肠道病毒71型VP1基因和5’非编码区核酸序列分析

肠道病毒71型VP1基因和5’非编码区核酸序列分析 肠道病毒71型VP1基因和5’非编码区核酸序列分析 : 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者: 日期:年乡月俘日 多玩彬 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅:本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用 学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为 郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者: 日期:年月/日 孙妈摘要 摘要 肠道病毒型 ,是引起儿童手足口病,,暴发流行的主要病原体之一,它还能够引起无菌性 脑膜炎、神经源性肺水肿等与神经系统相关的疾病,致残及病死率较高。 年春夏之际,我国部分省区市出现了引起的手足口病的严重疫情,重 症和死亡病例不断出现。年月卫生部将手足口病纳入丙类传染病进行管 理。是小病毒科、肠道病毒属的成 员,是其主要的中和决定因子,能够直接决定其抗原性,具有与肠道病毒 血清型完全对应的遗传多样性。的’非编码区 , 含有一个型的内部核糖体进入位点 ,和其 它结构,在病毒复制和翻译起始过程中发挥重要的作用,对脊髓灰质炎病毒 的 研究发现涉及病毒毒力。 对不同临床背景的毒株的和核酸序列的测定和分析,有 助于阐明的和与致病性的关系;确定毒株的型别对于 的亚型的监测和防控策略的制定有较大的意义;目前有关的研究中, 在的区的定位和长度仍不明确,确定在的 区中的准确位置,可以为研究的功能提供更加精确的位点。 目的 .比较不同临床结局毒株和’限的核酸序列。 .确定研究中毒株的型别。 .比较不同临床结局毒株的二级结构。 .确定内部核糖体进入位点?也’及’端分界。 方法 .标本来源:粪便标本采集自年月至月间在郑州市第六人民医院 住院的手足口病患儿。 .病毒核酸提取:提取标本处理液中的病毒。 .的检测:用特异性引物对提取的病毒进行检测。 .和的逆转录:挑选不同临床结局的毒株的, 分别用和特异性引物对和进行扩增。 摘要 .的克隆与鉴定:经过凝胶提取和纯化,将所得的片段与载 体进行连接,转化入感受态细胞中,筛选阳性克隆,增菌培养后提取质粒,以 特异性引物对提取的质粒进行检测。 .分析比较和序列,构建系统进化树:将不同临床结局 毒株、测序后用进行核酸序列的分析。用构建系 统进化树。 .的二级结构预测:用 .来预测的二 级结构。 结果 .获得了 和完整的核苷酸序列。 .研究中个毒株的核苷酸序列间的一致率都在.%以 上,重症组和轻症组毒株间序列的一致率在.%一%之间。个毒株 氨基酸序列个氨基酸问的一致率为%。个毒株的核苷酸 序列间的一致率均在.%以上,重症组和轻症组毒株间序列 的一致率在.%.%之间。 .年郑州毒株的核酸序列与亚型毒株的平均一致率为 .%,属于亚型。根据核苷酸序列的系统进化分析结果与根据 核苷酸序列的结果一致。 .重症以及死亡毒株的 二级结构比轻症毒株的二级结构复杂 和紧凑。 .确定 的定位于第核苷酸之间的区域。 结论 .研究中毒株和核苷酸序列同源性较高,氨基酸序 列完全一致,未发现重症和死亡毒株特异性的差异位点。 .研究中的个毒株均属于亚型。 .根据 分型的结果与根据核酸序列分型的结果一致。 . 的内部核糖体进入位点定位于第?核苷酸之间的区域。 关键词手足口病肠道病毒型 ’非编码区内部核糖体进入位点 .懿 . , 瑚 , . ,. .