粪便钙卫蛋白检测在大肠慢性器质与非器质性疾病诊断和鉴别诊断中的意义

粪便钙卫蛋白在大肠慢性器质与非器质性疾病诊断和鉴别诊断中的意义 粪便钙卫蛋白检测在大肠慢性器质与非器质性疾病诊 断和鉴别诊断中的意义 北京大学 博士学位 粪便钙卫蛋白检测在大肠慢性器质与非器质性疾病诊断和鉴别 诊断中的意义 姓名:李晓光 学位级别:博士 专业:内科学(消化系病) 指导教师:吕愈敏 20060401 姓名:李晓光 院系:北京大学第三医院 学号:10389751 北京大学医学部学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他 个人 或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人 和集 体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名: 导师签名: 年 月 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解北京大学医学部关于收集、保存、使用学位论文的规定,即: 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本; 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版,并提供目录检索与阅览服务; 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文; 在不以赢利为目的的前提下,学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择图书馆发布时间: ?即时发布 ?一年后发布 ?二年后发布 (保密论文需注明,并在解密后遵守此规定)论文作者签名: 导师签名:年月 日 北京大学博士学位论文 粪便钙卫蛋白检测在大肠慢性器质与非器质性疾病 诊断和鉴别诊断中的意义 中 文 摘 要 北京大学第三医院 消化科 研究生 李晓光 导 师 吕愈敏 教授 副导师 顾 芳 主任医师 目的 评价粪便钙卫蛋白检测作为一种非侵入性检查方法在大肠慢性器质与非器 质性疾病诊断和鉴别诊断中的意义,并与目前临床常用的实验室指标粪便隐 血试 验FOBT、C反应蛋白CRP、血沉ESR、癌胚抗原CEA进行比较。 材料和方法 研究对象 300例,包括 IBS组 60例,大肠癌组 60例,大肠腺瘤组 60例, 大肠慢性炎症组 60例,正常对照组 60例,在结肠镜检查一周内或手术前一周内 留取 5g粪便用于钙卫蛋白测定,采用 ELISA方法检测;同时收集临床资料及医 院实验室 FOBT、ESR、CRP、CEA检测结果。 结果 1.IBS组粪便钙卫蛋白中位数为 12.21mg/kg,正常对照组为 15.36mg/kg,两组 差异无统计学意义P0.05。大肠癌组粪便钙卫蛋白中位数为 159.00mg/kg, 大肠慢性炎症组为 466.00mg/kg,均高于 IBS组和正常对照组P0.01。大肠 腺瘤 1.0cm以上者粪便钙卫蛋白中位数 21.24mg/kg,高于 IBS和正常对照组 P0.05,小于 1.0cm者粪便钙卫蛋白中位数 13.28mg/kg,与 IBS和正常对 照组无差异P0.05。 2.当以粪便钙卫蛋白大于 50mg/kg为界定值时,对于大肠癌和大肠慢性炎症患 者,粪便钙卫蛋白检测敏感性分别为 85.0%,91.7%,显著高于 FOBT、ESR、 CRP及 CEA。将粪便钙卫蛋白分别与其他方法联合检测(并联),敏感性、 特异性等指标下降或无显著变化。 第 1页北京大学博士学位论文 3.对于常见慢性器质性大肠疾病(大肠癌、大肠慢性炎症、1.0cm以上腺瘤), 粪便钙卫蛋白检测敏感性 73.2%,一致率 81.7%,显著高于 FOBT、 ESR、 CRP 及 CEA;特异性 92.5%,显著高于 ESR、CRP,与 FOBT、CEA差异无显著 性。 4.对于鉴别与 IBS症状相似的常见大肠器质性疾病(大肠癌、大肠慢性炎 症), 粪便钙卫蛋白检测的敏感性 88.3%,一致率 90.4%,显著高于 FOBT、ESR、 CRP及 CEA;特异性 92.5%,显著高于 ESR、CRP,与 FOBT、CEA差异无 显著性。 结论 1、在常见大肠慢性器质性疾病(大肠癌、大肠慢性炎症、1.0cm以上大肠腺 瘤) 中,粪便钙卫蛋白水平显著高于 IBS和正常对照;粪便钙卫蛋白检测的敏感 性 73.2%,一致率 81.7%,特异性 92.5%,有望用于大肠慢性器质与非器质性 疾病的鉴别。 2、对于大肠慢性炎症患者,粪便钙卫蛋白检测敏感性优于 FOBT、ESR、CRP。 对于大肠癌患者,粪便钙卫蛋白检测敏感性优于 FOBT、ESR、CRP及 CEA; 如果用粪便钙卫蛋白作为大肠癌序贯筛查的初筛指标,将会优于目前常用的 FOBT。 3、对于鉴别与 IBS症状相似的常见大肠器质性疾病(大肠癌、大肠慢性炎 症), 粪便钙卫蛋白检测的敏感性 88.3%,一致率 90.4%,优于 FOBT、ESR、CRP 及 CEA;特异性 92.5%,优于 ESR、CRP。在 IBS诊断前排除与 IBS症状相 似的常见大肠器质性疾病时,粪便钙卫蛋白作为无创指标,优于 FOBT、 ESR、 CRP、CEA,有望代替目前的有创检查。