紫草萘醌类合化物对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的共价修饰作用

：㈨I }第 2I巷 锖 9龋．668 67 研究论 文· 有 机 化 。 h nt J n J⋯al，f O ,rganit(ih n¨~u、 Vt l 21 X)l 9 ∞8～研 紫草萘醌类化合物对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的共价修饰作用 段志芳 黄志纾 马 林 - ．II大学化学化上学院 f 车镇涛 古练权 州 510275 l _许港科技 学化学糸 香港 九龙 油水湾 香准中文火学中医学院 香港 沙 摘要 为研究蒙革荣醌类化台物的细胞毒 作_q机制，从新蝴软索草根中分离出Pq利 紫单萘醣黉化台物 0， [ 基 烯 醣阿卡宁J1)．己酰阿 卡宁(2 J， 己 氧基异戊胜阿 f- f31和阿 f f4) 研究 厂网种天然紫 禁醌娄化赍物刘乳酸蜕氧旆 和乙醇脱氢酶的共价修饰作用 酶听 测定结粜明，这眄韩紫草萘醒类化☆聊对两种脱氢酶都具仃 、同袒坦的抑制作|Ej； 酶丹 中游离氧 司I琉基修饰帛的测定结 丧叫，紫革萘 炎化舟物埘两种酶的抑 作H{ 要是谴过 酶舒 r巾的筑 甚共 钎结台产十的一 关键词 紫革第醌类化 物，共价修饰作j_}】乳酸脱氧酶 ．，．醇脱氧酶 Covalent M odification of Lactate Dehych-oge~ and Alcohol Dehydrogenase by Alkannin Derivatives I A^ Zhi—rzazg ， ttL~＼'G Zhi—shu ， MA Lin ， CHE Zhen—Tao ’ ． Gu I Jam-Qu~n i F } f{ h卸w5 ．z}lJ】ng } t I：rmx'r~ity．M0275 f t ∞ m Ⅲ ¨ fr ．H ¨ 【fv ,"h．ienc~＆ n ，¨ 榭 ， ) 0 ， Chzne~e w ， k ㈣ f y州 Horn,鼢 Him~" 1 nf f0I1T isolated alkamtin derivatives f 'a]kannin，ace~qalkamfin，8，~-dhnethy respectively)Oil rabbit rauscle latate dehydrogenase(LDHaz,-e)al1d Yeas【 Ak,ohol Dehydmgerm．_~ (M )Hase) been studied．The quinone concentration CUl~,es show flint d two ellz}llles are in— hibited to cfifferent exten~ by the foul"alkalmin derivatKes． ys 0f ~lTtino groups and thiol Iups l the ellz~llles indicate that the cata1)~ic acti~4fies of LDU~se and ADHase are maiidy it~tiblted by covalent l"~llPtiOI[of alk~lfii／i deriva— fives fh fidol groups in enzⅧ】es．These results could be useful for invesfigatirrg the biological mechazfism of alkannin derivatives cyt~toxicity， Key words alkamfin den~,afives，e,ovalent modification LDHase，ADHase 中药紫草具有显著的抗炎、抗癌和抗菌活性 其主要有效成分之 一是紫草萘醌类化合物 日前对 紫草萘醌类化台物细胞毒性和抗癌活性机理的研究 主要有两种假说⋯：(1)通过氧化还原循环产生超 氧负离子漪离基从而引起细胞毒性；f2)与体内某 些生物大分子的亲棱基团发生键合作用从而破坏生 物大分子的生物功能，引起细胞毒性 最近，我们系 统研究 !