姚. .,. . ’ ’ . ’ ?洹 .’ .. ’ , .. .’ . .?己’乙.: . 矿’ . . 跳:?. .乙 . . . ’ . : . . ’ . . .’ . . ..、,.% .%. , %.% . , ’限’ .%. . .% .. ’. , .: . ’ 也 . .?洹’ . . 曲.’. . . . . ’. .?汪? ’ .目录 目录 摘要??.. 目录一?? 图和附表清单...??. 中英文缩略词对照表 引言? 与方法 . 材料?. ..标本来源. ..主要试剂.. ..主要仪器?. ..主要溶液的配制。 .实验方法?. ..粪便标本的处理. ..病毒核酸的提取. ..病毒的浓度和和纯度测定 .. 核酸检测? .. 的:. .. 的凝胶回收与纯化??一 .. 的浓度和和纯度测定.. 与克隆载体的连接与转化..质粒提取。 ..重组质粒鉴定? 目录 ..核苷酸序列的测定?。 ..核苷酸序列的比对分析和系统进化树的构建??一 ..二级结构预测? ..数据整理及统计分析? 结果. .标本临床背景的描述和分析??。 ..重症病例组和轻症病例组平均月龄的比较?. ..重症病例组和轻症病例组的性别分布比较? . 阳性标本的筛选?. .. 检测结果 ..检测结果分析?。 . 的结果??. . 的结果? . 【瓜重组质粒的.鉴定 . 核苷酸序列分析以及进化树的构建. .. 年郑州分离毒株的核苷酸序列分析??。 .. 年郑州分离毒株核苷酸系统进化分析?一 . 氨基酸序列分析以及进化树的构建 .. 年郑州分离毒株的氨基酸序列分析??~ .. 年郑州分离毒株氨基酸序列系统进化分析 . 核苷酸序列分析 .. 年郑州分离毒株的核苷酸序列分析.. 年郑州分离毒株系统进化分析? . 年郑州分离毒株哪.二级结构分析??。 讨论??. . 关于本次收集的手足口病病例的临床背景 . 年郑州分离毒株的核苷酸序列分析. . 年郑州分离毒株系统进化分析 目录 . 氨基酸序列分析以及进化树的构建. .. 年郑州分离毒株的氨基酸序列分析??。 .. 年郑州分离毒株氨基酸序列系统进化分析??。 . 核苷酸序列分析? .. 年郑州分离毒株的核苷酸序列分析.. 年郑州分离毒株.系统进化分析? .. 年郑州分离毒株 二级结构分析?. .关于的毒力决定因子?. 结论. 参考文献??.. 综丕参考文献?:?. 附录. 个人简历致谢图和附表清单 图和附表清单 图的结构信息? 图 毒株的检测 图 的结果?. 图 ? ’的结果?. 图 重组质粒的鉴定结果?。 图 本研究 个毒株的核苷酸序列的系统进化分析图 年郑州分离毒株核苷酸序列的系统进化分析? 图 毒株 翻译后的氨基酸序列与 氨基酸序列结果 图 年郑州分离毒株的氨基酸序列及基本信息 图 年郑州分离毒株氨基酸酸序列的系统进化分析.. 图 本研究个毒株的’瓜核苷酸序列的系统进化分析. 图 年郑州分离毒株核苷酸酸序列的系统进化分析?。 图 年郑州分离毒株核苷酸序列的系统进化分析二 图 年郑州分离毒株’限对蛆级结构预测图? 图 以年郑州分离毒株为例解析二级结构预测图图 年郑州分离毒株 的序列解 析 图 肠道病毒属和鼻病毒属’ 二级结构示意图?..:? 图 病毒的结构以及其基因组的结构 图 依赖’帽子结构和依赖的蛋白质合成过程以及所需要翻译起始因子 图 中国大陆年毒株的核苷酸序列系统进化分析? 图 年亚太地区各国家和地区各年度亚型汇总 表 对核苷酸序列进行分型所用到的序列信息 表 对 核苷酸序列进行分型所用到的序列信息表 例手足口病病例的主要临床症状 表 重症病例组和轻症病例组的性别分布情况??一 表 重症病例组和轻症病例组的病原分布情况表 测序的个毒株的临床背景资料 表 年郑州各分离毒株区核苷酸序列的一致率%??. 