生远志及其皂苷与蜜远志对大鼠胃组织中活性物质及酶活性的影响 .doc

生远志及其皂苷与蜜远志对大鼠胃组织中活性物质及酶活性的影响 .doc 生远志及其皂苷与蜜远志对大鼠胃组织中 活性物质及酶活性的影响 作者:赵海平， 王建， 吴晖晖， 鲍荟竹， 田徽 【关键词】 生 远志及其皂苷;,,蜜远志;,,胃组织;,,,酶活力;,,相关活性物质 摘要:目的考察生远志及其皂苷与蜜远志对大鼠胃组织中相关活性 物质及酶活性的影响，以从分子水平阐释其损伤胃黏膜及抑制胃肠 运动的机制。方法采用考马斯亮兰显色法、硝酸还原酶法、定磷 法，测定灌胃10 d大鼠胃组织Ca2+-ATP酶活力，PGE2和NO含 量。结果?与空白组相比，生远志及其皂苷与蜜远志均能明显降低 胃组织PGE2含量(P,0.05或P,0.01);?生远志组与空白组相 比，能显著增加胃组织中NO含量(P,0.05)，而皂苷组对胃组织 NO含量虽有增高趋势，但与空白组比较无显著性差异(P, 0.05)，蜜远志对NO影响不明显;?生远志组与空白组比较，能 显著降低胃组织Ca2+-ATP酶活力(P,0.05)，而皂苷组和蜜远志 组与生远志比较，有显著性差异(P,0.05)。结论生远志抑制胃肠 运动及损伤黏膜机制与其降低胃组织PGE2含量与Ca2+-ATP酶活 力，增加NO含量相关;远志皂苷能极显著降低胃组织PGE2含 量，其主要呈现胃黏膜损伤不良反应;蜜远志亦能降低胃组织PGE2 含量，但对Ca2+-ATP酶与NO无明显影响。 关键词:生远志 及其皂苷; 蜜远志; 胃组织; 酶活力; 相关活性物质 Abstract:ObjectiveTo study the effects of crude Radix Polygalae ， Saponins and Honey-stir-baked Radix Polygalae on the active substances and enzyme in gaster-tissue of rat so as to explain its mechanism in molecular level. MethodsUsing method of coomassie brilliant blue, method of nitroreductase chromatometry and the colorimetric determination of phosphorus，arkably decrease PGE2(P,0.05 or P, 0.01).?pared arkably increase NO(P,0.05).The group of Saponins has tendency of increasing NO, but there arkable difference pared arkable difference betarkably decrease Ca2+-ATPase(P,0.05).The group of Saponins has a tendency of increasing NO, but there arkable difference pared arkable differences paring echanism of crude Radix Polygalae could restain gastrointestinal motility and damage mucosa is related to decreasing PGE2 and Ca2+-ATPase and increasing NO. Saponins can remarkably decrease PGE2 and has a tendency of decreasing Ca2+-ATPase but damage in mucosa is its chief affection. Honey-stir-baked Radix Polygalae can decrease PGE2, but it has no effect on Ca2+-ATPase and NO. Key e activity; Active substance 远志为远志科 (Polygalaceae)植物远志Polygala tenuifolia in，煎煮1 h，过滤，重 复两次，合并滤液，浓缩至1?1(即1 ml药液中相当于含原生药1 g)药液，高温灭菌,置冰箱内中备用。远志皂苷:称取生远志粗粉,按文献〔1〕所载方法进行提取，沉淀减压干燥, 置冰箱中备用。 1.3 试剂总蛋白测试盒(考马斯亮兰显色法)、NO测试盒(硝酸还原酶法)、ATP酶测试盒(定磷法)，均由南京建成生物工程研究所提供。所用化学试剂均为化学纯。 1.4 仪器酶标仪(上海智华医学精密仪器有限公司)、756MC紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、BP211D电子天平(SARTORIUS)。 1.5 统计方法所有数据依据SPSS11.5版统计软件进行t检验分析处理。 