牙种植体周围骨组织内神经纤维再生的组织病理学研究

牙种植体周围骨组织内神经纤维再生的组织病理学研究 牙种植体周围骨组织内神经纤维再生的组 织病理学研究 5 摘要:目的:通过组织病理学的研究，观察分析骨感知现象的形态学基础。方法:建立 牙种植体的动物研究模型，处死动物后取材，将标本脱钙后把种植体旋出，保存其周围骨组 10 织界面。常规石蜡包埋、切片，切片采用免疫组织化学方法对神经丝蛋白(neurofilament protein，NFP)进行特异性染色，采用光学显微镜对标本进行观察。结果: 种植体螺纹区 周围骨组织内存在直径较大的神经纤维束;即刻种植的种植体，周围板层骨致密，但 NFP 阳性神经纤维束较少; 延期种植的种植体，周围板层骨较薄，NFP 阳性神经纤维束较多; 随着种植修复体负重时间的延长，种植体周围的 NFP 阳性神经纤维束有增多趋势;休眠种 15 植体周围板层骨薄，NFP 阳性神经纤维束较少。结论:种植体骨感知现象存在组织形态学 基础，但影响因素有待进一步研究。 关键词:牙种植体，骨感知，神经 Electrophysiological study of peripheral neurophysiologic 20 mechanism in osseoperception phenomena Zhu Yibo1, Lin Ye2 (1. the 4th clinical division, peking university school and hospital of stomatology; 2. Department of implalntology, peking university school and hospital of stomatology) 25 Abstract: Objective: the histological study was carried out in this research to identify the existence of peri-implant neuroreceptor. The possible factors influencing peri-implant neural feedback pathway reconstruction were also discussed. Methods: The specimens of this study were taken from the beagle dog’s modles established before. After decalcification, implants were taken out carefully, and then the specimens were embedded and made sections in routin procedure. The 30 sections were stained with immunohistological methords (neurofilament protein，NFP). Results: Findings under the light microscope were as follow: The existence of NFP positive nerve fibers in the peri-implant bone tissue can be confirmed but the functions of these nerve fibers need to be further studied. In the immediate implant placement group, thick lamellar bone but less nerve fibers were observed. In the delayed implant placement group, thiner lamellar bone but more 35 nerve fibers were observed. Dental implant osseointergration and peri-implant nerve fiber regeneration seems to be improved as the loading time increase. In the unloaded implant group, implants, few nerve fibers were observed. Conclusion: peri-implant neuroreceptor can be identified but the influnce factors should be further studied. Key words: Dental implant, Osseoperception, Nerve 40 0. 