Schwann细胞对大鼠坐骨神经缺损后脊髓前角运动神经元保护作用观察

Schwann细胞对大鼠坐骨神经缺损后脊髓前角运动神经元保护作用观察 Schwann细胞对大鼠坐骨神经缺损后脊髓 前角运动神经元保护作用观察 山东医药2011年第5l卷第1O期 Schwann细胞对大鼠坐骨神经缺损后 脊髓前角运动神经元保护作用观察 董玉珍,段永壮?,梁秋冬.许大勇 (1新乡医学院第一附属医院,河南卫辉453100,2郑州大学第一附属医院) 摘要:目的观察Schwann细胞(sc)脊髓内移植对大鼠坐骨神经缺损后脊髓前角运动神经元的保护作用并探 讨机制.方法取2d龄sD大鼠坐骨神经培养,纯化,传代sc,并行纯度鉴定.另取48只sD大鼠制作坐骨神经 缺损模型,随机均分为实验组和对照组.实验组大鼠于脊髓腹角注射SC;对照组给予等量生理盐水.两组分别于 术后1,4,8周各取8只大鼠,取L4一段脊髓,观察运动神经元数目并计算存活百分率,电子显微镜下观察神经元的 超微结构.结果sc经培养纯化后纯度为95.6%?2.5%.实验组伤侧神经元数目较对照组明显增加,运动神经 元存活率为87.2%?4.6%,高于对照组的58.4%-+5.4%(P<0.01).实验组神经元细胞器及大部分神经纤维的 髓鞘结构较对照组清晰完整.结论sc对大鼠坐骨神经缺损后的脊髓前角运动神经元具有保护作用,其机制可 能是促进脊髓运动神经元的存活和再生. 关键词:雪旺细胞;细胞移植;坐骨神经缺损;脊髓前角神经元 中图分类号:R651.2文献标志码:A文章编号:1002-266X(2011)10-0015-02 ProtectiveeffectofSchwanncellsonm~oneuronsinventraIhornofthespinalc0rd DONGYu-zhen1,DUANYong—zhuang,HANGQiu—dong,xuDa—yong (1FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedwalCollege,舰u453100,P.R.China) Abstract:0bjL~'tiveToobservetheprotectiveeffectofSchawanncells(SC)spinaltransplantontheregenerationof motoneuronsinventralhornaftersciaticnervedefectanddiscussitsactionmechanism.MethodsTheprimarySCwere cultured,purifiedandpassagedfromsciaticne~esof2dyoungSDrat.andtheirpuritywerecalculated.48adultratsof sciaticnervedefectmodelwererandomlydividedintoexperimentalgroupandcontrolgroup.After1,4,8week,the8rats wereremovedL46spinalcordandsurveyedthenumbersofregenerationmotoneuronsandsurvivalpercentagerespectively. Neumnuhrastructurewasobservedbyelectronmicroscopy.ResultseSCofdegreeofpuritywas95.6%?2.5%after culturedandpurified.ThenumbersofregeneratingmotoneuronsinexperimentalgroupWashigherthanthatincontrol group.Themotoneuronssurvivalpercentagewas87.2%-+4.6%inexperimentalgroup.whichWashigherthan58.4%? 5.4%incontrolgroup(P<0.01).Theorganelleandmyelinsheathofnervefibersofthespinalcordneuronsbyelectron microscopyinexperimentalgroupweremoreclearandorderthancontrolgroup.ConclusionsSCtransplantioncanprotect motoneuronsinventralhornofthespinalcordaftersciaticnervedefect.Themechanismmaybepromotingthesurvivaland regenerationabilityofmotoneurons. Keywords:Schwanncells:transplantcells;nervei~uu;motoneumns Schwann细胞(SC)是中枢和周围神经的主要结 构和功能细胞….周围神经损伤后逆向运输的sc 和神经营养因子缺乏是造成运动神经元死亡的主要 原因.2010年3,10月,本实验将SC移植到大鼠 坐骨神经缺损后的脊髓内,研究其对脊髓前角运动 神经元的保护作用和机制.