关键词:粪便钙卫蛋白;大肠器质性疾 病;粪便隐血试验;血沉;C反应蛋白; 癌胚抗原 第 2页北京大学博士学位论文 Evaluation of Fecal Calprotectin in Diagnosis and Differential Diagnosis of Chronic Organic and Non-organic Disease of Large Bowel Department of Gastroenterology, Third Hospital, Peking University Graduate: LI XIAOGUANG Supervisor: Prof. LV YUMIN Second Supervisor: GU FANG ABSTRACT Objective To assess the value of fecal calprotectin as a non-invasive biomarker in the diagnosis and differential diagnosis of chronic organic and non-organic disease of large bowel and to compare its sensitivity and specificity with fecal occult blood, ESR, CRP or CEAMaterials and Methods 300 subjects, including 60 patients with colorectal cancer, 60 patients with colorectal adenoma, 60 patients with intestinal chronic inflammation, 60 patients with irritable bowel syndrome, and 60 healthy controls were enrolled. 5g fecal samples were collected from each subject within one week prior to of endoscopy or surgical operation. Fecal calprotectin was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit in spot stool samples. At the same time, clinical data and the results of fecal occult blood test FOBT, erythrocyte sedimentation ESR, C reactive protein CRP, carcinoembryonic antigen CEA in our hospital lab were collectedResults 1.The medians of fecal calprotectin concentrations were 12.21mg/kg and 15.36mg/kg in IBS and healthy controls respectively. There was no statistical significance of calprotectin concentrations between patients with IBS and healthy controls P0.05The medians of fecal calprotectin concentrations in patients with colorectal cancer and chronic inflammation of large bowel were 159.00mg/kg and 466.00mg/kg respectively, which were significantly higher than those of IBS and healthy controls P0.01. The median of fecal calprotectin concentrations was 21.24mg/kg in patients with colorectal adenomas which were larger than 1.0cm, significantly increased第 3页北京大学博士学位论文 compared with IBS and healthy controls P0.05. However, the median of fecal calprotectin concentrations was 13.28mg/kg in the adenomas which were smaller than 1.0cm, not statistically different to IBS and healthy controls2.When the cut-off limit of fecal calprotectin was set as 50mg/kg, its