引言 口腔种植修复四十余年来已在世界范围内成功的应用于单牙、多牙缺失以及无牙颌的 修复治疗。改变了传统口腔修复学的理念和模式，成为缺牙修复的首选治疗方法，丰富了口 腔医学的内涵。 -1- 然而长期以来国际上曾普遍认为口腔种植体与人体之间仅为生物机械性结合，种植体 周围没有牙周本体感受器，没有感知能力，因此在种植修复设计上给予了保护性调整。但是， 45 在长期的临床实践中人们发现，患者对牙种植修复体有良好的触觉及定位能力,患者的咀嚼 行为、最大咬合力控制、肌肉协调性、定位能力等方面与天然牙非常接近。现代口腔种植学 之父PI Brånemark教授结合了自己三十余年的临床经验和大量的病例观察，于上世纪九十年 代提出了“骨感知(osseoperception)”的概念，这是指种植修复患者在缺乏功能性牙周本体 感受器传入的情况下对于种植体的感知，并通过种植体确认口腔运动觉的能力。骨感知这一 50 全新概念的提出，将口腔种植学的研究提升到了一个新的高度，这意味着口腔种植体与人体 之间可能不单纯是生物机械性的结合，同时亦存在着神经生理性结合的可能。若能证实这种 神经生理性结合的存在，将极大的改变口腔种植学现有的治疗理念;对于骨感知机制的研究 可能将进一步提升口腔种植修复对于缺牙患者口腔生理功能的恢复。 骨感知的研究主要可以分为中枢神经系统机制和外周神经机制两大方面。本研究重点 55 旨在探索骨感知外周神经机制及其影响因素。利用免疫组织化学和组织病理学方法，观察骨 感知现象的形态学基础，探讨种植手术方式以及负重时间对于种植体周围神经纤维再生的影 响。 1. 研究模型的建立 1.1 实验对象 60 选用比格犬3只(北京玛斯生物技术有限公司，生产许可证号:SCXK(京)2007-0005)， 2年龄，体重11.5,12.2公斤。经专业饲养场兽医体检身体健康。 1.2 麻醉方法 戊巴比妥钠以30 mg/ kg 体重静脉注射，行全身麻醉。 1.3 实验程序 65 1.3.1 全麻起效后，行气管插管，防止因误吸而发生的麻醉意外，常规消毒铺巾，局部 给予阿替卡因(必兰)1.7 ml行浸润麻醉。 1.3.2 使用种植机以细裂钻将双侧下颌第四前磨牙和第一磨牙近远中牙根截开后，分别 微创拔除，同时注意保护牙槽窝骨板。 1.3.3 愈合2个月后，同样方法微创拔除双侧下颌第二、三前磨牙。在新鲜的拔牙窝内 70 即刻植入4颗种植体(3.5×8-mm ,Noble Biocare Replace, Göteborg, Sweden);同时于双侧下 颌第四前磨牙和第一磨牙的缺牙位置植入5颗种植体(3.5×8-mm ,Noble Biocare Replace, Göteborg, Sweden)。所有种植体植入时的扭矩均大于35N.cm。 1.3.4 双侧下颌第三、四前磨牙位置的4颗种植体在种植体植入手术同时连接转移杆 75 (图7)，通过预先制作的个别托盘，全麻下取下颌印模。灌制石膏模型后，使用金塑基台 制作镍铬合金金属全冠，通过纵向螺栓以25 N.cm扭矩锁紧基台，使用自凝树脂将咬合面的 纵向螺栓孔封闭。最终修复体在术后一月内完成，负重6个月。 1.3.5 双侧下颌第二前磨牙、第一磨牙位置的4颗种植体采用埋入式植入法，连接愈合 帽后将粘膜严密缝合。种植体愈合3个月后，全麻下行二期手术，切开粘膜，暴露种植体， 取下愈合帽后直接连接转移杆，通过个别托盘制取印模，再完成最终的纵向螺栓固位金属全 80 冠修复，负重3个月。 -2- 1.3.6 左侧下颌最远中植入的1颗种植体一直未暴露，亦未修复，作为休眠种植体。 1.4 实验分组 将3只动物植入的27颗种植体分为5个不同的实验组，休眠种植体为3颗，其余4组每组6 颗种植体。 85 即刻种植、延期负重组，负重时间3个月; 即刻种植、早期负重组，负重时间6个月; 延期种植、早期负重组，负重时间6个月; 延期种植、延期负重组，负重时间3个月; 休眠种植体，延期种植，未负重。 90 2. 组织学研究 2.1 标本的取材 将实验比格犬麻醉，方法同本研究一。将带有种植体的下颌骨周围粘膜、骨膜以 及肌肉附着完全剥离，以裂钻将带有种植体的下颌骨块截断。取下的标本立即置于10%中性 小时后，将标本按每种植体周围带有2mm骨组织为，分割成较 福尔马林溶液内，固定2495 小的骨块，继续固定24小时。 