《食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定》编制说明

《食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定》编制说明 《食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定》 编 制 说 明 吉林省疾病预防控制中心 二〇一二年四月 目 录 一、 研究背景 ………………………………………………………… 二、 任务来源 ……………………………………………………… 三、 制定标准的必要性和意义 ……………………………………… 四、 标准制定胡主要过程 ………………………………………… 五、 制定标准的原则和依据………………………………………… 六、 标准主要条款的说明 …………………………………………… 1、标准的名称 ……………………………………………………… 2、标准的范围 ……………………………………………………… 3、方法原理 ……………………………………………………… 4、前处理条件 ……………………………………………………… 5、仪器分析条件 …………………………………………………… 6、检出限 ……………………………………………………… 7、线性范围 …………………………………………………… 8、准确度、精密度 …………………………………………… 七、标准验证情况说明 …………………………………………… 八、验证结论 九、本标准作为强制性地方标准的建议………………………………… 十、贯彻标准要求和措施建议 ………………………………… 十一、参考文献 …………………………………………………… - 2 - 一、 研究背景 碱性橙又叫盐基金黄、盐基杏黄、黄叱精盐酸盐、盐基杏黄块，为芳香胺类碱性染料。 分子式:CHClN。分子量248.72，属于偶氮类染料，主要12134 用于腈纶、人造纤维、皮革、纸等的染色和棉织品、丝织品的印花，具有致癌、致畸变性。 图1 碱性橙分子结构式 酸性橙又叫橙黄II 、金橙II、二号橙，分子式:CHNNaOS，分子量161124 350.32。酸性橙是一种酸碱指示剂，pH变色范围7.4(琥珀),8.6(橙);10.2(橙),11.8(红);萃取和光度测定阳离子表面活性剂、生物染色剂。 图2 酸性橙分子结构式 碱性嫩黄又叫碱性嫩黄O、 盐基淡黄O、盐基槐黄，分子式: CHNCl，17223分子量303.84，是一种芳香胺类碱性工业染料, 其结构示于图3。主要用于醋纤、棉织品的染色， 还用于纸张、皮革、油漆等的着色。有表明: 碱性嫩黄对皮肤黏膜有轻度刺激, 可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状, 人 - 3 - 接触或者吸入都会引起中毒。 图3 碱性嫩黄的分子结构式 由于碱性橙、酸性橙、碱性嫩黄比食用色素更易在食品中染色，一些不法商贩利用其色泽鲜艳、着色稳定且价格低廉的特点，将其作为色素用于食品生产和加工，但是这些工业染料具有致癌作用，给消费者带来潜在的危害和巨大的风险，严重危害了消费者的身体健康。 国家卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单》的通知中明确禁止碱性橙、酸性橙、碱性嫩黄在食品中使用。2011年卫生部将酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄作为食品安全风险监测项目提出，但是没有给出具体的国家标准检测方法。 二、 任务来源 任务来源:吉林省卫生厅 任务编号:DBS22/008 - 2012 归口单位:吉林省卫生厅 起草单位:吉林省疾病预防控制中心。 三、 制定标准的必要性和意义 近几年来，一些不法商贩利用一些廉价的工业染料，如酸性橙、碱性嫩黄和碱性橙等作为色素应用于食品生产与加工中，使食品色泽鲜艳，着色稳 - 4 - 定，但是这些工业染料具有致癌作用，给消费者带来潜在的危害和巨大的风险，国家卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单》的通知明确规定禁止在食品中使用。由于这些工业染料不属于食品添加剂范畴，所以现行国家、行业标准均没有规定其检测方法，目前检测碱性橙、酸性橙、碱性嫩黄的方法有示波极谱法、紫外可见分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱法。示波极谱法、紫外可见分光光度法、薄层色谱法有其他色素会造成干扰，误差较大。高效液相色谱法对于复杂基质的样品检测灵敏度低。文献资料也很少有这三种工业染料同时检测的报道。因此及时准确判断食品中是否存在这些非食用色素，建立一套快速、准确的食品中非食用色素的测定方法具有重要意义。 四、 标准制定的主要过程 1、前期工作 实验室在2011年，通过查阅最新的资料和技术文献，确定了测定食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的技术路线，对方法的检出限、回收率、精密度进行了系统研究，建立了一个操作简便、灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法，为食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄检测提供了技术依据。由于目前国家标准和地方标准中没有测定食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的方法，据此向吉林省卫生厅提出食品安全地方标准制定申请。 2、实验室间的验证工作 2012年5月，进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个 - 5 - 实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、检出限等。