表 本研究 个毒株的核苷酸变异情况? 表 年郑州?,核苷酸序列与各亚型之间的一致性分析%..: 表 各亚型内部?,区核苷酸序列的平均一致率%??. 表 年郑州 区氨基酸序列与各亚型之间的一致性分析% 表 各亚型各序列区氨基酸序列的平均一致率%??. 表 年郑州市分离毒株区核苷酸位点变异情况~ 图和附表清单 年郑州各分离毒株核苷酸序列的一致率% 年郑州 ’限与各亚型间的一致性分析??一 各亚型各区核苷酸序列的平均一致率中英文缩略词对照表 中英文缩略词对照表引言 引言 , 肠道病毒型 是导致儿童手足口病,暴发流行的主要痛原体之一【】】。从遗传进化上讲, 和同属肠道病毒属、同样能够引起手足口病的柯萨奇病毒 关系最为密切,但是与不刚】,能够引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、 脊髓灰质炎样麻痹以及神经源性肺水肿等多种与神经系统相关的疾病【,】, 致残 及病死率较高,近年来备受关注。从年最早的描述开始【,感染疫情 就在世界各地不断出现【】,近年来,感染疫情在亚太地区如中国台湾【】、 日本川、马来西亚【】、新加坡】、澳大利亚【川等地比较严重,都有重症和 或 死亡病例发生。年【】春夏之际,我国部分省区市出现了引起的 手足口病严重疫情,重症和死亡病例不断出现。国家卫生部已于年月 日决定,将手足口病纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理【】。 是小病毒科肠道病毒属成员, 基因为一条长约 的单正链,只有一个开放阅读 缸,心,编码含个氨基酸的多聚蛋白。作为组成病毒衣壳蛋白 的四种组分之一,是最重要的中和决定因子,能够直接决定其抗原性,具 有与血清型完全对应的遗传多样性,根据的核苷酸序列的差异,可 将分为、、三个基因型,型和型又可以进一步分为?、 ~各亚型【】。对中国大陆~年间流行的分子进化分析发现, 十余年间我国流行的优势型别并没有发生过较大的变化,一直为型【。 截止目前的分子流行病学研究,感染导致的不同临床结局与病毒的基 因型别并无关联,因为不同基因型乃至亚型的毒株均可引起严重的神经系统 感 染或轻微的临床症状。为了进一步发现的神经毒力决定因子,一些研 究也将分离自轻症和重症临床患者的不同毒株的?】和【,】等区域 的核苷酸序列进行比对,结果并没有发现相应的的神经毒力决定因子。一 些研究还发现,同其它相同,存在重组现象【,但并未阐述重组与 毒力的关系。截止目前,对于点突变和重组两种进化方式与毒力之间的关 系目前尚无定论,仍需深入研究。 的’末端为’非编码区 ,?限,含有一个引言 ,,在病毒的复制 内部核糖体结合位点 和翻译起始过程中发挥重要的作用 】。是使核糖体进入到内部的翻 译起始位点的一段顺式作用区域,该区域可以直接引导不依赖’帽子结构 的、起始于内部的蛋白质翻译过程。从翻译上讲,这一过程同真核细 胞的依赖于’帽子结构的蛋白质的翻译起始过程存在较大的差异。根据 和起始密码子的位置关系,序列可以被分成种类型:肠道病 毒和鼻病毒型,心病毒和口蹄疫病毒型,甲肝病毒型。 的属于型【】。 与同属肠道病毒的脊髓灰质炎病毒,是脊髓灰质炎 的病原体,它可以引起严重的中枢神经系统疾病,具有同相似的基因组结 构,它的也含有一个型的。有研究发现的点突变是引起 减毒活疫苗致病性减低的主要决定因素,区序列的微小改变 都足以引起神经毒性的很大变异。因此对的’及进行结构 和功能的比较分析研究可能会有助于了解该病毒致病的分子生物学基础,有 助 于提供神经毒力决定因子方面的线索。 本研究拟通过对核苷酸序列的分析,确定年采集于郑州的 毒株的型别。