2016年药学论文—短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的影响

2016年药学论文—短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的影响 精品文档欢迎来主页查询 短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的 影响 作者,黎渊弘 钟小斌, 林发全, 李明芬, 黎肇炎 【摘要】 目的研究短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外的抗凝作用及机制。按试剂盒说明进行磷脂结合抗凝蛋白对活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT) 、凝血酶时间(TT) 、纤维蛋白原,FIB,含量、凝血因子活性、组织凝血活酶抑制实验(TTI)和稀释的罗氏蝰蛇毒时间(DRVVT)、血小板聚集功能以及溶血、出血实验。结果磷脂结合抗凝蛋白能显著地延长活化部分凝血活酶时间和稀释的罗氏蝰蛇毒时间,减少组织凝血活酶抑制实验(TTI)试剂的磷脂浓度,能加速其抗凝作用,干扰?,?,?,?因子活性,未见溶血和出血。其抗凝活性与磷脂结合有关,可能通过内源性途径抑制凝血过程。结论短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白能够抗凝、抑制?,?,?,?因子活性并与磷脂结合,可通过内源性途径抑制凝血过程。 【关键词】 抗凝血, 磷酯, 蛇毒 更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 Abstract:ObjectiveTo study anticoagulation effects of Phospholipid-binding anticoagulation protein(PBAP) from Agkistrodon halys Brevicaudus Venom. MethodsThe activated partial thromboplastin time(APTT),Prothrombin time(PT),Fibrinogen (FIB),Thrombin time(TT) and Factor activity were determined by kit illustration. The TTI test was peformed according to the method of Schleider .The dRVVT test was done in quadruplicate using commercial kits acoording to the manufacturer’s iustrution.ResultsComored with conred group,the Phospholipid-binding anticoagulation protein(PBAP) from Agkistrodon halys Brevicaudus Venom could markedly prolong APTT and DRVVT(P 0.01) concentration-dependent but time-independent manner, accentuate the inhibitor effect of TT?by decreasing phospholipid concentration.and inhibit the activities of F?,C,F?:C,F?:C,F?:C.ConclusionThe Phospholipid-binding anticoagulation protein from the Agkistrodon halys Brevicaudus Venom can anticoagulate and inhibit F?:C,F?:C,F?:C,F?:C activity and bind Phospholipid. Key words:Anticoagulation, Phospholipid ; Snake venom 更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 蛇毒中常有的抗凝蛋白分为蛋白水解酶类和非蛋白水解酶,它们作用的有效成分和性质已被广泛研究。