2.2 动物的处死 完成取材后，于比格犬后腿内侧可触及股动脉搏动处，横行切开皮肤、皮下组织，分 离出股动脉，切断股动脉放血致死。 2.3 标本的脱钙 100 标本固定完成后，在大量流动自来水下冲洗，在磷酸盐缓冲液内浸泡12小时，以尽量 去除组织中的甲醛。然后将标本置于10%硝酸内，脱钙24小时。 2.4 标本的分切 脱钙处理完成后，将种植体小心的从骨组织中旋出，以保存骨组织内螺纹的完整。每 块标本沿种植体长轴、近远中方向分切为大小相等的两块组织。 105 2.5 标本的脱水、包埋和切片 以酒精逐级脱水，行常规石蜡包埋，切片厚度为5μm。每块组织连续切片10张，抽取3 张做免疫组织化学染色，3张做HE染色。 2.6 切片的免疫组织化学染色 一 抗 为 小 鼠 单 克 隆 抗 体 ( mouse monoclonal ( NF-01 ) 200kD neurofilament 110 heavy-neuronal marker, Code No. ab7795 , Abcam Co. Cambridge, UK);工作液为通用SP试剂 盒(SP-9000，中衫金桥生物技术有限公司，北京) 2.6.1 二甲苯脱蜡5分钟×3次 2.6.2 乙醇逐级脱水5分钟×3次 2.6.3 流动水冲洗 115 2.6.4 3%H2O2 封闭10分钟 2.6.5 水洗2分钟×3次 -3- 2.6.6 磷酸盐缓冲液洗5分钟×3次 2.6.7 血清封闭10分钟后擦干 120 2.6.8 加入一抗(4摄氏度下过夜) 2.6.9 磷酸盐缓冲液滴洗5分钟×3次 2.6.10 加入二抗(室温下反应30分钟) 2.6.11 磷酸盐缓冲液洗5分钟×3次 2.6.12 加入三抗(室温下反应20分钟) 2.6.13 DAB法显色，显微镜下控制染色，水洗终止 125 2.6.14 苏木素复染后入水 2.6.15 1%盐酸+70%酒精分色 2.6.16 1%氨水返蓝后入水 2.6.17 梯度酒精脱水 2.6.18 二甲苯透明 130 2.6.19 加胶封片 2.7 切片的HE染色 2.7.1 二甲苯脱蜡5分钟×3次 2.7.2 乙醇逐级脱水5分钟×3次 2.7.3 流动水冲洗 135 2.7.4 1%盐酸+70%酒精分色 2.7.5 1%氨水返蓝后入水 2.7.6 苏木素-伊红(HE)染色 2.7.7 梯度酒精脱水 2.7.8 二甲苯透明 140 2.7.9 加胶封片 3.结果 3.1 免疫组织化学染色结果 3.1.1 即刻种植、延期负重组(负重时间3个月):种植体螺纹区的界面直接与骨组织 相接触，其间没有任何软组织长入，种植体被成熟的板层骨包绕，骨结合良好，骨组织呈淡 145 紫色;螺纹区内的骨质较为致密，板层骨较厚，形成较为成熟的哈弗氏系统;在种植体螺纹 区内可见神经丝蛋白(neurofilament protein，NFP)阳性着色处呈深褐色，数量较少，不与 种植体表面直接接触;但是由于其周围组织在制片、染色处理过程中脱离较严重，尚不足以 确定该处为特异性着色，不能确定种植体周围螺纹区骨组织内存在神经纤维(图1)。 -4- 150 负重时间 3 个月:种植体螺纹区的界面直接与骨组织相接触，种植体被成熟的板层骨包绕，骨结合良好， 骨组织呈淡紫色;在种植体螺纹区内可见 NFP 着色阳性处呈深褐色。(NFP 免疫组化染色，×100，) 即刻种植、延期负重组 图1 Fig. 1 immediate implant placement, delay loading group 155 3.1.2 即刻种植、早期负重组(负重时间6个月):种植体螺纹区的界面直接与骨组织 相接触，其间没有任何软组织长入，种植体被成熟的板层骨包绕，骨结合良好，骨组织呈淡 紫色;螺纹区内的骨质非常致密，板层骨很厚，形成成熟的哈弗氏系统;在种植体螺纹区内 偶见NFP阳性着色处，数量极少，不与种植体表面直接接触;但是由于其周围组织在制片、 染色处理过程中脱离较严重，亦不足以确定该处为特异性着色，不能确定种植体周围螺纹区 160 骨组织内存在神经纤维(图2)。 -5- 负重时间6个月:在种植体螺纹区内可见NFP着色阳性处呈深褐色，由于其周围组织在脱离较严重，尚不能 确定该处为特异性着色(NFP免疫组化染色，×200) 图 2 即刻种植、早期负重组 165 Fig. 2 immediate implant placement, early loading group 3.1.3 延期种植、早期负重组(负重时间6个月):种植体螺纹区的界面直接与骨组织 相接触，其间没有任何软组织长入，种植体被成熟的板层骨包绕，骨结合良好，骨组织呈淡 170 紫色;螺纹区内的骨质较为致密，板层骨较厚，形成较为成熟的哈弗氏系统;在种植体螺纹 区内除了可观察到与前两组相似的NFP阳性着色处之外，在种植体靠近根方的螺纹区骨组织 内还可以观察到较为粗大的神经束横断面，并与种植体表面直接接触，神经鞘膜基本完整， 鞘膜间隔将其分为更小的神经束，神经元纤维分布较为密集，多为圆形或椭圆形，NFP阳性 着色极为显著，还可见典型“猫眼样”结构(图3)。 175 -6- 负重时间 6 个月:神经束神经鞘膜基本完整，鞘膜内又分为更小的神经束，神经元纤维分布较为密集，多 为圆形或椭圆形，NFP 阳性着色极为显著，还可见典型“猫眼样”结构(NFP 免疫组化染色，×200) 图 3 延期种植、早期负重组 Fig. 3 delay implant placement, early loading group 180 3.1.4 延期种植、延期负重组(负重时间3个月):种植体螺纹区的界面直接与骨组织 相接触，种植体大部分被成熟的板层骨包绕，骨组织呈淡紫色，大部分种植体表面与骨髓腔 接触，可见较多的脂肪空泡;螺纹区内的骨质较为疏松，板层骨薄，骨髓腔隙较大，其内可 见大量的脂肪空泡;在种植体螺纹区骨组织内可以观察到较为粗大的神经束横断面，组织形 185 态与延期种植、早期负重组所观察到的神经束相近，但是数量更多(图4)。 -7- 负重时间 6 个月:神经束横断面 NFP 阳性神经纤维十分密集( NFP 免疫组化染色，×200) 图 4 延期种植、延期负重组 Fig. 4 delay implant placement, delay loading group 190 3.1.5 休眠种植体:种植体螺纹区的界面直接与骨组织相接触，种植体一部分被成熟的 板层骨包绕，骨组织呈淡紫色，另一部分种植体表面与骨髓腔接触，可见较多的脂肪空泡; 螺纹区内的骨质非常疏松，板层骨薄，骨髓腔隙较大，其内可见大量的脂肪空泡;在种植体 螺纹区骨组织内可以观察到较为粗大的神经束横断面，组织形态与延期种植、早期负重组所 195 观察到的神经束相近，但是数量较少(图5)。 -8- 种植体部分界面直接与骨组织相接触;螺纹区内的骨质非常疏松，板层骨薄，骨髓腔隙较大，其内可见大 量的脂肪空泡(NFP 免疫组化染色，×100) 图 5 非负重组 200 Fig. 5 unloading group 4. 讨论 延期植入的种植体周围以及非负重种植体周围均观察到了直径较粗、带有神经 膜的神经纤维束，在其横断面可见密集的NFP阳性着色神经轴突，呈圆形或椭圆形，轴突外 周有髓鞘，其外有完整的神经膜。该神经纤维束位于种植体螺纹区骨组织的髓腔内、临近种 205 植体界面的螺纹处、甚至直接与种植体界面相接触。在以往的研究报道中，认为NFP阳性神 经末梢是种植体周围唯一的神经组织[1-4]，尚未见文献报道在种植体周围存在这种类型的神 经纤维束。Wada等[1]研究发现种植体负重3个月后与非负重种植体相比，种植体周围神经末 梢密度增加，认为种植体负重后可能会促进其周围神经末梢的再生。但是本研究中即刻种植、 早期负重组种植体和即刻种植、延期负重组种植体周围没有发现NFP阳性神经纤维，这与 210 Wada的研究结果不一致，进一步分析可以发现本研究中观察到的这种粗大的、带有神经膜 的神经纤维束需要较大空间，多位于骨髓腔隙内，而即刻种植的种植体骨结合情况较好，骨 髓腔隙很少，因此很难提供神经束所需的空间，推测神经纤维的再生很可能与骨结合的程度 成反比。Wang等[3]将杂种犬下颌牙齿拔除后，植入不同表面结构的种植体，愈合3个月后取 样进行组织病理切片观察发现，种植体周围的神经纤维密度与种植体的骨结合率成反比，但 215 是在Wang的实验中，所有种植体均没有进行负重，因此没有讨论种植体负重与神经再生的 关系。本研究的延期种植、早期负重组和延期种植、延期负重组中的种植体周围NFP阳性神 经纤维束的数量较多，非负重组NFP阳性神经纤维束数量较少。综合本研究的观察结果，推 测延期种植手术植入的种植体，其周围骨髓腔隙较大，可以为神经纤维束的再生提供所需的 -9- 空间和时间，可能导致周围再生神经数量的增加;而种植体负重后神经纤维再生增加，推测 220 骨改建的过程可能与神经再生相关。 