了紫草萘醌类化合物 与亲枝试剂的反应 f图 1)，发现这类物质可以：(1)与胺类发牛环上的 迈克尔加成反应；(2)在还原剂存在下与胺类发生 侧链上的还原烷基化反应和环上的迈克尔加成反 应：(3)与琉基化合物直接发隹侧链 卜的还原烷基 化反应和环上的迈克尔加成反应，比较而言，与巯基 化合物的反应条件温和，较易发生，并且产率较高。 Receiw：d 2gO0 1 2_26；Revised 2(1111∞ 23：Ac L：eptcd 2001 04一I1 周荥一然科 ’≥长 (29872．061．2fxx娜x 、和I。乐省自然科学基金c980320)资助项月 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 9 萤忐纾并：紫苎禁醚类化台物埘乳酸脱氢酶和乙静脱氧弼的共 修 作Ⅲ 669 L (1 I l( 2 (J 3ft (】 Jit I} 图 1 天然紫草萘醌粪化合物与亲桉试剂的反应 figure1 Reactions of natural alkannin derivatives }h nucleophil~ 许多重要的生物分子含有氮基和琉基，这些基 团对于生物分子的生物功能起着重要的作用。例如 作为生物催化剂的酶．其活性中心常常舍有巯基，氨 基等功能基。这些功能基所发生的各种变化必然会 影响酶的活力．进而对酶促反应和机体代谢产生作 用 许多生物活性小分子都是通过与酶活性中心功 能基共价结合的方式产生作用的。因此，酶的共价 修饰研究是一种重要的方法。它对于测定酶的活性 中心，揭示酶的活性机理以及寻找和有效的药 物具有重要意义。 研究表明乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的活力与一 些氨基酸残基上的羟基，氨基和巯基等功能基直接 相关 。为了进一步探讨紫草萘醒类化合物与生 物分子的相 互作用．本文研究 了从新疆软 紫草 ,kmebia euchmma iRoylo)]olmst根中分离到的四种 紫草萘醌类化合物对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶活力 的影响，并初步测定了它们与这两种酶的琉基和氨 基共价结合的情况。 l l 2 试 剂 兔肌乳酸脱氢酶 EC 1．1．1 27．cr~'slalline sus— pension in 3 2 M (Ⅵ ) SO4]和 Baker s酵母己醇脱 氢酶(EC l 1．1 1．solid)为 m公司产品；层析用 硅胶为 Merck公 司产 品；2．4，6-三硝 基苯磺 酸 ( Bs，5％水溶液)、5．5___ 硫一驭(2-硝基)一苯甲酸 (DTNB J及 DL--~L酸(85％ 117／ )为 Sigma公司产品； 辅酶 NAD (90％)为中科 院 海生化所产品 一： r羟甲基)氨基甲烷('Iris)为北京盏利精细化学品有 限公司产品。其它试剂均为纯 1 2 方法 酶活力用 MILTON )Y 3000 ARRAY紫外光谱 仪测定 1．2．1 紫草蔡醌成分的分离和纯化 将紫草根石油醚提取浓缩物进行柱层析，溶剂 洗脱系统为石油醚(69～90℃卜 己酸乙酯梯度洗 脱 粗组分进一步用快速硅胶柱甚析进行分离纯 化 ，洗脱系统为正 己烷一己酸 乙酯梯度洗脱。最后 单离出四个红色或紫红色物质 1—4．经 FLC和 HPLC分析确定为纯化台物．．经 uv，IR．NMR分析， 确定化台物 1—4都是紫草萘醌类化台物，通过与文 献 比较，确定它们的结构分别为已知的 口．口一 甲 基丙烯酰阿卡宁(1)．乙酰阿卡宁(2)，p，口一乙酰氧基 异J兑酰阿卡宁(3j，和阿卡宁(4j。 】．2．2 紫草萘醌类化合特时乳酸脱氢酶的抑制作 用 参照文献 并相应改进后测定。向装有 0．1 M pH 8 8磷酸盐缓 冲液和不同浓 度的样品 甲醇溶液 l一4的混台液(2 8mI )中．加入 10f止LDHase并在 37℃恒温反应20 min。然后立即加人0 1 nd 30 rⅡM 乳酸溶液和0．1 niL15 nLMNAD 溶液 ．振摇 2min后 测其在 =340IIIil处的 OD值 参比用0．1『11l_0．1 M pH 8．8磷酸盐缓冲液代替 NAI) 溶液．其它加量 相同一测得的数据以样品浓度为横 标．相对酶活 力为纵坐标作图。