然而,蛇毒中磷酯结合抗凝蛋白,Phospholipid-binding anticoagulation protein,PBAP)对凝血功能的作用尚未见报道。笔者已报道从短尾蝮蛇毒中纯化出一种能与磷酯结合的新型抗凝蛋白,1,。该蛋白是二聚体,相对分子量为24.0 ×103(非还原)和14.6×103(还原)。等电点为pH 5.2。N-末端为DCPS(D/G)WSSYEGHCY(Q/K)。它具有精氨酸酯酶活性,而没有磷酯酶A，5’,核苷酸酶，纤维蛋白,原,溶解酶，磷酸二酯酶，L,氨基酸氧化酶和类凝血酶的活性。本文将抗凝蛋白体内外对凝血功能的作用报道如下。 1 器材 电泳纯的短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白,由广西医科大学蛇毒研究所纯化和提供; 活化的部分凝血活酶时间,APTT,、凝血酶时间,TT,、凝血酶原时间,PT,、纤维蛋白原,FIB,测定试剂盒,为美国Instrumentation Laboratory公司产品,因子?,?,?,?,?,?,?缺乏血浆从George King Bio-Medical公司购买,牛凝血酶和人凝血酶和其他试剂均为国产纯。Lamb da Bio20双光束紫外分光光更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 度计,美国PE公司产品, Allegra64R台式高速离心机,美国Beckman公司产品。ACL-Advace全自动血凝仪,美国IL公司产品。 新西兰白兔(2.0?0.5) kg,SD大鼠(200?20) g,小鼠(18?2) g (清 洁级,广西医科大学实验动物中心)。 2 方法 2.1 APTT,PT,TT及FIB含量测定 2.1.1 体外法0.2 mg/ml的抗凝蛋白0.1 ml(对照组为生理盐水),分别加入用30份正常的人血浆制成的混合血浆4 ,6,8,配置成1?40,1?60,1?80 3个不同稀释浓度,每一稀释浓度取50 μl,然后按APTT,PT,TT, FIB试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行。 2.1.2 体内法新西兰白兔24只,随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 中、低剂量组和肝素组。各兔于耳缘静脉按0.8,0.4,0.2 mg/kg给药,肝素组剂量为50 U/kg, 药前及药后15 min分别从耳动脉取血2 ml,用3.8%枸橼酸钠9?1抗凝,3 000 r/min离心10 min,分离贫血小板血浆,按APTT,PT,TT试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行测定。 2.2 凝血因子活性的测定 2.2.1 体外法0.2 mg/ml的抗凝蛋白0.1 ml(对照组为生理盐水),分别加入用30份正常的人血浆制成的混合血浆1,2 ,4,6,8 ml,配置成1?10,1?20,1?40,1?60,1?80五个不同稀释浓度,用因子缺乏血浆作为标准,进行凝血因子F?:C,F?:C,F??C,F??C,F??C,F??C,F??C,F??C的活性测定,并计算抑制率。 2.2.2 体内法新西兰白兔24只,随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、中、低剂量组和肝素组,各兔于耳缘静脉按0.8,0.4,0.2 mg?kg-1给药,肝素组剂量为50 U/kg 药前及药后15 min分别从耳动脉取血2 ml,用3.8%枸橼酸钠9?1抗凝,3 000 r/min离心10 min,分离贫血小板血浆。按凝血因子试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 自动血凝仪上进行各种凝血因子测定。 抑制率(%)= (空白对照值-供试品值) /空白对照值 ×100% 2.3 组织凝血活酶抑制试验和稀释的罗氏蝰蛇毒的时间测定组织凝血活酶抑制实验按Schleider,2,方法,用APTT试剂以1?1,1?100,1?1 000稀释度进行测定。稀释的罗氏蝰蛇毒时间按试剂指导方法用商品试剂盒完成。 2.4 血小板聚集实验 血小板聚集实验用Born和Cross,2,方法以双通道聚集仪,Chrono-Lorp,测定。 