另外在现有的有关的的研究中,大多是将包括 在内的作为一个整体来研究?也的功能,在的区的 定位和长度仍不明确。本研究拟通过对 的序列以及二级结构 的分析,来确定在的区中的准确位置,为后续的研究提供更 加精确的位点。由于拥有与宿主细胞不同的翻译起始过程,对它的 研究可能为抗病毒治疗提供潜在的、特异的靶作用位点,有助于缓解所引 起的神经系统相关症状的严重性,在今后的临床治疗工作中,可能会有广泛 的 应用。 一 材料与方法 材料与方法 . 材料 .. 标本来源 手足口病的临床诊断标准和临床分类标准依据《手足口病诊疗指南 年版》】。粪便标本采集自年月日至月日期间在郑州市第六 人民医院河南省传染病医院住院的个手足口病患儿。采集的标本按照《手 足口病防控指南版》【】进行保存处理。 ..主要试剂 试剂名称 生产厂家 焦碳酸二乙酯 上海公司 门 天根生物科技北京有限公司天根生物科技北京有限公司天根生物科技北京 有限公司 ‘ ? 北京康为世纪生物技术有限责任公司天根生物科技北京有限公司 卫呦 公司 强三羟甲基氨基甲烷 公司 硼酸 天津市凯通化学试剂有限公司 北京化工厂嗄: 琼脂糖 盐酸 北京化工厂 溴化乙锭 上海公司 无水乙醇 天津市凯通化学试剂有限公司 醋酸钠 天津市凯通化学试剂有限公司 氯仿 国药集团化学试剂有限公司 洛阳吴华化学试剂有限公司 胰蛋白胨 北京奥波星生物技术有限责任公司 材料与方法 琼脂粉 公司 酵母提取物 北京奥波星生物技术有限责任公司 引物合成 北京赛百盛基因技术有限公司 测序 北京三博远志生物技术有限责任公司 含染料 北京康为世纪生物技术有限责任公司 ? 北京康为世纪生物技术有限责任公司 伍感受态细胞 天根生物科技北京有限公司 天根生物科技北京有限公司 天根生物科技北京有限公司 天根生物科技北京有限公司 天根生物科技北京有限公司 宝生物公司 宝生物公司公司 青、链霉素混合液液 公司 氨苄西林 其余常规试剂均为国产分析纯级。 ..主要仪器 厂家 仪器 紫光分光光度计 日本】公司美国公司 隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂 上海跃进医疗器械厂 型电热恒温水槽 . 型水平电泳槽 北京六一仪器厂 台式水平离心机 德国公司 上海市实验仪器总厂 .型电热鼓风干燥箱 哈尔滨东联电子厂 空气浴振荡器 北京金花 微量可调节移液器 美国公司 超纯水系统 一 德国公司 德国公司 型电子分析天平 材料与方法 型自动电热压力蒸汽灭菌器 日本公司 普通冰箱 新乡新飞电器有限公司 ?冰箱 日本公司 超低温冰箱 日本公司 型快速混匀器 江苏金坛医疗仪器厂 生物洁净工作台 公司 低温离心机 日本公司 低温离心机 德国哈默公司 天津市金达化学试剂 精密试纸 ..主要溶液的配制 完全液的配置【】:取以下份液和份液加到份液中 即为完全工作液。 液: . . 无水. . 用蒸馏水溶解以上盐类,加蒸馏水补至,高压灭菌,即 为不完全工作液不含钙、镁离子。 液: . ‘ 溶解于蒸馏水中,高压灭菌。 液: . 溶解于蒸馏水中,高压灭菌。取以上份液和份液加到份 液中即为完全作液。完全液中加入.溶液,终浓度为青霉素 单位/,链霉素为/。 水 :将 加入到超纯水中,使其终浓 度达到.%,充分振摇混匀,室温放置过夜。 材料与方法 ×储存液 . 硼酸 . . 加入超纯水定容至,室温保存。 .工作液:量取 储存液,置于置于 容量瓶中加超纯水至。 .. . . 去离子水定容至,高压灭菌后置于保存。 ×肛: . 硼酸 . . . . 用去离子水定容至,混匀溶解后室温保存备用。 工作液:量取 储存液,置于置于 容量瓶中加超纯水至。 .工作液,加 .