diagnostic sensitivity of colorectal cancer, chronic inflammation of large bowel was 85.0% and 91.7% respecitively which were significantly superior to FOBT, ESR, CRP and CEAIn the diagnosis of colorectal cancer and chronic inflammation of large bowel, when fecal calprotecin was allpied in combination with other markers such as FOBT, ESR, CRP and CEA separately, its sensitivity and specificity were not improved to fecal calprotectin assay alone3.The diagnostic sensitivity and concordance rate of fecal calprotectin assay in patients with common chronic organic diseases of large bowel colorectal cancer, chronic inflammation of large bowel and colorectal adenomas which were larger than 1.0cm were 73.2% and 81.7% respectively, significantly superior to FOBT, ESR, CRP and CEA. Its diagnostic specificity was 92.5%, significantly superior to ESR and CRP, but not statistically different to FOBT and CEA 4.The diagnostic sensitivity and concordance rate of fecal calprotectin assay in patients with organic diseases of large bowel with similar symptoms to IBS colorectal cancer and intestinal chronic inflammation were 88.3% and 90.4% respectively, significantly superior to FOBT, ESR, CRP and CEA. Its diagnostic specificity was 92.5%, significantly superior to ESR and CRP, but not statistically different to FOBT and CEAConclusions1.The fecal calprotectin concentrations in patients with chronic organic diseases of large bowel colorectal cancer, intestinal chronic inflammation and colorectal adenoma which was larger than 1.0cm were statistically higher than those of IBS and healthy controls. Its diagnostic sensitivity, concordance rate and specificity in patients with chronic organic diseases of large bowel were 73.2%, 81.7% and 92.5% respectively. Fecal calprotectin could be used as a promsing biomarker in the diagnosis and differential diagnosis of chronic organic and non-organic disease of large bowel 第 4页北京大学博士学位论文 2.The diagnostic sensitivity of fecal calprotectin assay was superior to FOBT, ESR, and CRP in patients with intestinal chronic inflammation. The diagnostic sensitivity of fecal calprotectin assay was superior to FOBT, ESR, CRP and CEA in patients with colorectal cancer. If fecal calprotectin was used as a preliminary