2.5 溶血性实验,3,4,取大鼠1只,腹腔注射 3%戊巴比妥,30 mg/kg,溶液麻醉后,打开腹腔,自腹主动脉取血15 ml,置于三角瓶中,瓶中置有玻璃珠,搅拌除去纤维蛋白,然后将血移至离心管内,加生理盐水10 ml,混合后2 500 r/min离心5 min,除去上清液,再加入生理盐水混匀离心,反复洗3,4次,直到上清液呈无色透明,按所得红细胞体积,用生理盐水稀释成2%的混悬液,然后取7只试更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 管,按5加入溶液,各管轻轻摇匀,在37?水浴中保温1 h,2 500 r/min离心5 min,取上清液用Lamb da Bio20双光束紫外分光光度计测定在540 nm波长处的各管吸光度(OD值)。 上一页1 2下一页 2.6 出血性实验 按Kondo皮内注射半定量法测定,5, 取小鼠10只,分成5组,每组2只,分别皮下注射0.1 ml 含有10,20,50,100,200 mg不同浓度的磷酯结合抗凝蛋白,对照组注射等量生理盐水。6 h后处死小鼠,打开皮肤,从皮内侧面测量出血点的大小,以引起平均直径为5 mm的出血点所需的剂量为最小出血剂量,以此来判断该供试品有无出血活性。 1.3 统计处理所有实验数据均采用成组的方差分析用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果均以?s表示。 3 结果 3.1 抗凝蛋白对APTT,PT,TT,FIB含量的作用不同浓度(1?40,1?60,1?80)的抗凝蛋白体外对人血浆PT,TT及FIB含量虽有微小更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 影响,但其变化值属于正常范围。它明显延长APTT,与对照组相比有显著性意义(P 0.01)。抗凝蛋白浓度越高,其抗凝活性越强,见表1,。然而这种作用与温育时间无关,见图1,。家兔体内抗凝实验也表明:大中小剂量磷脂结合抗凝蛋白药后15 min,APTT均比药前明显延长(P 0.01或P 0.05),且有剂量依赖性,而不影响PT和TT。其作用与肝素相似。见表2。 3.2 抗凝蛋白对凝血因子活性的作用 不同浓度磷脂结合抗凝蛋白体外对凝血因子的影响不同,1?60和1?80稀释度仅仅抑制 F?:C因子活性，1?10,1?20,1?40稀释度则可抑制F??C,F??C,F??C, F??C的活性而不影响其它因子的活性,抗凝蛋白浓度与因子抑制活性呈正相关(见表3)。兔体内凝血因子实验也表明,大中剂量磷脂结合抗凝蛋白药后15 min均可抑制F??C,F??C,F??C,F??C的活性而不影响其它因子的活性,抗凝蛋白浓度与因子抑制活性呈正相关。肝素则仅抑制F??C,F??C,F??C的活性而不影响F??C活性。见表4。表1 不同浓度磷脂结合抗凝蛋白体外对人血浆APTT,PT,FIB,TT的作用表2 不同浓度磷脂结合抗凝蛋白体内对家兔APTT,PT,TT的影响药后与药前相比,*P,0.05,**P,0.01,n=6 3.3 对组织凝血活酶抑制实验和稀释的罗氏蝰蛇毒时间的作用 在更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 组织凝血活酶抑制实验中,当抗凝蛋白为4.4 μg/ml浓度时,在1:100和1:1 000稀释时,活化的部分凝血活酶时间分别为54.7 s,对照48.7 s,和176.8 s,对照137.7 s,,表明用高稀释度的A试剂时,抗凝蛋白对组织凝血活酶抑制实验更为显著。在稀释的罗氏蝰蛇毒时间测定中,亦可看到在抗凝蛋白浓度为2.2 μg/ml和4.4 μg/ml正常混合血浆时,罗氏蝰蛇毒时间分别为47.7 s和56.5 s,对照41.5 s,,表明在抗凝蛋白的作用下,稀释的罗氏蝰蛇毒时间较对照,41.5 s,明显延长,而且与剂量成正比。表3 不同浓度磷脂结合抗凝蛋白体外对人血浆凝血因子的影响表4 不同浓度磷脂结合抗凝蛋白体内对家兔凝血因子的作用 3.4 抗凝蛋白对人血小板聚集的影响 在人富血小板浆中,在160 μg/ml的浓度下,抗凝蛋白并不诱导人血小板聚集,也不抑制由胶原,2 μg/ml,、ADP,10 μmol,、花生四烯酸,1 μmol,、瑞斯托霉素,1 μg/ml,、肾上腺素,6 μmol,诱导的血小板聚集。 3.5 抗凝蛋白的溶血性实验 6支不同浓度磷酯结合抗凝蛋白测定管的吸光度与生理盐水对照管吸光度比较无明显差异,表明磷酯结合抗凝蛋白无溶血作用。