%琼脂糖凝胶:称取.琼脂糖,加入 热煮沸,冷却至约时加入.溴化乙锭,混匀备用。 固体培养基: 胰蛋白胨 . . 酵母提取物 . 琼脂粉 . 加入蒸馏水,加热使固体全部溶解,调整至.,用蒸馏水定容至 ,高压灭菌,置于?保存备用。如配置含有的固体培养基,则 需在铺板前,待培养基温度降到时手可触摸,加入/的 溶液,使其终浓度为/,以免温度过高导致抗生素失效,并充分 摇匀。 材料与方法 液体培养基: 胰蛋白胨 . . 酵母提取物. 加入约蒸馏水,加热使固体全部溶解,调整至.,用蒸馏水定容 至,高压灭菌,置于保存备用。如配置含有的固体培养基, 则需待培养基温度降到时手可触摸,加入/的溶液肛, 使其终浓度为/,并充分摇匀。 .实验方法 ..粪便标本的处理 操作步骤【凋: 在的管上标记标本的号码; 每个管中加入. 、.氯仿; 在生物安全操作柜中将每一份粪便标本取约加入标好号码的管 中确保管上的标号与原始标本的标号一致; 剩余的标本留在原容器中,冻存于.?; 拧紧离心管,在机械震荡器上剧烈震荡; 盖好离心机的盖子,用低温离心机在?、条件下离心; 在生物安全柜中将每份标本的上清液分别吸到个有外螺旋盖的冻存 管中如果上清液不太清澈,应再用氯仿处理次; 一管粪便处理液冻存于.?作为备份,另外一管存于?以各 提取和纯化。 ..病毒核酸的提取病毒提取试剂盒离心柱形来提 采用天根 取病毒的。实验步骤参照试剂盒说明。提取的关键是防止实验中 分解酶的污染。所以必须采取严格的措施防止酶的污染:戴一次性手 套:使用专用实验台:在实验过程中避免讲话;尽量使用一次性塑料器皿,如 果使用玻璃器皿,应在使用前做如下处理:用.%的焦碳酸二乙 材料与方法 酯水溶液在室温处理小时。在下高压灭菌分钟除去残余的 。通过上面的严格操作可以防止实验者的汗液、唾液中以及实验器皿上的 分解酶的污染。另外,实验所使用的器具和仪器应专门使用,尽量不 要用于其它实验。以下步骤中凡是牵涉到处理的操作都严格按照此措施执 行。 所有的离心步骤均在室温下进行?。 溶液的配制如下: ? ,将 冻干粉的管内加入 向装有 冻干粉彻底溶解,得到终浓度为‖的溶液,然后分装到 .的离心管中,每管.,置于.储存。使用时按照提取的次数取 出相应数量的溶液,应避免使溶液反复冻融,冻融次数不能超过次。尤其应 该注意的是冻干粉不能直接溶解于裂解液中,必须先溶解在 . 中,然后才能再溶解至缓冲液中。 每管 溶液中加入裂解液 .,混匀,配成 工作液分装到个的. 工作液,用移液器将 离心管中。 向离心管中加入标本样品需首先平衡至室温。涡旋振荡 秒混匀。为了保证裂解充分,样品处理液和 工作液需要彻底混匀。 在室温.?孵育分钟。 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。 加入无水乙醇,盖上管盖并涡旋振荡秒。注意:如果周围环 境高于?,乙醇需要再在冰上预冷后再加入。 简短离心以收集附着在管壁及管盖上附着的液体。 小心将离心管中的液体转移至.吸附柱吸附柱 放在收集管中,盖上管盖,离心分钟,弃废液,将吸附 柱放回收集管中。注意:如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中,应加 大转速,延长离心时间至液体完全转移到收集管中。 重复此步骤。 溶液使用前须检查是否已经 小心打开吸附柱盖子,加入 加入无水乙醇,盖上管盖,离心分钟,弃废液,将将吸 附柱放回收集管。材料与方法 溶液使用前须检查是否已经 小心打开吸附柱盖子,加入 加入无水乙醇,盖上管盖,×离心分钟,弃废液,将吸附 柱放回收集管。 将吸附柱放回收集管中,,,离心分钟,使吸 附膜完全变干,弃废液。