biomarker of sequential screening test, it would be superior to FOBT 3. The diagnostic sensitivity and consistency rate of fecal calprotectin assay in differentialing patients with organic diseases of large bowel whose symptoms were similar to IBS colorectal cancer and intestinal chronic inflammation were 88.3% and 90.4% respectively, superior to FOBT, ESR, CRP and CEA. Its diagnostic specificity was 92.5%, superior to ESR and CRP. For the diagnosis of IBS, Fecal calprotectin, as a non-invasive biomarker, was superior to FOBT, ESR, CRP and CEA, to exclude organic diseases of large bowel with similar symptoms to IBS and might have the petantial to replace invasive proceduceres availableKey Words: fecal calprotectin; intestinal organic disease; fecal occult blood test; erythrocyte sedimentation; C reactive protein; carcinoembryonic antigen第 5页北京大学博士学位论文 文献综述 粪便钙卫蛋白检测在胃肠道疾病中的应用 一 钙卫蛋白介绍 1 引言 [1,2] 钙卫蛋白(Calprotectin)是36kD的钙、锌结合蛋白,包含2条重链和1条轻链 。 [1] 它属于S-100蛋白家族,主要来源于中性粒细胞和单核细胞 。它分布于人体的粒细 [3,4] 胞、单核细胞、上皮细胞、角化细胞和各种组织及体液中,是保护性蛋白 。 钙卫蛋白与许多疾病相关,特别是炎症性疾病、某些细菌性感染和肿瘤性疾病 [5,6] 。在囊性纤维化、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和细菌感染中,钙 [7-11] 卫蛋白水平升高最明显 。 虽然目前已经有大量炎症反应的标志物,但仍然有许多学者热衷于研究钙卫蛋 [1,12] 白。这是因为钙卫蛋白是具有多种潜能的生物活性分子 。钙卫蛋白具有复 杂的 [13,14] [12,15] [16,17] [3,4] 、免疫调节功能 、抗肿瘤活性 及防御功能 ,是 细胞间信号传道作用 炎症反应中重要的调节蛋白。 2 命名 表1 钙卫蛋白的命名 命名 出处 [1,2] Fagerhol钙卫蛋白(L1蛋白) (2条重链+1条轻链) [18] [12] MRP8/14(MIF相关蛋白) Odink ,Sorg[19,20] [21] 囊性纤维化相关抗原(CFA) Wilson , Dorin[22,23] (钙卫蛋白和MRP-8的同一性) (Anderson ) [24] Wilkinson 钙粒蛋白A/B [21,25] [13] Dorin Freemont S-100 a/b(钙结合蛋白) 第 6页北京大学博士学位论文 钙卫蛋白的发现过程很复杂,许多研究者曾分别对其命名,如L1蛋白, MRP-8/14,钙粒蛋白,囊性纤维化抗原等(见表1)。 [1] Fagcrhol等 在1980年首先从中性粒细胞分离出钙卫蛋白,当时命名为L1蛋白; [26] [12] 发现其与钙离子结合,有抗微生物活性后才将其命名为钙卫蛋白 。Sorg等 在研 究巨嗜细胞和慢性炎症的机制时,描述了移行抑制因子(migration inhibitory factor, MIF)相关蛋白(migration inhibitory factor related protectin,MRP)即MRP-8,MRP-14; [18] [19] 1987年,Odink等 采用了杂和体MRP-8/14。1973年Wilson等 采用了囊性纤维化 [24] 相关抗原(cystic fibrosis related antigen,CFA);1988年,Wilkinson等 进一步描述其 特点,并命名为钙粒蛋白(calgranulin)。1988年,通过氨基酸和cDNA测序及免疫 [22,23] 组化染色,确定L1蛋白、囊性纤维化相关抗原、MRP-8和MRP-14的同一性 。 [21,25] [13] Dorin等 和Freemont等 进一步描述了这些蛋白的S-100结构。 因为这一蛋白是具有保护特性的钙离子结合蛋白,所以最后将其命名为钙卫蛋 [2] 白 。 3 结构和理化特性 钙卫蛋白是由2条重链、1条轻链非共价结合的36kD钙锌结合蛋白异二聚体 [1,2,27] ,每条链可结合两个钙离子。