src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF—α[权威资料]

src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF—α[权威资料] src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF—α 本文档格式为WORD,若不是word文档,则说明不是原文档。 最新最全的 学术论文 期刊文献 年终总结 年终报告 个人总结 述职报告 实习报告 单位总结 【摘要】目的 探讨src抑制的蛋白激酶C底物,SSeCKS,对脂多糖,LPS,诱导大鼠肺微血管内皮细胞,PMVEC,分泌肿瘤坏死因子 ,TNF, -α的影响。方法 体外培养Wistar 大鼠PMVEC，按随机数字表法分组,n=4,，10 mg/L LPS刺激1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 或0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS刺激24 h,蛋白激酶C抑制剂,BIM,预处理 0.5 h或50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后再加入10 mg/L LPS孵育24 h，酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α量,ng/L,。采用SPSS10.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P< 0.05为差异具有统计学意义。结果 0.1、1、10 mg/L LPS刺激PMVEC 24 h后的，TNF-α分泌量分别为,253.70 〒 23.55,、,327.88 〒 37.25,、,403.20 〒 36.22, ng/L，均高于未刺激组,82.28 〒 22.56,ng/L,均P=0.000,,10 mg/L LPS刺激PMVEC后，TNF-α分泌量于1 h升高,170.11 〒 49.22,ng/L，6 h达峰值,404.82 〒 13.78,ng/L，刺激24 h后仍维持高水平,395.67 〒 36.23,ng/L，分别与未刺激组,84.60 〒 23.61,ng/L比较:P=0.001，0.000，0.000,BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激，TNF-α分泌量,200.44 〒 27.39,ng/L较LPS单独刺激,402.28 〒 31.07,ng/L显著较少,P=0.000,,与LPS单独刺激比较 ,407.28〒32.64,ng/L，SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后， LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应,195.20〒13.28,ng/L 也显著下降,P=0.000,。结论 下调SSeCKS表达和蛋白激酶 C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应，从而 减轻PMVEC的炎症反应。 【关键词】脂多糖,肺微血管内皮细胞,肿瘤坏死因子,src 抑制的蛋白激酶C底物,蛋白激酶C抑制剂,小分子干扰 RNA,炎症,信号通路 Regulation of src-suppressed C kinase substrate on the expression of TNF-α in endothelial cells YOU Qing-hai， SUN Geng-yun， GAO Lei， YUE Yang， ZHANG Dan. Department of Respiratory Medicine， The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022， China. Corresponding author:SUN Geng-yun，Email: sungengyun@yahoo.com.cn 【Abstract】Objective To study the role of src-suppressed C kinase substrate ,SSeCKS, in the secretion of tumor necrosis factor ,TNF-α, in rat pulmonary micro-vascular endothelial cells ,PMVEC, induced by lipopolysaccharide ,LPS,. Methods Wistar rat PMVEC cultured in vitro were randomly ,random number, divided into several groups ,n = 4, as per exposure to given dosage of LPS for different lengths of time and to different dosages of LPS for given length of time. After PMVEC exposed to 10 mg/L LPS for 1 hour ,h,， 3 h， 6 h， 12 h and 24 h or 0.1 mg/L， 1 mg/L and 10 mg/L LPS for 24 h， the levels of TNF-αin the supernatant of culture medium were examined by the method of enzyme linked immunosorbent assay ,ELISA,. Another PMVEC was pre-treated by protein kinase C ,PKC, inhibitor bis- indolylmaleimide,BIM,for 0.5 h or had the transfection of SSeCKS-specific small interfering RNA ,siRNA, for 48 h before 10 mg/L LPS challenge for 24 h， and subsequently the supernatant was also examined by ELISA. One-way analysis of