注意:乙醇的残留可能会影响后续实验。 将吸附柱放回收集管中,打开吸附柱盖子,室温放置分钟, 使吸附膜完全变干。 将吸附柱放入一个.离心管.中,小心打开吸附柱 . ,盖上盖子,室温放置分钟。 的盖子,向膜中央加入 ×离心分钟。将提取的置于.?储存 ..病毒的浓度和和纯度测定 用分光光度计法测定的浓度【】:用分光光度计测定波长 下样品的值,按波长下/来计算总的浓度。 用分光光度计法测定的纯度:用分光光度计测定、 以及波长下样品的值,通过倒来检测的浓度。 /在.之.之间,可以认为的纯度较好;小于.,则表明蛋白杂 质较多;大于.这表明已降解;眈值小于.,则表明提取的 中有异硫氰酸胍和巯基乙醇的残留。 .. 核酸检测 引物序列: 参考《手足病防控指南版》中的特异性引物【: .上游:.’,相对 于 ’.盯??订’.’ ;下游: ,相对于 ,以下不再标示。产物为。 使用天根 一步法试剂盒进行 孓。 完全融化模板,特异性引物,超纯 , ? 和 ,短暂离心后置于冰浴上。 按下列体系在冰浴条件下配制反应液: 材料与方法 反应成分 体积山 . ×.. ×.. /“. . ./. . 上游引物. . 下游引物 . 蛆模板 . 邪 . 总体系 当同时需进行多次反应时,应先将各组分加倍混合,然后再分装到 各反应管中,减少试剂损失,以使所取的试剂体积更准确,减少实验操作产生 的误差,以下不再赘述。 启动仪器直到温度上升至时,将反应管放入仪器中。 设置反应条件如下: 时间 温度? 步骤 反应逆转录反应 初始变性变性 退火 延伸 从步进行个循环 最终延伸 将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。琼脂糖凝胶%,电泳液 ,电压/,分钟。 .. 序列的 特异性引物: 参考年山东省一项有关的研究【中的 材料与方法 ; 二. : ’.’? ,.托.’。产物为 : 试剂盒进行。。使用 实验操作步骤: 完全融化模板,特异性引物,超纯,×, ,短暂离心后置于冰浴上。 和 按下体系在冰浴条件下配制反应液: 反应成分 体积 . ? .× . /. . . . . 上游引物.州 . 下游引物州 . 融妊模板 姗 . . 总体系 启动仪器直到温度上升至。时,将反应管放入仪器中。 设置反应条件如下: 反应 温度? 时间 步骤 逆转录反应 .. .变性 退火 ..延伸 从~步进行个循环 最终延伸 . 将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。琼脂糖凝胶%,电泳液 ,电压/,分钟。 材料与方法 .. ’的卜 自行设计引物,应用软件对比选自上的中国大陆地区不 同年份、不同地区的全基因组序列,在病毒序列的保守区段设计引物: ’?.:’. :,’: ?;’?乞: ’,.: .’。产物为。 按下列组成配制胙反应液: 反应成分 体积 .。 . . 上游 . 下游州 . . . 总体系 按以下条件进行盯.反应: 反应 时间 步骤 温度? . 逆转录反应 初始变性 . 变性 .退火 . .延伸 从~步进行个循环 最终延伸 . 将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。琼脂糖凝胶.%,电泳 液,电压/,分钟. .. 的凝胶回收与纯化普通琼脂糖凝胶回收试剂盒离 采用天根 心柱型。实验方法参照试剂盒说明书。操作步骤: 首次使用前应按照说明在漂洗液中加入无水乙醇。所有离心 步骤均在室温下操作。 ’。。。一’一??一?一一‘ ‘一?~一一一?‘一一‘‘?