当它在含EDTA电泳液中电泳时,以阴离子形式 像α球蛋白一样迁移,当它在含钙的缓冲液中电泳,以弱碱形式并像γ球蛋白一样 2 迁移,只有在热的十二烷基璜酸钠和8mol/L尿素作用下才能在凝胶电泳时解离为重 [28] 链和轻链 。已经确定其符合S-100蛋白结构,是2个亚单位S-100A8和S-100A9的复 [29] 合物,2个亚单位的功能有差异 。一般生物样本中不存在游离的亚单位,只有蛋 白经加热后亚单位间的共价键才能打开。目前已经研制了许多钙卫蛋白的单克隆抗 [2,27] 体。钙卫蛋白具有显著耐热和耐蛋白水解 的特性。其基因来源于人类1号染色体 [25,30] q12-q21 。钙卫蛋白的理化特性,见表2。表2 钙卫蛋白的理化特性第 7页北京大学博士学位论文 分子量 36kD 免疫原性 2条重链 14kD 单克隆抗体定义的抗原决定族 1条轻链 8kD Mac387 27E10 每条链结合2个钙离子S 36.48 结合锌离子S 32.2, 8-5 C2 亚单位间紧密结合CF145, CF557 钙依赖的方式形成共价复合物(2、3、4聚体)F11,F3,A1 S-100蛋白结构和特定序列 定位于人类1号染色体(鼠3号染色体) 耐热性 当钙存在时,有抗蛋白水解作用 4 分布 钙卫蛋白存在于全身的细胞、组织和体液(如血浆、尿液、粪便、脑脊液、唾 液、滑囊液、脓胸悬浮物等)(见表3)。主要存在于粒细胞和单核细胞。 中性粒细胞来源于骨髓,分化成熟后进入外周血循环,主要分布在毛细血管丰 富的脏器肺、肝、脾、消化道等。正常情况下,以随机方式离开血管进入组织, 在组织中生存 1?2天,一旦穿过血管壁进入组织就不再返回血液,并在组织内死亡。 但是,在炎症反应时,中性粒细胞进入组织是一个主动积极的过程,它在趋化因子 的作用下,通过消耗能量,呈阿米巴样变形运动,钻出血管壁,达到炎症区域,发 挥生物学功能。 循环中的单核细胞是单核细胞发育的中间阶段,进入组织后最终发育为巨噬细 胞,主要发挥抗原呈递和免疫调节作用。在炎症反应时,可有新的单核细胞受趋化 因子的作用,主动离开毛细血管动员进入组织,分化成熟为巨噬细胞,这部分巨噬 细胞作为炎症的效应细胞发挥作用,可以释放各种炎症因子,同时发挥吞噬作用。 [1] 在中性粒细胞中,钙卫蛋白主要存在于溶菌酶外的细胞质中,浓度5-15mg/ml , 大约占中性粒细胞蛋白总量的5%。免疫电子显微镜显示,粒细胞和单核细胞的电子 密集部位分布少量钙卫蛋白,但表达量有时间变化。钙卫蛋白在粒细胞和单核细胞 [31] 的细胞膜的表达也是易变的 。 [32] 钙卫蛋白及其单体在不同的分化阶段存在的形式不同 (图示1),循环中的中 第 8页北京大学博士学位论文 性粒细胞和单核细胞胞浆内表达MRP8和MRP14单体,当循环的单核细胞向巨噬细 胞随机转化的过程中,MRP8和MRP14表达量呈下调趋势,最终定居的组织巨噬细 胞则不表达。在早期炎症浸润阶段,受刺激活化的中性粒细胞和单核细胞的胞膜和 胞浆内出现MRP8和MRP14的杂聚体MRP8/14,即钙卫蛋白,细胞内两种单体含量 [31] 减少 。体外实验证实了这种表达的变化,当受到刺激后,胞浆内Ca离子浓度增加, MRP8和MRP14形成依赖于钙的异二聚体(钙卫蛋白),向细胞骨架和细胞膜转 移。 [18] 钙卫蛋白及其单体MRP8、MRP14在细胞中的不同表达依赖于炎症状况的不同 。图示 1:MRP8和 MRP14在不同分化阶段表达量和方式不同 循环中性粒细胞和单核细胞??胞浆内?MRP8和 MRP14单体 转化的过程 MRP8和 MRP14表达量下降 定居的组织巨噬细胞, MRP8和 MRP14完全不表达。 活化的中性粒细胞和巨噬细胞??膜和浆?MRP8和 MRP14异二聚体钙卫蛋白 此外,钙卫蛋白还存在于角化细胞。在某些应激状态,树突细胞可诱导钙卫蛋 [1] [33] 白的表达 。在正常状态下,多种粘膜的鳞状上皮细胞的细胞质可表达钙卫蛋白 。 [34] [35] Merten和Figarella 报道气管腺细胞可分泌钙卫蛋白,Fanjul等报道 MRP-8和 MRP-14存在于胰腺腺细胞。在大鼠、小鼠、兔、绵羊、牛、猪身上也可发现钙卫蛋 [28] 白 。因此,钙卫蛋白是大量、到处存在的分子。 [28] 表3 钙卫蛋白在细胞和组织中的分布 细胞 体液中性粒细胞 血清/血浆单核细胞/巨嗜细胞 脑脊液上皮细胞 唾液角化细胞 尿胰腺细胞 粪便气管腺细胞 滑膜液 组织 脓液(上清液)皮肤(上皮/真皮) 其他物种肺 小鼠胃 大鼠肠道 猪口腔粘膜 绵羊 子宫颈粘膜 兔 第 9页北京大学博士学位论文 5 生物学功能 [14] 钙卫蛋白的S-100的蛋白结构和钙离子相关的细胞骨架 说明其具有细胞间信 [36] [37] 号传导作用 。当人类中性粒细胞激活时,磷酸化的钙卫蛋白移位到细胞膜上 , 作为酶的竞争性抑制的底物,可抑制对细胞增殖起重要作用的酶(酪蛋白激酶?和 [38] 拓扑异构酶) 。钙卫蛋白具有抗微生物活性,在中性粒细胞防御机制中起重要作 [39-42] [8] [43] 用 。钙卫蛋白是炎症反应的调节蛋白 ,可刺激免疫球蛋白的生成 、趋化因 [44] [13] [45] 子的活化 及中性粒细胞固定因子的活化 。 Brun等 报道注射钙卫蛋白到类风湿 性关节炎的大鼠模型上可产生保护作用,也证实钙卫蛋白在炎症反应中有调节作用。 [46] [16,17] 钙卫蛋白还是粒单核细胞分化的标志物 ,具有类似细胞因子的作用 。 [47] [48,49] [50] Hahn 、Clohessy 及Sohnle等 都证实钙卫蛋白的抗微生物活性部分是由 于与锌结合的结果。已有研究证实钙卫蛋白的抗真菌作用是通过鳌合锌离子来抑制 [43] 金属蛋白酶活性,从而抑制真菌活性 。 总之,钙卫蛋白是一个具有多种潜能的生物学活性大分子,在髓样细胞新陈代 谢中起重要作用。对具体细胞而言,钙卫蛋白有免疫调节和抗菌作用。近几年的研 究发现在人和动物的正常和活化的细胞中,钙卫蛋白还具有抗增生和诱导细胞调亡 的作用。 钙卫蛋白在体内、体外具有多种生物学功能,见表4。 [28] 表4 钙卫蛋白的生物学功能 细胞间信号传导功能(S-100功能) 中性粒细胞制动因子 钙依赖性相关的细胞骨架结构 炎症反应的调节蛋白 抗微生物活性 粒单核细胞分化标志物 抗白色念珠菌活性 细胞毒效应 中性粒细胞防御机制 大鼠腹膜细胞的细胞毒因子 刺激免疫球蛋白生成 诱导调亡 趋化因子 保护作用,可抗类风湿性关节炎(大鼠模型) 第 10页北京大学博士学位论文 二 钙卫蛋白临床意义 钙卫蛋白是中性粒细胞代谢的标志物,以往的研究显示囊性纤维化、类风湿性 关节炎、克隆病、溃疡性结肠炎和细菌性感染等疾病钙卫蛋白水平升高。钙卫蛋白 与多种疾病相关(见表5)。目前临床上钙卫蛋白的测定主要适用于某几类疾病,包 括感染和炎症性疾病、某些类型的肿瘤性疾病。根据疾病不同可以相应采集组织、 血液、体液等进行钙卫蛋白检测。 [28] 表5 钙卫蛋白与相关疾病类风湿性关节炎 泌尿系结石 Sjogren综合征 口腔粘膜炎症 眼内炎症性疾病 中枢神经系统炎症(多发性硬化、急性脑炎) 系统性红斑狼疮 HIV感染者周围神经系统感染 囊性纤维化 HIV感染者 急性和慢性肺部疾病 血液疾病者 肺癌(鳞状细胞) 感染性和非感染性发热 软组织肿瘤标志物(非特异性) 急性心肌梗死 大肠癌 献血者(血浆参考水平) 克罗恩病 外科手术 溃疡性结肠炎 血浆分离置换 胃肠道粘膜炎症 1 血浆、组织及体液钙卫蛋白 [28,51] 血浆钙卫蛋白水平在许多感染和器质性疾病中升高 。由于粒单核细胞参与 炎症过程,钙卫蛋白存在于粒单核细胞中,因此血浆中钙卫蛋白浓度的变化可反映 体内粒单核细胞的变化及炎症的情况。 钙卫蛋白有助于区分微小病毒感染和细菌感 染,有研究发现健康者的血浆钙卫蛋白水平为0.1?0.6 mg/L,病毒感染者为0.1?1.4 [28] mg/L,细菌感染者为0.6?11.0 mg/L 。但是,由于各种炎症反应均可导致血浆内钙 卫蛋白含量变化,钙卫蛋白在多种感染和器质性疾病时均升高,使得器官特异性降 第 11页北京大学博士学位论文 低。 [52] Kristinsson等 发现在大肠癌患者中,血浆钙卫蛋白浓度在T1或T2期肿瘤显著 低于T3、T4期肿瘤。大肠癌的分期是判断预后最重要的的因素之一,目前临床常用 [53,54] 的肿瘤标志物(CEA和CA19-9)与大肠癌分期的相关性报道结论不一致 。血浆 钙卫蛋白是否可用于大肠癌分期的诊断,尚需进一步研究。 目前习惯于用肝合成功能(如白蛋白、凝血酶原时间等)作为研究酒精性肝病 [55] 预后的指标;而Homann等 证实,血浆钙卫蛋白也可作为一项酒精性肝硬化判断 预后的指标,钙卫蛋白浓度增加与低生存期相关。 检测组织中的钙卫蛋白,可通过组织标本的免疫荧光或免疫组化方法,用多克 [31] 隆(兔)或单克隆抗体检测产生钙卫蛋白的粒细胞、单核细胞和鳞状上皮细胞 。 对于炎症性肠病者,检测肠道组织的钙卫蛋白可用于疾病的诊断和随访。 [56] 北医三院消化科 进行了钙卫蛋白在溃疡性结肠炎患者结肠粘膜表达的研究, 结果显示,活动期UC的结肠黏膜中有钙卫蛋白表达,表达强度与组织学严重程度显 著相关r0.89,P0.0001;缓解期结肠黏膜无或仅有微弱的表达,缓解期与活动期相 比差异有统计学意义P0.01。说明UC结肠黏膜中的钙卫蛋白可以反映炎症的组织 学严重程度。 体液中的钙卫蛋白也与多种疾病相关。中枢神经系统急性化脓性感染时脑脊液 [10] 中钙卫蛋白的含量急剧升高 。口腔分泌液钙卫蛋白浓度的改变对牙龈炎和口腔真 [57] 菌感染具有诊断价值 。尿道及肾脏的炎症时可造成尿液中钙卫蛋白浓度的变化 [58] 。恶性腹水和自发性腹膜炎的腹水中钙卫蛋白水平显著升高,肝硬化患者高钙卫 [59] 蛋白水平的腹水,提示预后不良,死亡率高 。对IBD患者的研究发现,肠道灌洗 液钙卫蛋白浓度与肠道渗透性有显著相关性(r0.79,P0.0001),可以比较准 确地 [60] 反映肠道的炎症状况 ,但是一般只能在进行肠镜前收集灌洗液,不方便,而且对 于不必要或不能进行肠道灌洗的患者无法进行。 最近更多关注的是粪便钙卫蛋白在胃肠病学方面的研究。尤其是粪便钙卫蛋白 在器质性疾病中含量升高,用于胃肠道疾病检测,敏感性高,可以对许多器质性疾 病的诊断和预后提供依据。第 12页北京大学博士学位论文 2 粪便钙卫蛋白 2.1粪便钙卫蛋白检测方法评价 [11] 1992年, Roseth、 Fagerhol等 首先报道钙卫蛋白可以从粪便中提取并定量测定。 粪便钙卫蛋白检测过程首先是从粪便中萃取出钙卫蛋白,然后将提取出的钙卫蛋白 用ELISA方法、兔IgG抗体检测。 [61] 2000年,Ton等 改进了钙卫蛋白的萃取方法,主要差别在于萃取缓冲液的成 分,旧方法用含氯化钙和硫柳贡的Tris-等张盐水缓冲液,新方法用含牛血清白蛋白 的尿素/柠檬酸盐缓冲液;旧方法粪便需要量大5g,新方法仅需要微量粪便0.1g; 新方法萃取每份样本还需要5ml萃取液和一个密封试管,操作更方便,并减少了污 染的风险。新方法的数据与旧方法的数据可以转换,当新方法所得结果400ug/g时, 近似认为新方法y, ug/g与旧方法x, mg/L的关系为y=5x,根据线形回归分析,得 1.07 出两者关系为y3.56x 。粪便钙卫蛋白萃取流程 1. 空白管称重; 2. 取样 约 50-100mg; 3. 再称重,计算样本净重; 4. 加入相应量的萃取液,重量 mg/容积 ul=1:50; 5. 拧紧管口,用 Votex 混匀 30秒,震荡器振摇 30分钟; 6. 取出 1ml匀浆; 7. 10000g离心 25分钟,取上清 0.5ml.备用。 ELISA操作流程 1. 将提取的钙卫蛋白恢复室温; 2. 1:50稀释样本并混匀; 3. 加样,每孔100ul,包括标准品、阴性和阳性对照,待测样品,建议双 份加样; 4. 室温孵育 45分钟; 5. 冲洗缓冲液洗3次,滤纸吸干; 6. 加酶标抗体 100ul/孔; 7. 室温孵育 45分钟; 8. 冲洗缓冲液洗3次,滤纸吸干; 8. 加100ul底物反应30分钟,蔽光; 9. 设置酶标仪,405nm读取。 第 13页北京大学博士学位论文 [11] 对粪便标本的测定干扰因素较多,因此有必要进行方法学评价。Roseth等 证 实其检测方法稳定,组间差异14.8%,组内差异1.9%。粪便标本分别常温保存7天和 -20?保存数月进行测定,两种保存方法均对钙卫蛋白含量无显著影响,钙卫蛋白比 其他的粪便指标都更稳定。 [62] Johne等 对453例大肠癌患者或大肠癌高危人群进行结肠镜检查,并同时采用 新旧两种方法检测粪便钙卫蛋白水平,提示新方法优于旧方法。另外,对于留取1 次粪便采集1点标本和留取2次粪便采集2点标本进行比较,结果粪便钙卫蛋白水平无 明显差异,说明采集1次粪便1点标本即可满足检测的需要。 [63] Husebye等 进行了粪便钙卫蛋白生物多样性研究,选择14例志愿者,在肠镜检 查前各收集8次粪便标本检测钙卫蛋白,设cut-off值为50mg/kg,结果在无肿瘤和炎 症者中,有5人(36%)的粪便钙卫蛋白水平很低且保持稳定,9人(64%)的钙卫 蛋白水平有波动,说明每天人体的粪便钙卫蛋白水平有一定变异。 [64] Summerton等 检测了17例患者在肠镜检查之前和1周之后留取的粪便标本,发 现钙卫蛋白水平无明显差异,但研究者仍认为最好在肠镜检查前留取粪便标本。另 外,有报道认为粪便钙卫蛋白水平与年龄有关,儿童粪便钙卫蛋白水平参考范围低 [65] [66] 于成人 ,成人钙卫蛋白水平随年龄增加 。 粪便钙卫蛋白检测有许多优点,钙卫蛋白由于含钙离子,不易被蛋白酶水解; 粪便标本可以邮寄,减少了研究对象来医院送标本的不便;标本可在室温储存1周, 适合于批量检测;收集单次粪便标本与收集24小时粪便混匀后取样,检测结果同样 可靠。总之,粪便钙卫蛋白检测稳定性高、简单、方便、准确,使得各国学者 积极 探索是否可以将粪便钙卫蛋白作为多种胃肠道疾病的标志物。 2.2粪便钙卫蛋白在大肠癌中的应用 1)粪便钙卫蛋白在大肠癌中的表达 大肠癌是世界高发恶性肿瘤之一,在经济发达国家,发病率高达35/10万~50/10 [67] 万 ,我国发病率亦迅速上升。结肠镜及病理检查是最可靠的确诊方法,但是由于 侵入性和有创性,使其应用受到限制。粪便钙卫蛋白因其无创性、简便性,有望成 第 14页北京大学博士学位论文 为新的大肠癌筛查指标。 目前已有一系列的研究证实,胃肠道癌症患者粪便钙卫蛋白水平与其他疾病患 [11] 者和健康对照组比较显著升高 。(见表6)。 表6 大肠癌患者粪便钙卫蛋白水平 出处 病例数 No. 钙卫蛋白mg/L 中位数 Median 全距 Range [19] 11 40 6?80 Roseth et al (1992) [17] 53 50 4?300 Roseth et al (1993) [97] 14 33 4?382 Gilbert et al (1996) [118] 119 50 2?950 Kristinsson et al (1998) [119] (2000) 11 214 49?410 Campbell et al [120] 154 48 Kristinsson et al (2001) 4-1785 [6] Roseth等 研究证实,大多数胃肠道癌症患者粪便钙卫蛋白水平升高; 他们发 现大肠癌(50/53,94.3%),胃癌(18/18)粪便钙卫蛋白升高,40例结肠息肉患 者 中32例(80%)粪便钙卫蛋白升高;90%的大肠癌患者术后粪便钙卫蛋白水平 降到 正常。 [52] Kristinsson等 发现,大肠癌患者粪便钙卫蛋白水平显著高于对照组,而且手 [68] 术切除肿瘤后粪便钙卫蛋白水平降至正常。Kristinsson等 进一步研究发现,大肠 癌患者中87%粪便钙卫蛋白水平升高,粪便钙卫蛋白水平与肿瘤分期无关,与肿瘤 大小、所在部位、病理类型无关。