现报告如下. 1材料与方法 1.1实验动物,试剂和仪器健康sD大鼠5O只, 基金项目:河南省高校科技创新团队支持计划(2010A3200l0). 通讯作者 包括2d龄幼鼠2只,体质量80—100g,成年雄性 大鼠48只,体质量200,220g.胰蛋白酶,胶原蛋 白酶,透明质酸酶;S一100,ABC试剂盒,甲苯胺蓝染 色试剂盒,兔抗大鼠低亲和力神经生长因子受体 p75抗体(NGFRp75)细胞免疫组化染色,免疫荧光 试剂盒;DMSL1000光镜,Tiger图像系统,荧光 显微镜,倒置相差显微镜,透射电子显微镜. 1.2SC的培养,纯化,传代及鉴定取2只幼鼠, 腹腔注射麻醉,切取双侧坐骨神经,置入含双抗的无 血清DMEM/F12培养,清洗,去膜,剪碎,纯化,1:3 15 传代.取第3代SC.培养24h,1,3,6,9d用倒置 显微镜观察,常规NGFRp75免疫荧光染色鉴定,随 机选1O个视野计数SC阳性细胞并计算纯度. 1.3实验动物分组取48只成年雄性sD大鼠, 腹腔注射麻醉,l6倍显微镜下显露右侧坐骨神经, 于梨状肌下孔0.5cm切断,去除坐骨神经1inm建 立坐骨神经缺损模型.随机均分为实验组和对照 组.实验组及对照组分别将3x10爪/培养瓶的 sC和生理盐水各2l注射于大鼠L4与L5之间 的脊髓腹角两点,注射深度为1.5mm.常规饲养. 1.4脊髓前角运动神经元观察两组于术后1,4, 8周各取8只大鼠,腹腔麻醉下开胸取L4,节段脊 髓,置40C,25%蔗糖PBS溶液中过夜.待组织沉 底后行冰冻切片,片厚20iarn,每切5张留取2张 (两组各留l6张).采用1%甲苯胺蓝行神经元尼 氏染色后光镜观察,采集图像,计数双侧能辨认出细 胞核的脊髓前角运动神经元.神经缺损侧与健侧运 动神经元数目比值为运动神经元存活率,求平均值. 透射电镜下观察脊髓前角运动神经元超微结构. 1.5统计学方法采用SPSS12.0统计软件.数据 以戈4-s表示,组间比较采用t检验.P?0.05为差 异有统计学意义. 2结果 2.1不同培养时点的sc形态学,纯度情况sc在 纯化24h后生长,胞体呈圆形或椭圆形,未见或少 见突起生长;培养6,9d后,细胞多呈双极形或梭 形,少量呈多极形或椭圆形,细胞突起细长,可见少 量成纤维细胞生长.SC细胞膜棕色深染,胞体清 晰,呈梭形或三角形,成纤维细胞仅胞核深染,胞膜 不着色.SC纯度为95.6%4-2.5%. 2.2两组术后各时点脊髓运动神经元数目及形态 比较术后1,2周两组脊髓前角运动神经元数目差 别不明显;术后4周实验组神经元数目多于对照组, 但不明显;术后8周对照组伤侧神经元数目为 (10.264-4.42)个,运动神经元存活率为58.4%4- 5.4%.实验组分别为(29.65士7.53)个和87.2% 4-4.6%.两组运动神经元存活率相比,P<0.01. 术后8周,对照组电镜下多数神经元出现胞核变形, 胞质内出现空泡,细胞器数量减少,髓鞘严重变形. 实验组神经元胞核较规则,核膜较清晰,胞质中细胞 器数量较多,较清晰,神经纤维及髓鞘规则. 3讨论 周围神经损伤后发生逆向运输障碍可致脊髓神 经元急性坏死,相应节段脊髓运动神经元可因神经 轴突损伤变性及缺乏靶器官来源的神经营养因子 16 山东医药2011年第5l卷第1O期 等,发生Waller变性和逆行性退变进而坏死. sc是构成有髓神经纤维的髓鞘和无髓神经束 膜的主要成分,其分泌的营养因子能防止周围神经 损伤后神经元逆行性死亡,引导和促进轴突再生和 髓鞘形成.SC的分泌活动有时效局限性'4J.周围 神经损伤后,轴索和髓鞘完全崩解,SC大量分裂增 殖形成Bunger带,引导再生轴突生长.研究证实, 脊髓损伤后SC可再生进入脊髓,与神经元细胞建 立进一步功能联系,在神经元细胞膜上表达多种神 经生长因子和营养因子,创造了神经元再生的微环 境】.有学者l6研究发现,SC能通过调节内源性凋 亡信号通路抑制6一羟多巴胺诱导的神经细胞凋亡. 此外,sc能通过分泌因子激活Notch信号通路,刺 激神经前体细胞增殖并抑制其分化.sc分泌的可 溶性蛋白可能参与了脊髓损伤修复过程川. 坐骨神经损伤后的轴突再生是一个动态过程, 最早的轴突再生发生在损伤后6hJ.本实验在损 伤大鼠坐骨神经后立即注入sC,为脊髓中枢神经元 和轴突再生提供条件.研究结果显示,术后4周实 验组即可观察到脊髓前角运动神经元数目增加,术 后8周运动神经元存活率高于对照组,且电镜下细 胞器及髓鞘结构较对照组清晰完整.提示SC对大 鼠坐骨神经缺损后的脊髓前角运动神经元具有保护 作用,其机制可能是分泌神经营养因子,再造神经元 再生的微环境,促进神经元存活和再生. 参考文献: [1]SvarenJ,MeijerD.Themolecularmachineryofmyelingenel~an- scripfioninSchwannceUs[J].Glia,2008,56(14):1541—1551. 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