 而且 ，化合物 1在以下几个方面也表现出酶促反应 的一些特有现象。如它所表现出的饱和效 应。在 pH 3．6，70℃下，改变 1与 ATP的比例，在 l：l，1．5；l，5：l条件下，ATP水解的一级反应速率 常数 分别为 0．031Ⅱ血～，0．031 rm 和 0．∞5 n一。而当使 1与 ATP比例改变为 l：5时，反 应则由原来的一级反应变为零级反应( ^ =5．8×10 mol L-1 nfin-1)L 。这说明化台物 1被过量 的ATP分子饱和。而当往 1与 ATP的反应体系中增加一些多价负离子如 A加P2一、 O42一等时，又 可看到 1所表现出酶的另一动力学性质一抑制作用。在实验中，随着阴离子的加入，ATP水解速率 明显降低 ，多价阴离子对 1的催化反应表现了较大的抑制作用。而且 1处于饱和状态时所得米氏 常数( ；l×10 mol LI1)与一般 ATP酶对底物的 墨 值非常接近L7 J。 此外，我们知道，金属离子特别是 M 在A1P的酶解反应中起着非常重要的作用。一般认为 在 A1P酶的磷酸化过程中，ATP分子是以与 M 螯合形式进入活性中心并发生相互作用的。而且 认为在酶的催化过程中，金属离子起 了调节控制作用_9 J。所 以，为 了模拟金属离子在 ATP酶的调 节控制作用，Y( Ⅷ 等将一些金属离子加入到化台物 1的催化体系中进行观察‘l⋯。在 pH 7．6， 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 王夫轲等：三磷酸腺苷酶的化学模拟 70℃条件下，c 、I且3 等具有促进作用，Md 基本上没有什么影响，而zn2+、＆P+等则使反应的速 率降低(表 1)。速率变化范围从 ＆P 的O．002 rain一 到 1 的0．093 rain-‘。表明金属离子对化合 物 1的催化体系有明显的调控作用。 表 1 金属离子(M )对[24] ／[ATP]催化体系的影响[1o】 ． 1 ‰ of metal iom(M”)On[24]N~O2／[ATP]system 最近，Lehn等人还利用化合物 1首次进行了ATP酶合成作用的模拟并加以证实 ]。在反应体 系[1，AcP(乙酰磷酸)，Md ，AI)P]中，通过 P NMR等发现了A1[P分子的生成。认为反应机理基本 上是水解反应的逆过程，即由 AcP与化台物 1生成的 Ⅳ一磷酰化中问体 2在金属离子的作用下，使 AI)P磷酸化而形成 A1_P分子。由此可见，化合物 1不仅能催化 A1P水解反应 ，也能催化 A1P生成 反应的进行。这就为模拟 A1[P酶的合成作用奠定了基础 1 + AcP 一 2 ATP 由上可见，酶模型化台物 1在以下几个方面具有与 A1P酶相近的性质 ：(1)反应都在 中性水溶 液进行 ；(2)化舍物 1具有与 ArIP酶非常接近的米 氏常数；(3)通过氢键和静电作用与底物结合；(4) 当加入类似底物时，表现出抑制作用；(5)对底物具有饱和效应；(6)通过亲核催化生成 Ⅳ一磷酰化 中间体 ；(7)中间体可与水或其他底物反应；(8)金属离子对 1的催化作用具有调控作用。这些性质 为利用简单的分子模型模拟 ATP酶和设计酶模型化合物提供 了依据。同时，为了了解各种因素对 ATP水解的影响以及设计更有效的酶模型化合物 ，人们还对化台物 1进行了大量的修饰工作 ，以期 进一步了解各种影响因素的作用并揭示催化反应机理。 2 对酶模型化台物【24】ane 的修饰 ＼{L 一 ；j／／＼一 一 一 3a：Y=(CI-h)n( =2,4，5，9)；4且：Y=(CI-h)3；3b：Y=( )2NH；4b：Y=( )2Nil 、 H N N H 一 一 Y Y 一 一 日 、 ～ 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1999正 Ho~eini等首先对[24]ou~eNoO2的中间氧桥进行修饰，实验表明当将易形成氢键的氧原子用亚 甲基取代后 ，所得化合物 3a(n=5)的催化效率仅有化合物 1的一半。而将氧原子用可与 ATP分子 静电结合的胺基替换后，结合作用加强，催化效率也大大提高。在酸性条件下(pH=3)，化合物3b 的催化速率 比1高出 4倍多 ，而且生成中间体 2的最高含量也相对较高 J。