周围神经损伤后远侧段神经纤维的全长直至其终末都发生Waller溃变，近侧段神经纤维 以及胞体也会发生不同程度的逆行性变化，在神经元胞体没有死亡的情况下损伤的周围神经 能够再生，断端远侧和近侧的雪旺细胞增殖迁移，但以从远侧断端增殖迁移为主，形成雪旺 细胞索，提供引导再生轴突支芽沿一定方向生长，神经元胞体合成新的蛋白质和其他产物向 225 轴突输送，在近侧段轴突末端的回缩球表面长出许多新手的轴突支芽，此现象称为终端再生。 除此之外，临近的正常神经组织也同时发生反应，可以长出侧支进入受损纤维的神经膜管内， 此现象称为侧支神经再生、侧支发芽或终末前轴突发芽[5]。Hansen等[6]对于拔牙后牙槽窝 内神经再生情况进行了研究，发现拔牙后2天，牙槽窝愈合过程中神经轴突开始再生，而拔 牙后4个月时又出现了神经的退行性变，最终形成微小的创伤性神经瘤。Mason等[7]研究发 230 现，拔牙后牙槽窝有神经纤维的再生，创伤和炎症反应抑制了神经纤维的再生。本研究中各 实验组种植体植入时的环境是不同的:拔牙后即刻植入种植体，牙槽窝内原有牙周膜的神经 纤维受到了严重的破坏，神经纤维的靶细胞和远侧段均被破坏，近侧端神经再生后若没有准 确达到正确的靶细胞位置，最终仍会溃变消失;而对于拔牙后延期植入种植体而言，牙槽窝 内神经再生和骨的改建已经基本完成，手术相当于将周围神经切断，形成了远侧段神经纤维 235 和近侧段神经纤维，更有利于神经纤维的再生。从这方面分析，延期种植手术方式可能更有 利于种植体周围神经纤维的再生。 成年骨的骨组织几乎均为板层骨，按骨板的排列形式和空间结构分为密质骨和松质骨。 密质骨的骨板排列十分规律，所有的骨板均紧密结合，仅在一些部位留下血管和神经的通道; 松质骨位于骨的深部，由许多骨小梁构成，而由骨板不甚规律构成的骨小梁相互连接，搭成 240 网眼，其间充以骨髓、神经和丰富的血管等[5]。种植体植入下颌骨后，从冠方至根方依次 与密质骨、松质骨和骨髓腔相接触，而种植体负重后其周围接触的骨组织发生改建，最终种 植体大部分被密质骨所包绕，而种植体直接接触的密质骨比例越高，意味着种植体的骨结合 越好，改良的种植体表面结构可以促进这种改建的过程，增加种植体的骨结合率[8]。本实 验不同实验组种植体的所观察到的骨结合情况不尽相同。总体上负重的种植体骨结合情况好 245 于非负重的种植体，负重时间为6个月的种植体骨结合情况好于负重时间为3个月的种植体， 早期负重的种植体骨结合情况好于延期负重的种植体，即刻种植体的种植体骨结合情况好于 延期种植的种植体。 本研究共植入27颗种植体，按照手术方式和负重时间分为5个实验组，所有的种植体周 围都可见如Wada等[1]描述的NFP阳性神经末梢样结构，但是由于制片过程中软硬组织物理 250 性质的差异，导致神经周围的软组织脱失较为严重，尚不能仅凭光学显微镜下观察结果确定 该结构为神经末梢。另外Wada等[1]曾定量的分析了负重种植体与非负重种植体周围神经纤 维密度，结果分别为0.07%和0.04%，认为结果的差异有统计学意义，负重后种植体周围神 经末梢增加。但是从其统计结果可以看出种植体周围神经末梢的数量极少，而且由于组织包 埋切片和染色过程中很难将种植体螺纹区的骨组织、骨髓腔内的结缔组织以及神经组织同时 255 完整的保存下来，造成了不同切片之间出现的差异有一定偶然性，这容易造成统计中的混杂 因素，使结果出现偏倚，故本研究没有定量的分析不同组种植体骨结合率以及神经纤维密度， 而是做了定性的描述性分析。Wada等[1]认为NFP阳性神经末梢是种植体周围唯一的神经组 织并推测该神经末梢可能具有牙周膜内本体感受器的功能，但多数学者认为这种神经末梢样 结构的功能还不能确定[2,3]。本研究中观察到的这种粗大的、带有神经膜的神经纤维束究竟 260 - 10 - 具有何种功能，还有待进一步的研究。 5. 结论 5.1 本研究中观察到种植体周围螺纹区骨组织内存在直径较粗的NFP阳性神经纤维束， 不同于以往文献所报道的NFP阳性神经末梢样结构，但是其具体功能尚待进一步研究。 延期种植的种植体，其周围板层骨相对较薄，骨髓腔间隙较大，但神经纤维数量 265 5.2 较多。 5.3 即刻种植的种植体，其骨结合更为完全，周围板层骨更致密，但神经纤数量较少。 随着负重时间的延长，种植体的骨结合更为完全，周围板层骨更致密，神经纤维 5.4 的数量也有增加的趋势。 270 5.5 非负重种植体周围板层骨薄、骨髓腔间隙大，神经纤维数量也较少。 致谢 感谢北京大学口腔医学院病理科的高岩教授、王晶技师为本研究提供的无私帮助。 [参考文献] (References) [1] Wada S, Kojo T, Wang YH, et al. 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