一~一一 主一一一~材料与方法 柱平衡步骤:向吸附柱中吸附柱应放入收集管中加入 平衡液,,,×离心分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 放回收集管中若胶块的体积过大,可先将胶块切成碎块。 将目的条带从琼脂糖凝胶中切下,应尽量切除多余的部分,放 入离心管中,称取重量。 向凝胶块中加入倍体积的溶胶液如果凝胶重为.,其体积 可以认为是.,依此类推,在的水浴中放置约分钟,期间应不断轻 轻地上下翻转离心管,以使凝胶块充分溶解。若管内仍有未溶的胶块,可以再 次补加一些溶胶液或多放置几分钟,以使凝胶块充分溶解。因为吸附柱在较 高温度时结合的能力较弱,所以应将凝胶溶液温度降至室温后再上柱。 将上一步骤的凝胶溶液加入吸附柱中吸附柱应放入收集管内, 室温放置分钟,,一,×离心秒,倒掉管里的废液,将吸 附柱屹重新放入收集管内。 加入“漂洗液至吸附柱中使用前应注意是否已加入了 无水乙醇,静置分钟,,,离心秒,倒掉收集管里的 废液,将吸附柱重新放回收集管中。 加入漂洗液至吸附柱中,,~离 心秒,倒掉废液。 将吸附柱重新放回收集管中,,离心分 钟,以除尽漂洗液。然后把吸附柱置于室温数分钟,彻底晾干,以防止残 留的漂洗液干扰下一步的实验。 将吸附柱放到一个新的离心管中,向吸附膜中间位置悬空加入已 经在?水浴中预热的洗脱缓冲液 山,在室温放置分钟。, ,离心分钟,以收集溶液。回收的产物保存在., 以防降解。 .. 的浓度和和纯度测定 用分光光度计法测定的浓度【:用分光光度计测定波长 下样品的值,按波长下/双链来计算 的浓度。 用分光光度计法测定的纯度【】:用分光光度计测定、 材料与方法 波长下样品的值,通过/来检测的纯度。/ 在.一.之间,可以认为的纯度较好;小于.,则表明蛋白杂质较多; 大于.则表明有污染。 .. ’与克隆载体的连接与转化 本研究使用来自天根的感受态细胞,宝生物的 ,结构如下图所示。实验方法参照试剂明书。 . 图 的结构信息在微量离心管中配置如下连接反应体系 反应成分 体积 . . 一 . . 总体系 将反应体系置于?,反应过夜。 感受 取感受态细胞置于冰水浴中。将反应体系全部加入肚 态细胞中,冰水浴中放置分钟。 将前一步骤的转化体系在水浴秒后,再在冰水浴中放置分 钟。注意在此过程不要摇动离心管。 。~一 。‘’ ’一。 ‘一 ~一~一一~ 。材料与方法 向离心管中加入无菌的培养基不含抗生素,混匀,然后 在?摇床中振荡培养分钟转,分钟,以使质粒上相关的抗性标记基 因表达,促进菌体复苏。 用无菌的弯头玻棒将 和 均匀涂布在含的 固体培养基上。 用无菌的弯头玻棒将步骤的菌液均匀涂布在含有、 、的固体培养基上,置于?培养箱中,过夜。 观察固体培养基上己形成的单茵落,用无菌的接种环挑取孤立的 白色菌落,在已加入含有的液体培养基的无菌试管中培养, 摇床振荡过夜培养转/分钟。 ..质粒提取质粒小提试剂盒离心柱型进行。实 使用天根 验方法参照试剂盒说明书。操作步骤: 柱平衡步骤:在吸附柱中吸附柱须放在收集管内加入平衡液 .,,,离心分钟,倒掉收集管里的废液,将吸附 柱放回收集管里。当天平衡过的吸附柱应在当天内使用。 取过夜培养的菌液,分次加入离心管中,,, 离心分钟,然后尽量吸除上清。 向留有菌体沉淀的离心管内加入溶液已加入,使 用涡旋振荡器震荡以彻底悬浮细菌沉淀。 向离心管中加入溶液 .,轻轻地上下翻转数次以使菌体沉淀充 分裂解,直至菌液变得清亮粘稠,整个过程用时不应超过分钟,以防止质粒 受到破坏。 向离心管中加入溶液 :后,立即轻轻地上下翻转数次,至出现 白色絮状沉淀。然后,印,离心分钟。 将步骤的上清液转移到吸附柱中吸附柱须放入收集管内, 避免吸出沉淀。