上面结果表 明，化合 物 1与 ATP的结合作用对催化反应具有较大的影响作用 这与化学标记以及诱 导突变等生化方 法探测 ATP酶活性中心的 ATP结合位置所得结果基本一致。生化实验表明，在 ATP酶的活性 中 心，结合 A 分子 的保守氨基 酸主要是一些 可形成氢键和静 电作用 的氨基 酸，如 Lvs、A 、cv8 等l】 。当然，结合作用也不是越强催化效率越高。如 Ⅳ一取代扩环化合物 4b，由于与 ATP分子结 合得过于稳定而几乎没有什么催化作用 S 改变二乙烯三胺基团为二丙烯三胺(4a，41))，发现催化效率明显降低。但如果保留一侧的二 乙 烯三胺基团不改变(化合物 5)，则催化速率降低并不明显_】 。这些结果说明了二 乙烯三胺基团在 催化反应 中起着重要作用 ，是主要的功能基团。T~ ini等通过研究后认为这是由于二乙烯三胺能 形成较适宜的电荷密度，特别是在催化反应中，未被质子化的二乙烯三胺的中间氮原子具有较有利 的亲核位置 ，对 Py进行亲核进攻而使催化反应得以发生。 而如果将化合物 1中的氧用一刚性的呋喃环代替 (化合物 6)，在中性溶液中，化合物 6的结合 能力与催化能力都大大降低l1 。这可能是由于刚性化合物 6不能象化合物 1那样可以扭 曲而与 ATP分子结合 ，而且也使亲核胺基远离 ATP的 Py基团，亲核反应变得困难。 由此不难看出 ATP水 解对环结构也是有一定的要求的。P povⅢ1等对一些催 化 ATP水解效率较高 的化合物的晶体结构 进行研究发现，[21] ，[24] 02等化合物的晶体结构呈船形，相邻氮原子基本在同一椭圆平面 内l1 。考虑到 ATP分子 自身的晶体结构 J，也可看出这些环的结构有利于 ATP分子的嵌合，并对 反应的熵变有利。 、 、 <＼ 、 x Y N／、 ～ Y— ＼ ／ t v 、 — 产、j t、， j 、— ：。X (CHz)、2NH2 Y=一Z，：I。-L． Ba y=-S．S- ’ 7 b X=(CH2)2SH Y=Z=H 。。 。 7 c X=Y={ 2)：NH2 Z=H Bb Y=-NH(CHz)zQ(CH2)2NH。 前面讲过，化学标记和诱导突变实验表明了在 ATP酶的活性 中心主要是一些亲核性氮基酸， - 如L 、A 、Cys等。为了模拟这些氮基酸的功能和作用，Hosseini等在[24]NoO2的侧链引进了 NTI2、 SH等亲核基团。 P NMR实验发现，单取代的此类化合物(7丑，7b)，催化效率 比化合物 1降低 ，但仍 · 在同一数量级上，而且有中间体2的产生。双取代的化合物(7c)以及穴醚化合物(8a，8b)，催化效 率则比化合物 1降低了一个数量级。这再一次证明了二乙烯三胺基对催化反应具有较大的影响作 ． 用。但是它们对 ATP分子的选择性(A J^)P=6．4)却比化合物 1的高 J。 为了增加对 ATP分子中腺苷的识别 ，Hcsseini等又设计 了一新的酶模型化合物 9，即通过一条 软链将核苷酸的嵌合剂吖啶基连接到[24]N6O2分子上，使该分子具有了三个功能部位。即ATP分 0 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 王夫轲等：三磷酸骧苷酶的化学模拟 3l 子多磷链的结合部位和催化水解部位以及识别腺苷的部位一吖啶基。动力学研究表明，9的催化 效率虽然没有化合物 1的高，但在同样条件下 ，它对 ATP分子的选择性(ATP／M)P=8．4)却提高 了 很多【州。 9 通过对化合物 1的修饰工作以及对各种影响因素 的分析，人们对 ATP水解催化反应机理的了 解正逐渐清晰。但并没有仅仅停留在对化合物 1的修饰上 ，还开发了许多其他的多胺催化体系。 3 其他多胺体系对 ATP的作用 Beneini等人曾系统地研究了一系列大环多胺(化合物 10)对 ATP水解的催化作用 分析化合 物 10(n=4—10)与 ATP形成化台物的稳定常数，发现它们只有在三质子化或四质子化后 ，与 ATP 才有相互作用 ，作用的强度随质子化程度的升高而增强。而对同一质子化程度，形成化合物的稳定 性随环增大而增大_l 。而且 Bianehi等也证明，ATP不能与质子化的 1，1，4，4，7，7，10，10一八甲基 一 1，4，7，10一四氮杂环十二烷结合_l 。