结果见表5。表5 不同浓度磷酯结合抗凝蛋白的溶血实验 更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 3.6 抗凝蛋白的出血性实验 对照组与小于100 mg?,0.1 ml,-1磷酯结合抗凝蛋白各组小鼠皮内均无出血点发现 而注射了大于200 mg?,0.1 ml,-1磷酯结合抗凝蛋白的小鼠皮内则出现出血点。 4 讨论 蛇毒中磷脂酶A2 (PhospholipaseA2 ,PLA2)是蛇毒中研究领域里被十分注目的一种酶,PLA2特异的化学结构和复杂的生理功能是研究脂代谢生物膜磷脂结构和酶系脂蛋白间相互作用,以及有关凝血和溶血机制等方面的重要工具酶。蝮蛇蛇毒中可纯化出3种PLA2(中性、酸性、碱性),它们的分子量相近约为14 000道尔顿,其中中性PLA2是突触前神经毒素,酸性PLA2是血小板聚集抑制剂,碱性PLA2有极强的溶血活性,6,。而蝮蛇蛇毒中纯化的磷脂结合抗凝蛋白相对分子质量为24 000,实验证实其无明显的溶血活性和血小板聚集抑制作用,说明磷脂结合抗凝蛋白是一种有别于PLA2抗凝物质。 更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 由于活化部分凝血活酶时间测定试剂和稀释的罗氏蝰蛇毒时间测定试剂含有磷脂,该试剂中存在的磷脂酰丝氨酸的浓度对抗凝蛋白特别灵敏。在实验中,纯化的抗凝蛋白明显地延长活化的部分凝血活酶时间和稀释的罗氏蝰蛇毒时间,其作用与浓度成正比,而与温育时间无关,图1,。又因该抗凝蛋白没有磷酯脂酶A的活性存在。可知,其对磷脂的作用是直接与磷脂结合,1,而不是对磷酯的水解作用,鉴于该抗凝蛋白没有类凝血酶活性。凝血酶时间测定亦正常,说明其不是肝素样抗凝血物,据此我们认为活化的部分凝血活酶时间和稀释的罗氏蝰蛇毒时间测定的异常,不是由于血中存在其它抗凝物,而是磷脂结合抗凝蛋白所致。 在组织凝血活酶抑制实验中,可看到降低试剂磷脂浓度,从1/100至1/1 000稀释,,该抗凝蛋白能够加速APTT的延长,提示试剂系统中磷脂的含量和血液凝固实验的延长程度成反比,磷脂依赖实验试剂中磷酯的浓度越低,则抗凝作用越强,表明其体外抗凝作用与血凝的磷脂依赖试验中磷酯的浓度有关。体内抗凝研究结果表明,磷脂结合抗凝蛋白不能延长PT和TT,无纤溶活性,对血小板聚集亦无抑制作用,表明其对外源性凝血系统和纤溶系统无明显影响。由于PBAP亦非针对某一特定的凝血因子具有特异的抑制作用,它可以对多种凝血因子活性,F?:C,F?:C,F?:C,F?:C,及不同凝血阶段均具有干扰性或抑制性作用, 说明磷脂结合抗凝蛋白的抗凝作用主要是干更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 扰内源性凝血系统,其作用可能是直接与磷脂结合,阻止了磷脂类物 质参与凝血过程。 【参考文献】 ,1, 黎渊弘,黎肇炎,林发全,等.短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝 蛋白的分离纯化及鉴定,J,.中国药理学通报,2006,22(7),831. ,2, Schleider MA,Nachman RL,Jaffe EA,et al.A clinical study of the Lupus Anticoagulant,M,.Blood,1976,48,499. ,3, Born GVR,Cross MJ.The aggregation of blood platelelts,M,.J Physiol (Lond) 1963,168,178. ,4, 陈 奇.中国药理研究方法学,第1版,M,.北京,人民卫生 出版社,1993,168. ,5, Kondo H,Kondo S,Lkezawa H,et al. R.Studies on the quantitative method for determination of hamorragic activity of Habu snake venom,J,.Jap.J.Med.sci.Biol,1960,13(1),43. ,6, 武祥福,陈远聪.浙江蝮蛇毒中三种磷脂脂酶的比较,J,.生 更多精品文档,欢迎来我主页查询 精品文档欢迎来主页查询 物化学与生物物理学报,1984,16,2,,664. 上一页 1 2下一页 更多精品文档,欢迎来我主页查询