,~,离心秒后倒掉收集管内的废液,将 吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入去蛋白液 ,,一离 心秒,弃废液,将吸附柱放回收集管中。 材料与方法 向吸附柱中加入漂洗液 应注意是否已加入无水乙醇, ,~离心秒,弃废液,将吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入漂洗液 ,,一,离心 秒,弃废液。 将吸附柱放回收集管中,,,离心分钟, 以将吸附柱中残余的漂洗液去除。然后将吸附柱打开盖子,室温放置数分 钟,以彻底晾干残余的漂洗液。 将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附膜的的中央滴加 已经在?水浴预热的洗脱缓冲液,室温放置分钟后, 一,×离心分钟。 ..重组质粒鉴定 仍使用..步骤的所用的引物:和。产 含染料试剂盒。 物为。使用康为世纪 按下列组成配制反应液。 反应成分 体积 . . 上游.州 . 下游州 . . . . 总体系 按以下条件进行反应。 温度 时间 步骤 反应 . 初始变性 . ? 变性 . 退火 . 延伸 从步进行个循环 . 最终延伸 将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。琼脂糖凝胶.%,电泳 材料与方法 液,电压/,分钟。 ..核苷酸序列的测定 将的产物直接使用原引物进行核苷酸序列的测定;将提取的 一 含有的阳性 质粒使用载体的通用引物 进行核苷酸序列的测定。具体操作委托北京三博远志生物技术有限公司。 .. 核苷酸序列的比对分析和系统进化树的构建 通过的程序对测序结果进行比对,使用的 子程序对所得的序列信息进行编辑,获得和的完整的核苷 酸序列信息。利用软件将本次研究测序得到的毒株的?,核苷酸 序列转化为氨基酸序列。 查阅文献搜集中已明确型别的 核苷酸序列个, 构建基因库如表所示。查阅文献搜集中已明确型别的全 基因序列共个,构建全基因序列基因库如表所示。 使用】软件用内置的程序所得的核苷酸或氨 基酸序列进行比对,依据最大复合可能性模型【】 ,使用邻位相连【】构建系统进化树,将一株 毒株编号:作为组外对照株,用靴值分析法【】 对进化树分支的可靠性进估计,重复次。 使用软件,依据最大复合可能性模型,用成对比较法 比较各毒株核苷酸或氨基酸序列的一致性;用组内比较法仃 和组间比较法计算相同或不同基因型及基因亚型的 毒株序列的一致性。核苷酸或氨基酸序列的一致性用一致率相似百分比表 示。 .. ’ 二级结构预测 通过 .【】软件来预测的二级结构。 ..数据整理及统计分析 使用软件对标本和序列信息进行整理,构建标本库和序列库。使用 材料与方法 ,软件 社会科学统计软件包. 进行’方差齐性检验、两组独立样本的检验以及×列联表检验, 检验水准口.。材料与方法 彳 搽匦 王 王 王 譬 工 ? ? 枣廿 ? ? 寸 ? ? ? ?口 ? ? ?西口一 ?童寸 葛 尉求 萏茜吕 茜 舌舌舌舌舌吾舌舌舌寒舌吾舌舌舌舌耄 吝茜吕 . ??乏 ?口 吼卜 卜乱卜?一 ? 寸一口净《 ”心?函《 ?寸?《 命骠? 卜寸?《 价心芏瞄 寸.昏崎寸?函 口;函 寸岭寸? 一卜一寸?? 一 一?卜?? 一口 .一?? 葛甙寸‰ 一岔一。哆? ?寸文小口。 ?昏昏一.一.气‘、寸” .。王?.臣 簿娜黑世 。乙..口 ?.?一? ?.?认一? ?,,一自 寸.芝..篁孑? 《.. 衄 ?.之 ? ?..王《.一.‰ ?王 ?‰ 奈一 .函,王晶王 .., 曲.? ?? ?寸?.嚣皇矗盘 宁?.两 ?..一 搽皿 《?? 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