这说明在配体与 ATP的结合过程中，起重要作用的是静电 作用与氢键。此外环的电荷密度，也影响了相互作用的强度。Bencinl等还发现，[21] (10，n=5) 是迄今为止发现的对ATP的水解催化效率最高的化合物 ，25℃下 ，它 的速率常数最高可达 。bB= O．029 min—l[ r／／ ／ ＼ M． ．^． H f {1 6 ／ 歙 l 莅 巳 ) 1=u~，--，一--A 4n4-10 11 12 13 14 上述体系都仅仅考虑了对多磷链 的结合。为了加强对 ATP分子中腺苷部分的结台和识别作 用，人们也设计了许多新的酶模型化合物。如在大环多胺上连接一苯并冠醚(化合物 l2)，以加强 对腺苷部分的氢键作 用【22 J。或者直接在环中引人苯环结构 ，以加强与腺苷部分的 一堆积作用 (化合物 13，l4) J。实验发现，这些改进都加强了对 A1[P分子的结合与识别作用，但对催化效率并 没有多大的改进。 我们知道 ，在 ATP酶中，ATP分子的腺苷部分主要结合于保守氨基酸所形成的一个疏水域内。 为此 ，我们设计并合成了另一类 ATP酶模型化台物 ，即在起催化作用的大环多胺上连接一个含有 疏水空腔的 8一环糊精(化合物 l5，l6)，以此来加强对腺苷的结合。 P NMR研究表明了 p一环糊精 确实加强了这种结合作用，但由于空问位阻较大，催化效率仍然较低 j。 维普资讯 http://www.cqvip.com 32 有 机 化 学 1999年 二 二二二7 Hy一 15 16 17 18 而为了识别 ATP分子中 Pr，Pmk~h等合成了一类手性大环多胺化合物 l7，l8 实验表明化合 物 l7，l8对 ATP分子的 Py都有特殊的识别作用，而且化合物 18的结合能力要比化合物 17高出35 ’ 倍 。这可能是由于化合物 17在反应的 prl值下仅部分质子化，并且它的空间构型也不利于与 ATP分子的结合。 如 2o vada等还利用衰减全反射红外光谱方法对 大环多胺和链胺 的催化活性进行比较 j。他们 发现，链胺化合物 2o的催化活性要比环胺化合物 l9高出约6倍 ，这说明 ATP的催化水解对化合物 的柔性结构也有一定的要求。此外，s日II】Ⅱ山It aI】o等还对一系列链胺化合物如 乙二胺 、组胺 、三乙烯 四胺 、精胺等的催化活性进行考察 ，发现链胺 的电荷和分子中氮原子 的距离对催 化活性有较大影 响 】。这些研究 ，为揭示 ATP水解的机理提供了丰富而实用的信息。 此外，人们还直接利用金属离子进行 水解的催化 ，所得结论与前面基本一致 J。我们就 不再一一详述。 4 与展望 由于 酶的结构及其催化机理极其复杂，所以对 酶的模拟还不能象模拟某些 了解较清 。 楚的酶那样直接进行酶活性中心结构及其功能的模拟，而只能停留在催化反应的模拟。但 随着诺 贝尔奖的颁发，更会激发人们对 ATP酶的研究兴趣 ，对 A1甲酶的作用机理了解将更加清楚 ，使 _A11) ． 酶的化学模拟可能取得突破性进展。 综上所述，我们还发现在 酶的模拟中，酶模型化合物在加强识别作用的同时，常常会使催 化效率降低；而催化效率较高的模型化合物选择性又较差。我们认为这是由于在增加模型化合物 识别基团时，往往会引进较大位阻作用的缘故。在设计酶模型化合物时 ，适当增加一些柔性结构可 能会减小位阻作用，这将是值得进一步探讨的问题。 而最近 【曲n等人成功地对 酶催化 合成反应的模拟，也为 酶的化学模拟研究提 供了一条新的思路。设计高效专一催化 合成的 酶模型化合物，将具有重大的理论与实际 ’ 意义．也将是一个充满挑战与生机的研究方向 Re“ eⅫ 1 c PII目 S．Ⅳ ，1蛳 ，389：77l 2 B 盯PD 尉DB ．嘶椭 #． ．，棚 ，1140：215 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 王夫轲等 ：三磷酸腺苷酶的化学模拟 12 13 (Et．j lker J E fqat~,'e，1994，370： 1 (b)wa 盯JE．占 ．口 ．^嘲 ，1995，船71：221 Robert F S ＆ ，l蛳 ，278：579 sk帆 J C ．，l990，2韶 (2l：314 H~ eini M W，I．