variance ,ANOVA, was employed for statistical analysis by SPSS version 10.0 to compare values among all groups. A significant difference was presumed as a probability value < 0.05.Results After PMVEC incubated with 0.1 mg/L， 1 mg/L and 10 mg/L LPS for 24 hours， the levels of TNF-αsecreted were ,253.70 〒 23.55,， ,327.88 〒 37.25,， ,403.20 〒 36.22,， respectively， which were higher than that in un-stimulated PMVEC ,82.28 〒 22.56， all P = 0.000,. After 10 mg/L LPS challenge for one hour， the level of TNF-αin the supernatant of PMVEC raised substantially ,170.11 〒 49.22,， peaked at the time of 6 h ,404.82 〒 13.78,， then persisted at a higher level until 24 h ,395.67 〒 36.23, than that in un-stimulated PMVEC ,84.60 〒 23.61， P = 0.001， 0.000， 0.000， respectively,. After PMVEC pre- incubated with BIM， the level of LPS-induced TNF-αdecreased obviously ,200.44 〒 27.39 vs. 402.28 〒 31.07， P = 0.000,.Compared with LPS challenged PMVEC ,407.28 〒 32.64,， depletion of endogenous SSeCKS in PMVEC after inhibited by SSeCKS-siRNA significantly attenuated increase in the level of LPS-induced TNF-α,195.20 〒 13.28， P= 0.000,. Conclusions Down-activation of SSeCKS and PKC can inhibit the secretion of TNF-αin PMVEC induced by LPS， relieving the inflammatory response of PMVEC. 【Key words】Lipopolysaccharide, Pulmonary microvascular endothelial cells, Tumor necrosis factor, Src-suppressed C kinase substrate,Protein kinase C inhibitor,Small interfering ribonucleic acid,Inflammation,Signal pathway 急性肺损伤,acute lung injury， ALI,是失控的系统性炎症反应综合征，肺微血管内皮细胞,pulmonary microvascular endothelial cells， PMVEC,为其主要效应细胞。炎症因子诱导PMVEC通透性增加是ALI发生的关键环节，而被脂多糖,lipopolysaccharide， LPS,激活的PMVEC也分泌多种炎症因子，如肿瘤坏死因子,tumor necrosis factor， TNF,-α、白介素,interleukin， IL,-1β和IL-6等，参与并放大PMVEC局部的炎症反应，但其是否调控PMVEC分泌炎症因子尚未见报道。本研究体外培养大鼠PMVEC，观察SSeCKS是否调控LPS诱导PMVEC分泌TNF-α，探讨SSeCKS参与ALI的机制。 1材料与方法 1.1 主要试剂和仪器 Dulbecco改良Eagle高糖培养基干粉,DMEM,、特级胎牛血清及无酚红、无血清DMEM,美国，Hyclone,,内皮细胞生长辅助因子, 美国，Upstate Biotechnology,,绵羊抗大鼠SSeCKS多克隆抗体、LPS、蛋白激酶C,protein kinase C， PKC,抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺,bis-indolylmaleimide，BIM,和异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素购自美国Sigma 公司,辣根过氧化物酶标记的兔抗绵羊IgG,美国，KPL,。荧光显微镜,Olympus IX-71，日本,,Biometra梯度PCR仪,德国，Whatman,。 1.2 大鼠PMVEC分离培养及鉴定 参考文献[2， 5， 7]方法，用含15 % 胎牛血清,添加75 μg /ml内皮细胞生长辅助因子,的DMEM培养液培养分离的大鼠PMVEC。鉴定用二代细胞:细胞爬片3 , 6 h后、固定、与25 μg/ml异硫氰酸荧光素标记的植物凝集反应40 min，荧光显微镜观察。 1.3 SSeCKS-siRNA转染PMVEC 参考文献[2，8]，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成大鼠SSeCKS,No.AY695056,特异性小分子干扰RNA,small interfering ribonucleic acid，siRNA,双链:正义链5’-CCGAGUAGAGAAGAAUCUUtt-3’，反义链5’- AAGAUUCUUCUCUACUCGGtt-3’。普通阴性对照序列:正义链5’-AGACACUGGUUGACAAGAUtt-3’，反义链5’-AUCUUGUCAACCAGUGUCUtt-3’。转染步骤参考文献[2]。 1.4 实验分组 实验用三代细胞。?时、效量效关系:0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS分别孵育PMVEC 24 h,10 mg/L LPS孵育细胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h。