实验八血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）

实验八血糖的测定（葡萄糖氧化酶法） 实验十 血糖的测定 血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定，维持在3(9mmol,L,6(1mmol,L之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一，有着双重实际意义:其一，维持稳定的能源供给，满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二，保证机体不因进食致血糖浓度过高，导致糖的丢失。 因此，血糖的测定是临床生化检验实验室的常规项目。血糖测定按其发展过程及反应原理的不同，大致分三类:氧化还原法 ，缩合法(主要有邻甲苯胺法)，酶法(主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法)。下边介绍两种方法供选择。 一、葡萄糖氧化酶法 【目的】 1. 了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，能进行血糖测定的操作。 2. 掌握血糖测定的临床意义。 【原理】 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶 (peroxidase，POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，即 Trinder 反应。其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在505nm波长处测定吸光度，与管比较可计算出血糖的浓度。反应式如下: GOD2HO葡萄糖酸葡萄糖+O2HO22++22 POD2HO+4-氨基安替比林红色醌类化合物酚+22 【器材】 试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】 1. 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0) 称取无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g溶于800ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调节pH至7.0，然后用蒸馏水稀释至1L。 2. 酶试剂 称取过氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于上述磷酸盐缓冲液80ml中，用1mol/L NaOH调pH至7.0，加磷酸缓冲液至100ml。 置冰箱保存，4?可稳定3个月。 3. 酚溶液 称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中(酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g/L的溶液，贮存于棕色瓶中，用时稀释)，用棕色瓶贮存。 4. 酶酚混合试剂 取上述酶试剂与酚溶液等量混合，4?可以存放一个月。 5. 12mmol/L苯甲酸溶液 溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水至1L。 6(葡萄糖标准贮存液(100mmol/L) 称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，并移入100ml容量瓶内，再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml。 7.葡萄糖标准应用液(5mmol/L) 吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 于100ml 容量瓶中，加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。 【操作】 取3 支试管,编号，按下表操作。 表3-12 血糖测定操作步骤 加入物 (ml) 空白管 标准管 测定管 血清 , , 0.02 葡萄糖标准液 , 0.02 , 蒸馏水 0.02 , , 酶酚混合液 3.0 3.0 3.0 混匀，置 37 ?水浴中保温 15分钟，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。 【计算】 测定管吸光度 血糖(mmol/L)= ×5 标准管吸光度 标准管吸光度血清葡萄糖(mmol/L),×5 测定管吸光度 【注意事项】 1(测定结果如超过20mmol,L，应将标本用生理盐水稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 2(若酶酚混合试剂呈红色，应弃之重配。因标本和标准用量少，其加量是否准确对测定结果影响较大，故其加量必须准确。 3(GOD-POD法的第一步反应特异性高，而由POD催化的第二步指示反应是非特异性的，易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰，这些物质与色素原竞争H0，使测定结果偏低。 22 4(Trinder反应由Trinder于1969年提出。后经许多学者改进，采用2，4-二氯酚、2-羟-3，5-二氯苯磺酸等代替苯酚，由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高于苯酚，使反应灵敏度得以提高。 【正常参考范围】 3.9,6.1mmol/L 【临床意义】 1. 生理性高血糖 可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后，或精神紧张、交感神经兴奋，肾上腺分泌增加时。 2. 病理性高血糖 ?糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。 ?对抗胰岛素的激素分泌过多:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α-细胞瘤等。 ?颅内压增高:颅内压增高(如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等)刺激血糖中枢，出现高血糖。 ?脱水引起的高血糖:如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。 3. 生理性低血糖 饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。 4. 病理性低血糖 ?胰岛素分泌过多:由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。 ?对抗胰岛素的激素分泌不足:如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退等。 ?严重肝病患者:肝贮存糖原及糖异生功能低下，不能有效调节血糖。 【结果及分析】 【思考题】 1. 血糖有哪些来源和去路，机体是如何调节血糖浓度恒定的, 2. 酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制，用蒸馏水是否可以，为什么, 二、邻甲苯胺法 【目的】 了解测定血糖的原理和方法，要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。 【原理】 葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺，后者脱水生成雪夫(Schiff)碱，再经结构重排，生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式如下: 葡萄糖 + 邻甲苯胺 葡萄糖邻甲苯胺 -HO 2葡萄糖邻甲苯胺 雪夫碱 【器材】 试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】 1(邻甲苯胺试剂 于940ml冰醋酸中加入硫脲1.5g, 邻甲苯胺60ml,混合,直至硫脲完全溶解,置棕色试剂瓶中,室温保存。新配试剂应放置24小时后(待老化)使用。此试剂腐蚀性强，避免接触皮肤，应用自动吸管加液。 2(12mmol/L苯甲酸溶液 于900ml 蒸馏水中加入苯甲酸1.4g,加热助溶,冷却后置于1L容量瓶中,加蒸馏水至刻度。 3(葡萄糖标准储存液(100mmol/L) 称取无水葡萄糖(预先置80?烤箱干燥至恒重，移置干燥器内保存)1.802g,溶解于80ml苯甲酸溶液中,移置100ml容量瓶中,再加苯甲酸溶液至刻度。 4(葡萄糖标准应用液(5mmol/L) 取葡萄糖标准储备液5ml，置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。 【操作】 1(取16×150mm试管3支按下表进行操作: 表3-13 血糖测定操作步骤 试剂(ml) 测定管 标准管 空白管 血清或血浆 0.1 — — 葡萄糖标准应用液 — 0.1 — 蒸馏水 — — 0.1 邻甲苯胺试剂 3.0 3.0 3.0 2(将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟，取出用自来水冷却5分钟。注意在煮 沸时水浴中的水面必须高于试管内的液面。否则则温度不均而影响比色。 3(用波长630nm分光光度计进行比色，空白管调零点，读取测定管与标准管吸光度。 4(计算 测定管吸光度 血糖(mmol/L)= ×5 标准管吸光度 5(本测定法空腹血糖正常值为3.89,6.11 mmol/L(70,110mg/dl)。 【临床意义】 同上。 【结果及分析】 【思考题】 讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素,