ehn JM，JonesK C ，．Am．dm ．s。c ，1螂 ，111：6330 Merry,M P，NerVesK B． ．~lera．Res．，l990，甜 ：413 H嘲 ni M W，I．ehn JM．， Am ~lera ，l蝴 ，J ：7047 Milb【lm R M，G跏t蛐 一BB8akM，TTib[惦 ，si曰d H．，．Am．C^ s。c．，1％s， D7：3315 Y 咖 嘲 P G，Plute K，Metres M P，Merk K B．1r~rg．a珊 ．，19町 ，2 ：1751 (日)HoB日eini Mw，I．etm J M．，． ．s。c．~lera．＆l删m肝．，l州 ，45l； (b) 蛐试 H，I．etm J M ，．~lera．s。c．~lera． 哪 L，l993，1819 H硝 M W，I．etm J M，Mag 0m L，^l K B，MetresM P．，．Am．G n (日) 盯 JV，Julll B，Maim M L．B／oeh~．丑＆ ． ．1996，128：l； (b)McIr DB，W~lleyDG，B m邮 MC，KhanYM，Lee A G ，．Nol Lu Q，N~rtell A E， k 血 R J．1r~rg．0 ．^嘲 ，1996，251：365 Ph 聃 G，GuK—J，Wi ew池 K J ，．Am．C^吼 ．s。c．．1996． 坩 ：l354 Bi 州 DG，hlesi G Biod~ 西 喧 ．^出 ．，1 ，113：323 Ho5神i M W，BlackerA J，I elm JM．，．Am．a珊 ． ．，l990，112：3896 Benei_1i A，Bi~nehi A ： Ⅻ 出 ( 朗出计 ，1 ，20：8 ． ，l蝴 ，109：537 ~lera．．1996．271：25778 Bi A， ehel~iM，Poole~i P．1r~rg ． ．，1988，151：269 Ⅱk皓 A，B8商ca u试 C，Ber~52,A．J．C m．Soe．PerI~ 口m 2，1994，2367 And嚆 A，Al J'Beneini A．1norg．C ．，l993，32：3418 IzB吐RM，PawlakK，B|an糊 J S．c7蜊 ．品 ．，I孵 ，95：2527 (B)A 】ilar J A，G~,eia—Est~m E，Guerr啪 J A．I|】i自S V，IJj1mr J M，R丑n 巳z J A，s an0 C．1r~rg．( ．A咖 1996． 1：365； (b)B C，Beneiff~A．Bi~ bi A，FmiV，GiorgC．，．Ch~,a．s。c．Per／~ 2，1995，275 24 丑1日r唔D D，sunY J．正aI】gxY．Wang FK．“ 8 ，1996，25 25 nabsIITP．R 彻 姗帅 P．GaneshKW．，．Ckm． ．凡舳 }椰 1，l州 ，1273 26 酗 dB A．h wI】lI-ce G A，hb-ed M．1r~rg． ． ．，1997，254：353 De s曲 m C，Foti c．aan lm A，Git~reO，salm nmIlD S．，．~lera．鼬 ． ．，1996，92：1511 28 (日)G帅 E J．IiuQT． Hua~e，脯 ，13：65(in cl1； ) (b)1．e x Y，wu FH．C ．~lera． ．，I孵 ．6：80l WANG Fu—Ke． SUIGuo—Dong． Ztt~ G Da0一Da0 ( P 臼，I捌 西耕I￡锄 ，凡∞k 南嘶 ，209433 Sfl硼出 ) Abs ．ct This paper reviews the曲zyⅡ1e 耐cs of A肛 (ATP吕yrltllase)by world Ⅻ ds espeeiolly by poly~ monium c0Ⅱq unds． Key A'rPase(ATP syntl~e)，ATP hydrolysis Ⅻ】0IliIⅡn Ir1acr0cyck8，enzyme InilRli~, (Ed．Shl CN) 3 4 5 6 7 8 9 0 l ” 博 ∞ 丝 ∞ 维普资讯 http://www.cqvip.com