参 加验证的实验室一致认为:该方法适用于测定食品中酸性橙、碱性 橙和碱性嫩黄的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等 特点。 五、 制定标准的原则和依据 本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则》和GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分:化学分析方法》的要求进行编写。 六、 标准主要条款的说明 1、 标准的名称 食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定 2、 标准的范围 本标准规定了食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定方法，适用于腐竹、腐皮、豆腐干、海鱼、辣椒及其制品、花椒及其制品的测定。 3、 方法原理 以含50%甲醇、1%甲酸的50mmol/L 乙酸铵水溶液作为提取溶液，利用WAX弱阴离子交换固相萃取柱(60mg，3mL)对样品进行净化，UPLC-Ms/Ms 测定酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄含量。采用基质加标工作曲线内标法外标法定 - 6 - 量。 4、前处理条件 称取1.0 克试样于50mL 离心管中，加入10.0mL 提取溶液，超声提取30 分钟，10000 rpm 离心10 分钟，上清液转移至另一离心管中;残渣中加入10.0mL提取溶液再次提取，合并两次提取溶液。 取5.0mL 样品提取液，用固相萃取柱平衡溶液稀释定容至50.0mL，过WAX固相萃取柱(3mL 甲醇、3mL 水、3mL 固相萃取柱平衡溶液活化)，用2mL 淋洗液、2mL 水淋洗，5mL 洗脱液洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用样品稀释液定容至1.0mL，过0.22μm 滤膜后超高效液相色谱-串联质谱测定。 在确定以固相萃取作为净化方法的基础上, 考察了中性氧化铝柱、弱阴离子交换固相萃取柱、混合型阳离子交换柱的净化效果. 实验发现酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄在中性氧化铝柱上无保留; 阳离子交换柱上吸附太强, 很难洗脱; 在弱阴离子交换固相萃取柱上吸附强度中等, 通过优化洗涤、洗脱溶剂中甲醇含量能达到净化目的. 实验中分别以5mL 5%、15% 、25%、50% 、85% 氨水甲醇溶液对上样的弱阴离子交换固相萃取柱进行洗脱, 分别收集洗脱液, 浓缩、定容并测定, 测定回收率结果见表1。 因此选择含5% 氨水甲醇溶液为洗涤溶剂。含5% 甲醇溶液为洗脱溶剂, 酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄均有较高回收率。 5、仪器分析条件 - 7 - i. 色谱参考条件 色谱柱: Acquity UPLC BEH C18 (1.7μm， 2.1 mm×50 mm)。 柱温:40? 。 流动相:A 相:含0.1%甲酸的5mmol/L 乙酸铵水溶液; B 相:乙腈。 梯度洗脱情况见表2。 表2 梯度洗脱程序 时间(min) 流速(ml/min) 流动相A 流动相B 0.0 0.3 90 10 5.0 0.3 10 90 6.0 0.3 10 90 6.5 0.3 90 10 10.0 0.3 90 10 进样量:5μL。 流速:0.3 ml/min。 选择流动相时, 比较了乙腈和含不同体积分数( 0%-0.3%) 甲酸的乙酸铵水溶液, 发现当甲酸含量为0.1%时, 各待测物的响应值相对较高, 在很大程度上增加了目标物的分子离子化程度和检测灵敏度, 所以最终选用乙腈和0.1% 甲酸的乙酸铵水溶液为流动相, 并采取梯度洗脱程序。加标样品和标准品的MRM 色谱图示于图4, 从图4 可见,优化后的色谱条件可以将4 种目标物 - 8 - 和基质干扰很好的分开, 获得各组分的良好分离。 ii. 质谱条件 );酸性橙ESI(-);扫描离子化方式:碱性橙、碱性嫩黄，ESI(+ 方式:多反应监测MRM;毛细管电压:3.5 KV;源温度:110 ?;脱溶剂气温度:350 ?;脱溶剂气流量650 L/h。 质谱分析优化参数见表3。 表3 酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量。 化合物 锥孔电压(v) 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量(eV) 酸性橙 20 329.1 155.9 20 127.8* 35 碱性橙 22 213.1 121.1* 20 77 18 碱性嫩黄 25 269.1 148.1* 25 122.0 25 * 为定性离子 酸性橙分子结构中含有羟基基团, 所以电离方式选择负离子电离。在串联四极质谱仪的MS1中对化合物标准进行扫描, 确定分子离子峰丰度最大的条件, 得到酸性橙的母离子m /z 329.1; 在MS2中进行子离子扫描, 改变诱导碰撞能量, 选用丰度较大的2个子离子m /z 155.9和m /z 127.8分别作为定量 - 9 - 离子和辅助定性离子, 优化仪器参数使其在保证分辨率的条件下灵敏度最佳。 同样，根据碱性橙、碱性嫩黄分子结构的特征, 实验选用电喷雾正离子 以流动注射泵连续进样对标准液进行MS1全扫描,找出准( ESI+ ) 电离模式， 确的[ M+ H ] +峰为碰撞诱导解离的母离子, 继续对其子离子进行MS2 全扫描, 找出2-3个信号较强的碎片离子,再以母离子与子离子组成监测离子对, 以多反应监测模式对待测物进行定性和定量检测, 同时优化锥孔电压、碰撞电压、碰撞能量等质谱条件。 6、 检出限 酸性橙7.0μg/kg;碱性橙5.0μg/kg;碱性嫩黄5.0μg/kg。 