以未加样品所测得的 OD 值作 为 I(30个活 单位 ．相对酶活力 =OD x 100／OD OD 为不同样品浓度时测定液的光密度。 1 实验 1．1 1．2．3 紫草萘醌类化台物对乙醇脱氢酶的抑制作 1 1．1 新 疆软 紫草 [Arnebi~t eb~hr'oTr．o,(Royle) 用 Jolmst]~ 参照文献 并相应改进后测定。向装有 0．1 1998年5月从广东省药材公司购买。 rr~)l／L pH 8．8磷酸盐缓冲液和不同浓度的样品甲醇 一 一 _ =三 C C ¨ 维普资讯 http://www.cqvip.com 670 溶液 1—4的混台蔽(2．8Ⅱll_)中加人 J0 ccL M)Hase 并在 25℃恒温反应 20rain 然后立即加人 20fd 乙 醇和0 1 mL J5 n1．~l NAD 溶液，振摇2min后测其在 = 340I1l『l处的 01)值 参 比用 0．1 nl 0 J mo1／L 口H 8．8磷酸盐缓冲液代替 NM) 溶液、其它加量相 同。测得的数据以样品浓度为横坐标，相对酶活力 为纵坐标作图。以未加样品所测得的 OD．值作为 100个 活力单位，相对酶活力 =OD ×100／0Dl OD 为不同样品浓度时测定液的光密度。 1．2．4 氨基共价修饰率测定 参照文献 并相应改进后测定。向装有 O．1 mol／L DH 8．8磷酸盐缓冲液和不同浓度的乙酰紫草 素(2)甲醇溶液的混台液中加入 JoO uL酶液、馄匀 并在室温反应 20 min，然后装人透析管在大量水中 透析 8 h、其间换水～次。向透析后的溶液中加入 i ntL 4％ NaHCO ．J mL 0．J％ TNBS，1 mL 0．01 mol／1 a)S ，混匀后在40 ℃下反应2 h。测 定反应 液在 = 420 m1的 OD值。参比用 100 水代替酶液、 其它加量相同。以样品浓度为横坐标，相对修饰率 为纵坐标作图 相列修饰率(伍)=(ODn—OD )× IO0／OD 0nl为不舍样品时的测定液的光密度；OD ． 为不同样品浓度时测定液的光密度一 1．2 5 巯基共价修饰率测定 参照文献 并相应改进后测定。向装有 0．】 nl0 L pH 8．8磷酸盐缓冲液和 同浓度的乙酰紫草 素(2)甲醇溶液的混合液中加入 100 酶液，混匀 并在室温反应 20 min．然后装凡透析管在大量水中 透析8 l，，期间换水 次 向透析后的溶液中加入 2 5 nlJ_州 8．4 Fris HCI缓冲液，：5 n1I 0．0l n~l／1 I)STB溶液，混匀后测定在 ^=412』Ⅱn的 OD值 参 Ek．N 100 水代替酶液。其它加量相同 以样品浓 度为横坐标 ，相对修饰率为纵坐标作图。相对修饰 率f％)=(ODn—OD )×1。【叭J 。0 Dc．为水古样品时 的测定液的光密度：i)j)n为 同样品浓度时测定液 的光密度 2 结果与讨论 2 1 紫草萘醌类化合物对乳酸脱氢酶的抑制作用 在含i nuno】／L乳酸的测活体系中，分别加入不 同浓度的四种紫草萘醌类化合物 。测定它们对乳酸 脱氢酶 (LDHase)括力的影响，结果表明它们均对 乳酸脱氢酶产生抑制作用，并呈现浓度依赖性关系 、 以酶的相刘活力对抑制浓度作图而得到的抑制曲线 如图 2所示 V ．2【．2[xj 2 2 紫草萘醌类化合物对乙醇脱氢酶活力的影响 在含 6．8 mL乙醇的测活体系-丰】、分别加人 不同浓度的四种紫草萘醌类化台物．测定它们对乙 醇脱氢酶(Alcohol I)ehydrogenase，ADH J活力的影响、 结果表明它们均对乳酸脱氢酶产生显著的抑制作 用、并呈现浓度依赖性关系 以酶的相对活力对抑 制浓度作图而得到的抑制曲线如图3所示 图2 化台物 1—4对 LDHase的抑制作用 Figure 2 h~hibition effec|~of1～4(112 LDHase lI10 — ～ ¨ ： ： r-J j 三 J 图3 化台物 1～4对M)ttase的抑制作用 ngure 3 lnhibni 恒 of ～4 0儿AD 2 3 紫草萘醌化合物对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶 中游离氨基和巯基的共价修饰 图4显示了紫草萘醌类化合物2对 LDHase和 M)Hase中游离氨基和巯基共价修饰的情况．． 