2 方法 取健康l/100 g，连续灌胃10 d(各组给药剂量参见各图)，实验前禁食18 h，末次给药4 h后处死。置冰盒上，快速剪取全胃。沿大弯部剪开冲洗，取腺胃(胃体与胃窦)部分，称重。按重量体积比加生理盐水，制成10%的组织匀浆。1 000 r/min，离心5 min，上清液保存备用。 2.1 大鼠胃组织PGE2含量的测定取胃组织匀浆0.1 ml，按文献〔2〕所载方法制得上清液，于278 nm处测其紫外吸光度。 2.2 大鼠胃组织蛋白含量、NO含量的测定取胃组织匀浆0.05 ml，采用考马斯亮兰显色法，按照试剂盒说明书测定蛋白含量。再取0.5 ml，采用硝酸还原酶法按照试剂盒说明书测定并计算NO含量。 2.3 大鼠胃组织Ca2+-ATP酶活力的测定取胃组织匀浆200 μl，采用定磷法按照试剂盒说明书测定并计算Ca2+-ATP酶活力。 3 结果 3.1 对灌胃10 d大鼠胃组织PGE2的影响(图1)生远志组、蜜远志组PGE2吸光度明显低于空白组(P,0.05);皂苷组PGE2吸光度显著低于空白组(P,0.01)，明各给药组均能显著降低胃组织中的PGE2含量。 图1 各组药物对灌胃给药10 d大鼠胃组织PGE2含量的影响(略) 3.2 对灌胃10 d大鼠胃组织NO的影响(图2)生远志组NO含量显著高于空白组(P,0.05)，皂苷组、蜜远志组的NO含量有增高趋势，但与空白组比较无显著性差异(P,0.05)。 图2 各给药组对灌胃给药10 d大鼠胃组织NO含量的影响(略) 3.3 对灌胃10 d大鼠胃组织Ca2+-ATP酶活力的影响(图3)与空白组比较，生远志组能显著降低Ca2+-ATP酶活力(P,0.05)，且与蜜远志组、总皂苷组比较，存在显著性差异(P,0.05)。 图3 各给药组对灌胃给药10 d大鼠胃组织Ca2+-ATP酶活力的影响(略)4 讨论 远志为临床常用药，在常规用量情况下偶可引起轻度恶心。若大剂量服用可引起恶心、呕吐、腹胀、腹泻、溶血〔3〕等不良反应。相关专着在远志项下注明如有胃、十二指肠溃疡、胃炎、严重贫血或气血两虚者应慎用〔4〕。查阅与中药炮制相关的文献，有记载远志呈现“戟人咽喉”等 副作用。现代药理研究亦证明其所含远志皂苷能刺激胃黏膜，反射性地引起恶心、呕吐。本课题组前期研究发现生远志的急性毒性较大，对胃肠运动有显著抑制作用，并能导致胃肠明显充气、肿胀、肠壁变薄等现象,呈现出明显的胃肠毒性。蜜炙品的毒性较小，对胃肠运动无明显影响，黏膜损伤轻。并发现总皂苷为远志的大类毒性成分〔5~7〕。本研究从相关活性物质及酶活力方面考查了生远志及其皂苷与蜜远志对胃黏膜损伤及胃肠运动抑制机理。前列腺素(PGs)是由环加氧酶催化花生四烯酸生成的,目前已发现有20余种。胃组织主要含PGE和PGF，以PGE2为主。其既有增强胃黏膜抵抗力的作用，又有削弱损伤因子的功能，作用机制主要是通过对黏液分泌、胃黏膜血流、黏膜钠等方面的影响而发挥和提高胃黏膜细胞保护作用〔8〕。如前述，课题组研究结果表明，生远志及其皂苷对胃排空、小肠推进呈现显著抑制作用，皂苷会引起胃肠黏膜刺激性损伤〔5~7〕。本次研究结果表明，长时间(10 d)、大剂量(10 g/kg)给予各组药物，均使胃组织中PGE2明显降低，能不同程度降低胃黏膜细胞的保护，而呈现对胃黏膜表层血管的损伤。其中远志皂苷组的PGE2含量最低，结合黏膜损伤及其他相关实验研究结果，其作为大类毒性成分，对胃黏膜的损伤程度较严重。现有文献报道，胃肠运动受神经、体液和肌源性电活动等多方面因素的调节，局部产生的NO是非肾上腺素能非胆碱能神经纤维(NANC)的主要抑制递质〔9〕，对消化道平滑肌产生抑制作用，具有抑制性神经递质作用。Ca2+-ATP酶是离子泵P型家族中的成员，其转运机制是通过磷酸化和去磷酸化反应引起酶蛋白构象间的相互转换来完成Ca2+的转运，对于维持细胞内外Ca2+稳态至关重要。本次研究结果表明:生远志能使胃组织中的NO增加，具有拟抑制性神经递质样作用，因而导致胃动力障碍。而蜜远志组NO含量与空白组之间无明显差异，提示远志经蜜制后，对胃的抑制作用弱，与胃排空实验结果吻合。本研究还表明，生远志能降低靶器官胃组织中Ca2+-ATP酶活力，影响了细胞内外各离子的分布,导致胃平滑肌细胞内外Ca2+分布失衡，致使动作电位的产生受到影响,最终表现为胃平滑肌舒缩功能受到抑制,胃蠕动和推进功能降低，这与本研究小组测得的胃电生理的快波、慢波频率及胃动抑制结果吻合。研究中发现，远志皂苷对胃黏膜呈现刺激损伤，对胃肠运动及电生理呈现抑制效应。其对胃组织Ca2+-ATP酶活力影响不甚明显。蜜远志组对胃组织Ca2+-ATP酶活力影响小。综上表明:生远志抑制胃肠运动及损伤黏膜机制与其降低胃组织PGE2含量与Ca2+-ATP酶活力，增加NO含量相关。远志皂苷能显著降低胃组织PGE2含量，并有降低Ca2+-ATP酶活力及增加NO含量的趋势，但其主要 呈现的是胃黏膜表层血管损伤的不良反应;蜜远志亦能降低胃组织PGE2含量，有增强Ca2+-ATP酶活力趋势，对NO无影响，提示远志蜜炙品长时间、超剂量应用，对胃黏膜也有轻度损伤，其损伤机制与PGE2相关，而对胃肠运动无影响。