这一点引起了研究者的兴趣,因为肿瘤分期诊断 决定大肠癌的预后,与肿瘤分期无关,说明有可能用粪便钙卫蛋白进行肿瘤的早期 检测。 2)粪便钙卫蛋白检测与 FOBT等方法比较 大肠癌的早期症状较少,肠道出血(粪便隐血、黑便、鲜血便)为最常见和最 重要的表现。在大肠癌高发地区,普查可以提高早期诊断率,目前最常用的筛查方 法是粪便隐血试验fecal occult blood test,FOBT。尽管大肠癌可表现为间断性出血 第 15页北京大学博士学位论文 从而影响FOBT试验的敏感性,FOBT仍是常用的大肠癌筛查试验。 [69] 目前已有多项关于粪便钙卫蛋白与FOBT比较的研究。 Gilbert等 检测14例已知 的大肠癌患者,结果71%患者的钙卫蛋白升高,而FOBT的阳性率仅为57%。另一项 直接比较FOBT和钙卫蛋白检测大肠癌和腺瘤的试验证实,钙卫蛋白敏感性更高 [70] [71] (79% vs. 43%),但特异性相对较低(72% vs. 92%) 。Kristinsson等 也得出类 似的结果,他们对237例大肠癌一级亲属进行粪便钙卫蛋白、FOBT和结肠镜筛查, 发现息肉118例(50%)、腺瘤73例(31%)、无症状大肠癌5例。粪便钙卫蛋白对 腺瘤的敏感性56.2%、特异性47.4%(cut off值10mg/L),4例(4/5)大肠癌患者钙 卫蛋白升高(15mg/L)。FOBT对腺瘤的敏感性8%,特异性95%,1例(1/5)大肠 癌患者FOBT阳性。因此在大肠肿瘤的筛查中,粪便钙卫蛋白比FOBT更敏感。 另有学者进行了大肠癌患者血红蛋白与粪便钙卫蛋白的比较,发现两者无相关 性,粪便钙卫蛋白的组内和组间差异比血红蛋白小(分别为9% vs. 39% 和22% vs80%)。这说明钙卫蛋白进入胃肠道的机制与出血不同,粪便钙卫蛋白比血 红蛋白 [69] 更稳定 。 粪便钙卫蛋白与导致大肠癌的生活方式危险因素关系的研究显示,粪便钙卫蛋 白与以下因素正相关,年龄增长P0.002、肥胖P0.04、缺乏活动P0.01;同时 [72] 与纤维摄入P0.02和蔬菜摄入P0.04负相关 。 3)粪便钙卫蛋白筛查试验 [71] 2000年,Kristinsson等 对大肠肿瘤高危人群的多中心研究显示,粪便钙卫蛋 白对大肠肿瘤有较高的敏感性(对大肠癌74%,腺瘤43%),但特异性低(64%为非 癌者,67%为非肿瘤者)。 [73] 2003年,Limburg等 进行了一项关于粪便钙卫蛋白作为大肠肿瘤(包括良性 和恶性肿瘤)筛查指标的前瞻性研究,入选对象是接受肠镜检查的有大肠肿瘤病史、 大肠癌家族史或缺铁性贫血者,并排除已经确诊的大肠癌患者。最后入选412例,包 括大肠良恶性肿瘤患者97例(94例腺瘤、3例腺癌),非肿瘤者315例(炎症 12例、 非腺瘤性息肉47例、结构/血管病变108例、肠镜无异常148例)。计算结果显示,粪 第 16页北京大学博士学位论文 便钙卫蛋白对于大肠良恶性肿瘤(包括腺瘤和腺癌)的敏感性37%、特异性63%、 阳性预测值23%、阴性预测值76%。 [74] 2004年,挪威报道了一项大肠癌筛查研究 (the Norwegian Colorectal Cancer Prevention NORCCAP trial),用FOBT和乙状结肠镜作为筛查方法,筛查出大肠癌 16例、高危腺瘤者195例、低危腺瘤者592例、无腺瘤者1518例。研究者还同期收集 了粪便标本进行钙卫蛋白检测,发现10例(10/16,63%)大肠癌者钙卫蛋白水平升 高。比较粪便钙卫蛋白和FOBT,人群总阳性率分别为25%及12%,对进展期肿瘤的 敏感性分别为27%和35%,对肿瘤的特异性分别为76%和90%。 作为筛查试验,需要较高的敏感性、适当的特异性,对于目标人群而言方便、 易于接受、廉价,对于筛查出的目标人群有较好的诊治,粪便钙卫蛋白还不能 完全达到这些标准。粪便钙卫蛋白检测的优势在于无创、方便、很容易萃取和进行 后续的分析检验。由于粪便钙卫蛋白在大肠癌和IBD患者中均升高,在大肠腺瘤中 升高不明显,因此对大肠癌/大肠肿瘤(包括癌和腺瘤)诊断的特异性相对低,使其 用于大肠癌/大肠肿瘤的诊断和筛查受到一定限制。目前已有大量回顾性研究,研究 对象集中于那些已经确诊者。由于没有典型的筛查人群,入选各项试验的研究对象 不同(如已知大肠癌者、已知腺瘤或大肠癌者、大肠肿瘤的高危人群等),研究对 象的差异使研究结果之间可比性降低。 除了粪便钙卫蛋白检测,近年来,许多学者积极探索研究了其他简便、无创的 [75] [76] 粪便检查方法,如粪便脱落细胞 、癌胚抗原carcinoembryonic antigen, CEA 、 [77] [78] [79] 促衰变因子decay-accelerating factor, DAF 、乳铁蛋白lactoferrin, LF 、DNA突变 及一些基因标志物等。目前,还没有足够的研究证实粪便钙卫蛋白可以作为单独的 大肠癌筛查指标。进一步的研究方向包括,增加对于粪便钙卫蛋白作为大肠癌/大肠 肿瘤的筛查指标的前瞻性研究,对无症状的一般人群进行研究,联合其他筛查试验 以提高敏感性、特异性至可接受的范围。第 17页北京大学博士学位论文 2.3粪便钙卫蛋白在 IBD中的应用 1)粪便钙卫蛋白在