未刺激组:加入无酚红培养基维持24 h,?PKC抑制剂干预:10 μmol/L BIM预处理PMVEC 0.5 h后加入10 mg/L LPS刺激24 h，设BIM、10 mg/L LPS单独刺激以及未刺激为对照,?siRNA转染:终浓度50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后加入10 mg/L LPS孵育24 h，设脂质体2000空转染、普通阴性对照siRNA转染、LPS单独刺激和LPS + 普通阴性对照siRNA转染为对照。 1.5 指标检测 1.5.1 逆转录聚合酶联反应,reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR,检测 mRNA表达 大鼠SSeCKS、β-actin引物序列合成及实验方法按参考文献[2， 5]进行。 1.5.2 Western blot法检测蛋白表达实验方法按参照文献[2， 5 ]进行。 1.5.3 酶联免疫吸附法,enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA, 检测TNF-α量提取细胞培养上清，按试剂盒说明书,R D Systems，美国,采用双夹心ELISA检测，酶标仪,ELx808，美国，Bio-TEK,于450 nm 处检测吸光度。 1.6 统计学方法 数据以均数〒差,x〒s,表示，采用SPSS 10.0 软件进行单因素方差分析或配对t检，以P< 0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 PMVEC 体外培养与鉴定 体外培养的高纯度PMVEC特征与文献[2， 5， 7 ]报道一致:原代大鼠PMVEC形态呈梭形或多边形，大小均匀，胞核清晰，单层汇合时呈鹅卵石镶嵌排列,图1A,, FITC-BSI与PMVEC结合呈明亮的黄绿色荧光,图1B,。 2.2 SSeCKS-siRNA 转染对PMVEC中SSeCKS表达的影响 50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后，RT-PCR和Western法分析SSeCKS基因和蛋白表达,n=4,:SSeCKS-siRNA转染后SSeCKS基因的表达水平约为未处理组的50%,图2A,,SSeCKS蛋白表达也显著下降，与未处理组比较:P=0.003,图2B,。You等的研究已明确脂质体2000空转染和普通阴性对照siRNA转染对SSeCKS基因和蛋白表达均无显著影响。 2.3 LPS 对PMVEC分泌TNF-α 的影响 0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS分别刺激大鼠PMVEC 24 h，细胞培养上清中的TNF-α量随LPS浓度增加而升高,表1,，与未刺激组比较，P值均为0.000,随刺激时间延长，PMVEC分泌TNF-α量逐渐升高:与未刺激组比较，LPS刺激1 h后TNF-α量开始上升,P=0.001,，6 h达峰值 ,P=0.000,，刺激后24 h后仍维持高水平,P=0.000,，见表2。 2.4 PKC抑制剂对LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的影响 10 μmol/L BIM预处理大鼠PMVEC 0.5 h后， 10 mg/L LPS孵育24 h，LPS诱导PMVEC分泌 TNF-α 的效应被BIM显著抑制,LPS+BIM组与LPS单独刺激组比较:P=0.000。BIM单独作用不影响PMVEC分泌TNF-α,与未刺激组比较:P=0.674,。见表3 2.5 SSeCKS对LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的影响 见表4， 50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC后，再给予10mg/L LPS孵育24 h， ELISA法分析细胞培养上清:SSeCKS-siRNA转染+LPS刺激组的TNF-α 量较LPS单独刺激组的TNF-α量显著减少,P=0.000,,普通阴性对照转染+LPS刺激组与LPS单独刺激组比较:P=0.671。脂质体2000空转染组和普通阴性siRNA转染组与未刺激组比较，P值分别为0.879和0.965。 3 讨论 TNF-α作为诱导炎症反应的最初因子，能在细胞和亚细胞水平上激发一系列级联反应，如诱导IL-6和IL-1等炎症因子表达上调,其次，TNF-α诱导PMVEC骨架重构和细胞间缝隙形成，导致细胞通透性增加，进而形成肺水肿,此外，TNF-α还能通过激活炎症细胞，上调黏附分子和氧自由基等。所以本实 验选择PMVEC分泌TNF-α作为着力点，探讨ALI的发生机制。 课题组体内研究证实LPS性ALI大鼠肺内炎症细胞聚集、肺水肿形成，因此寻找新的抗炎靶点将是今后的研究热点。 研究发现PMVEC存在支架蛋白——SSeCKS，LPS上调PMVEC表达SSeCKS。因细胞存在异质性，在PMVEC，SSeCKS是否参与TNF-α的分泌调控尚未研究。近年来，siRNA干扰以其快速、简便、高效地抑制靶基因表达倍受关注，特别是用来分析细胞信号转导通路。本研究在明确SSeCKS-siRNA能有效抑制PMVEC表达SSeCKS后，采用该技术证实:抑制SSeCKS表达可显著下调LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应，进一步研究发现，PKC特异性抑制剂也可下调LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应。因此，笔者推测SSeCKS通过以下途径参与LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的调控:?SSeCKS作为PKC信号通路下游的效应分子，通过PKC-SSeCKS信号通路启动PMVEC分泌TNF-α,?SSeCKS作为锚定蛋白，改变PKC或蛋白激酶A活性，进而调控PMVEC分泌TNF-α。 总之，SSeCKS除了与丝状肌动蛋白关联，进而调控PMVEC通透性外，而SSeCKS可辅助信号转导相关酶在时间和空间上的协调，所以阻断SSeCKS表达或下调其活性，可达到减轻炎症反应、阻断恶性循环的目的，为治疗ALI提供新思路。 参考文献 [1]Catravas JD， Snead C， Dimitropoulou C， et al. 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