结果表明紫草萘醌对酶中氨基的共价修饰作用 是相当低的，在乙酰紫草素浓度为45 Imxol／L时，修 饰率分别只有5％(对乳酸脱氢酶，和 10％(对乙醇 脱氢酶)。相反，对巯基的修饰在一定浓度时(约为 26 Nnol／L)可达到 100％，亦即酶中的巯基全部与紫 草萘醌发生共价结合作用 维普资讯 http://www.cqvip.com 第9期 黄蕾 等：紫 誉配英化台物刈乳酸脱氢廊 障脱氧酶的共价修~tifi+川 上的结果说明紫草萘醌对乳酸脱氢酶和乙醇 脱氢酶的抑制作用主要是通过 与酶分子 巾的巯基发 生共价结台来进行的 ． I ： n 专 ¨ i 一0 图4 化台l物 2对 【DHase和 Ha 中氨基和巯基 的共价修饰 ~gm"e 4 Covalent modification of 2 Oil mlnno groups andttfiol groupsinII)Hase andADI~ase 乳酸脱氢酶中的琉基(Cys一165)虽不在活性中 心部位，但它的化学修饰会导致乳酸脱氧酶活力的 降低 。这可能是因为 Cvs一165的巯基与较大的分 子或基团的共价连接后阻碍了酶的底物与酶活性中 心的结合，进而导致酶活力的降低 从图 2和图4 中的结果可以推断经紫草萘醒(1—4)化学修饰的巯 基确实不在酶的活性中心，所以尽管酶分子中的巯 基被完全修饰，其酶活力并不会完全丧失 乙醇脱氢酶中虽有两个琉基位于酶的活性中 心．但 Elf]已与 ，n“配价结合 因此 与紫草萘醌 (1～4j发生共价结台的应该是酶活性中心 外的巯 基 图3和图4中的结果同样证实了这一点，因为 琉基的完全修饰并没有使酶活力完全丧失。因此可 以推测紫草萘醌与乙醇脱氢酶活性中心外的琉基的 共价结合可能引起了酶空间结构的改变或阻碍了酶 与底物的相互结台，从而导致酶活力的降低。 我们对紫草萘醌类化台物与亲核试剂反应的 研究1 J已经表明紫草萘酣口』以 t、，两个甚至= 个位置(C一6，C 7，C—I1)与琉基发牛反应 在琉 基化 台物及反应条件 同的情况 F，其反应惟 与紫草萘 醌 C一6和 c一7的亲电性和侧链上酯基离去的难易直 接相关，由于四个天然紫草萘醒的酯基各不相同+ 因而导致对酶活力 同程度的抑制 紫草萘醌类物质 与亲梭试剂的反f- 产物对酶活 力并未表现出明显的抑制作用，这是因为这些合成 的紫草禁醌化台物的反应位点已被占据，难以再与 酶分子的活性基团发生作用．这允分 兑I埘了紫草萘 醌对乳酸脱氧酶和己醇脱氢酶活力的抑制作用星与 酶舒子中的巯墓发生共价结台的结粜 由此 看出，这 结果很好地验 r我们提 的 紫草萘醌与亲棱试剂反』 的化学横 『 这 一化学 模型也为紫草萘醌娄物质的生物活 机j翠研究提供 了有力的依据．． References l ttuang， ： Zhaz~g， Ⅵ ： Ma， I ； I，ll l {J l'rod ，b ， 2(HM1． ／2． 73 ‘i Jl Chi JI 2 '1【 u ，z S ：Gu，1一 Q Che { 1：Zhaug M ； Oiu，G — “^n f，h H SLf 【{2O00，2,N 104), n Chi IIe 、 3 }{bd岫 1．1] I a，K t ：W ilt+u l1 C j l J + 1919．，77，769 4 H _IlI c kl M ；I％pp． V Bi,M+emLvrl 1983．22，372I 5 JI c⋯g，C —K ：J1 r L，t f)；U J I{ 一l ；hul， J ， ⋯ }|“i㈨ n · i ¨¨ }，㈨ “ !ii ：％ aughai~：ie[It㈨ a 【n nJ]o』 h ：+,hw~tai 1982 ⋯ 1 I 14 6 LⅢ {1．M ； ．]ini，G Em ／ ， l』 r¨ 1975 挪 ，I1 7 H 料 l】．A r S A 』rlf m 川 1966．H ．728 8 l Mle+． r W ： Blakeh v， I{ J ： ㈨I-r， I{_ I "Mm I979． ，75 9 l：l J ---I ：Xiao t C )， 卅 ，、t l‰ ． ，7 4U, l¨ Chi r sc 维普资讯 http://www.cqvip.com