pgex-4t-1-usp原核表达载体构建

pgex-4t-1-usp原核达载体构建 1. 引物和订购 Forward: EcoR I—GTCGAATTC ATG TGC GGC CGG TCT AAG Reverse: Xho I—CAACTCGAG TCA AGC CCC CTG CTC GTT 2. 原核载体的构建 片段的克隆: 载体 0.5 2XP pfu buffer 25 Dntps(2.5mM) 8 Primer-f 1 Primer-R 1 KOD E 1 dd water 13.5 Total 50 ul 酶切: dd water 24 10X buffer 4 DNA 10 EcoR I 1 Xho I 1 Total 40 ul dd water 32.5 10X buffer 4 DNA 2 ug EcoR I 1 Xho I 1 Total 40 ul 37?，2 h。做两个单酶切位点，加上一个未酶切的载体做对照，一起跑胶。 回收。 连接: Vector DNA 2 Insert DNA 6 10X buffer 1.5 T4 DNA ligase 1 Water 4.5 Total 15 For 22?,2 h 取7.5 ul转化涂板。同时取空载和感受态涂板做对照。 小提鉴定。测序。 感受态细菌30-50ul { 质粒 7.5ul ?冰上20分钟-?热激:42?、90秒-?冰上2分钟 ?图板(相应抗性的LB固体平板) ?12-16h后收板，挑单克隆，小提摇菌。 图为:取500 ul菌液，离心加入1Xcracking buffer，13000rpm，离心15min，然后取15ul上样检测，得到如上图，其中L11，L22和L32分子量明显比其他的大，猜测为连接成功的质粒。 然后小提，酶切检测，片段大小为1700bp左右。确认载体片段插入成功(第四道为空载)。 然后取10ul质粒送测序。