7、 线性范围 酸性橙线性范围为7.0-500.0μg/kg;碱性橙和碱性嫩黄线性范围为5.0-500.0μg/kg。 8、 准确度、精密度 在样品中加入酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄标准物质，进行准确度与精密度实验，结果为酸性橙回收率为93.5%-111.0%，相对标准偏差为1.46%-7.56%;碱性橙回收率为93.5%-109.0%，相对标准偏差为1.38%-6.42%;碱性嫩黄回收率89.5%-108.0%，相对标准偏差为1.86%-7.91%，实验结果见表4-6。 表4 酸性橙准确度与精密度试验(n=6) RSD(%) 样品 本底值(μμμg/kg) 回收率% 添加量(测定值( g/kg) g/kg) 1 0 20.0 21.9 109.5 7.56 - 10 - 0 20.0 18.7 93.5 0 20.0 21.6 108.0 0 20.0 19.0 95.0 0 20.0 22.2 111.0 0 20.0 19.8 99.0 2 0 160.0 158.3 98.9 1.46 0 160.0 162.5 101.6 0 160.0 157.9 98.7 0 160.0 159.0 99.4 0 160.0 161.6 101.0 0 160.0 163.4 102.1 3 0 320.0 316.3 98.8 1.64 0 320.0 310.5 97.0 0 320.0 312.9 97.8 0 320.0 315.8 98.7 0 320.0 325.7 101.8 0 320.0 316.8 99.0 表5 碱性橙准确度与精密度试验(n=6) RSD(%) 样品 本底值(μμμg/kg) 回收率% 添加量(测定值( g/kg) g/kg) 1 0 20.0 20.6 103.0 6.42 0 20.0 18.9 94.5 0 20.0 18.7 93.5 0 20.0 21.8 109.0 0 20.0 19.0 95.0 0 20.0 18.9 94.5 2 0 160.0 162.4 101.5 1.98 0 160.0 156.7 97.9 0 160.0 158.1 98.8 - 11 - 0 160.0 157.2 98.2 0 160.0 161.9 101.2 0 160.0 164.3 102.7 3 0 320.0 314.2 98.2 1.38 0 320.0 316.1 98.8 0 320.0 323.5 101.1 0 320.0 324.7 101.5 0 320.0 315.8 98.7 0 320.0 317.0 99.1 表4 碱性嫩黄准确度与精密度试验(n=6) RSD(%) 样品 本底值(μμμg/kg) 回收率% 添加量(测定值( g/kg) g/kg) 1 0 20.0 17.9 89.5 7.91 0 20.0 21.2 106.0 0 20.0 18.3 91.5 0 20.0 18.9 94.5 0 20.0 21.6 108.0 0 20.0 20.4 102.0 2 0 160.0 163.2 102.0 2.11 0 160.0 158.9 99.3 0 160.0 156.8 98.0 0 160.0 158.2 98.9 0 160.0 157.7 98.6 0 160.0 165.2 103.2 3 0 320.0 323.4 101.1 1.86 0 320.0 313.9 98.1 0 320.0 310.7 97.1 0 320.0 313.6 98.0 0 320.0 314.8 98.4 - 12 - 0 320.0 325.2 101.6 七、 方法验证 本方法经三个实验室的技术人员进行了方法验证试验。 八、 验证结论 经验证该检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的检测要求，其方法方便、快捷，应推广应用。 九、本标准作为强制性地方标准的建议 通过以上一系列的实验研究，建立了食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄检测方法。该方法准确可靠。建议把《食品安全地方标准食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定 》作为强制性地方标准批准发布。 十、 贯彻标准要求和措施建议 1、技术措施 要求熟练掌握前处理技术，了解仪器性能、原理，且能熟练操作，能对检测结果进行分析。 2、管理措施 本技术标准在实施过程，严格执行检验规范，熟悉检验方法和有关的法规，做到科学、公正、准确、不受其他因素干扰，确保检验结果的准确可靠。 - 13 - 3、实施 3.1 本标准由吉林省卫生厅发布，于xxxx年xx月xx日发布实施，由xxxx行政主管部门负责监督实施。 3.2 该标准被批准后，组织力量，进行宣贯实施，通过该标准的贯彻实施，确保食品安全和保障人体健康等方面将产生巨大的经济效益和社会效益。 十一、参考文献 1、刘华良，荣维广，王连红等. 液相色谱串联质谱法检测鲍鱼汁中的酸性橙?. 中国食品卫生杂志，2010，22(1):16-18. 2、陈春晓，刘红河，仲岳桐等. 食品中酸性橙?的HPLC-MS/MS测定方法研究. 中国卫生检验杂志，2008,18(11):2209-2211. 3、朱海英,李人圭. 丝瓜果实发育中木质素代谢及有关导管分化的生理生化研究. 华东师范大学学报(自然科学版), 1997, 1: 87. 4、苏同福，高玉珍，刘霞等. 木质素的测定方法研究进展. 河南农业大学学报，2007，41(3):356-362. 5、TAPPI Test Method T222om-88,“Acid-insoluble lignin in wood and pulp”, TAPPI Press, Atlanta, GA. 6、Johnson D B, MooreW E, Zank L C. 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