孕妇外周血中胎儿细胞的来源,富集及在产前诊断中的应用

孕妇外周血中胎儿细胞的来源,富集及在产前诊断中的应用 孕妇外周血中胎儿细胞的来源,富集及在产 前诊断中的应用 中华妇产科杂志1991筚第26巷第2期 孕妇外周血中胎儿细胞的来源,富集 及在产前诊断中的应用 华西医科大学医学遗传研究宣?季关武张思仲 60年代末,有作者发现孕妇外周血中台有少量胎 儿细臆.以后一些作者用不同方祛证实了这一发现, 井对骆儿细臆的来源,含量匣其进人母体循环的方式 进行了探讨.近年来,有作者指出,母血中的胎儿细 臆可加以富寨,应用于产前谤断.本文拟对上述内容 作简要介绍. 一 ,孕妇外周血中胎儿细胞的发现 1969年,美国学者Walknowska在研究孕妇外周 血淋巴细臆按型肘,理察捌具有5十小近嫱着丝粒染 色体的细臆,经仔细分析,确认其按型为46,XY. 作者推测t这种46,xY男性细胞在孕妇外周血中出 现,是由于孕妇本身是嵌台俸,或由于男性胎儿的细臆 进人到母体循环,并对培养液中的有丝分裂原作出 转化反应.此后作者把上述男性细胞在母血中出现与 否与出生胎儿的性别进行了对照研究,结果在21名孕 妇的外周血中查到1或数个具有Y染色俸的细胞,其中 l9名孕妇分挽了男婴.作者认为,在孕妇外周血中理 察到的46,XY细胞,是男性胎儿的淋巴细胞经胎盘 转移蓟母俸循环的结果. 此后,一些作者相继在孕妇或妊娠的哺乳动物外 周血中理察到46,XY细胞],他们的方祛M型 植物凝血素(PHA)及其他方祛匣所观察到的百舟比, 见1 1979年,Herzenberg等采用HLA-Az抗原单克隆 裹l体外观察孕妇外周血淋巴细胞中46,XY细臆曲比例 抗体免痉荧光技术及荧光搬括的细胞分类器(FACS), 在孕妇外周血淋巴细胞中见蓟并富集了胎儿细胞3. 1989年,Kulozik又应用甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体及 直接免痉荧光法,在46名孕妇外周血淋巴细臆中检羽 爿了形f阻淋巴细臆的胎儿细臆].选些研究进一步证 实了在妊妊期间胎儿细胞能经胎盘转移蓟母体循环. 1088年,却牙利作者Selypes等发展了一种富寨胎儿 细租的方法并韧步应用于产前胎儿性另日及按型的诊 断】. 二,孕妇外周血中胎儿细胞的比伪 不同作昔或不同捡铡方祛,在母体外周血淋巴细 胞中检捌蓟胎儿细臆的比伪有较大差异,见表1,在未 经富集时从0.03—7.oN不等.Walknowska认为理襄 爿的胎儿细臆百分比,并不反映体内实际情况,因有 影响理察比伪的因素.(1)胎儿细臆通过胎盘的方式 与持续时间.(2)胎儿细臆与母体淋巴细胞对有丝分 ?邮政糖码610041 一述 裂原的相对敏感性.(3)培养过程中胎儿细胞与母体 细胞的传代时间(4)胎儿细胞在母体中存活的时 伺.(5)72小时培养后胎儿细胞与母体细胞的比例. (6)其他一些未知因素,如胎儿细胞在母体中植入, 或持续存在形成嵌台性或多重化.Kirsch—Voldcrs估 算孕妇外周血中胎儿细胞的实际比例应为0.O4, 0.23 观察到的胎儿细胞的比侧与孕龄有一定的关系 不同的孕妇以及不同实验室的横向研究结果显示.孕 妇外周血中胎儿细胞的比例随孕龄增大而增加.然而, 由于在同一孕妇不同孕期采血进行瓤向研究的赞料有 限,对二者的关系尚没有结论]. 三,母血中胎儿细胞的性质 对母血中胎儿细胞的组织来源尚无定论Wa! knowska认为它fm柽白淋巴干细胞或淋巴样细胞, 其依据是这些细胞在母血中存在,并对有丝分裂原 发生转化反应,且细胞形志可以改变.Kulozik应用 免疫荧光直接染色按观察到的骆儿细胞形态支持选一 看挂. 然而rSchr~der认为母血中胎儿细胞对有丝分 裂廉不发生转化反应,甚至可能在孕妇外周血淋巴细 胞培养过程中不分裂,因此可能不是琳巴细胞?.Co一 one等认为在孕妇外周血中存在滋养叶细胞(tzopho— blastcells).他们采用啦养叶细胞表面特异性抗原的 单克隆抗体一免疫荧光技术及诧式细胞分类计数器 在46个不同孕妇的外周血淋巴细胞中,都检测到落 弗叶细胞.后者可分为三类(】)无接细胞,直径 <5在外周血淋巴细胞中的比例<3/1OOO,其比例 似与孕龄成正相关.(2)二倍体细胞直径约” 比铡<8/1OOO.(3)多棱细胞直径12~14比例 在1,4/IOOO之问.后两类细胞的比例与孕龄无关?. Covone等检谢到的落养叶细胞是否就是Walknowska 粹观察到的胎儿细胞,或两者在母血中同时存在目前 尚不清楚. 四,胎儿细胞开始进入母体循环的时间及可能方 式 Kitsch—Voiders指出,从妊娠10k的孕妇采取外 周血,通过分析46XY分裂相或闭期棱荧光Y小体 即可确定胎儿性别.而此前Schindler等指出的最早 时间是12周,Grouchy和Trebuchet认为是I3周m】, Grosset等及Walknowska等认为是?周, Zilliacus等认为是l5周”,Schr~der和Chapelle 认为是16周.此后Selypes在妊娠7周的孕妇外周 血中检测到了荧光Y小俸和XY分裂相哪.可见.至 少从妊娠第7周开始,即有一些胎儿细胞进入母抗原的反 应性.也有人认为低荆量的移植物抗原长期慢性在静 ? 脉内刺激,可能削弱了机体对抗原的反应能力.已知胎 儿淋巴细胞有组翱相容性抗原,井在胚胎早期就已表 达,因此,胎儿淋巴细胞通过骆盘转移到母体循环后, 作为低剂量的移植抗原.很可能有助于母体形成对胎 儿的耐受性. 六,母血中胎儿细胞的富集及其在产前诊断中的 应用 孕妇外周血中的胎儿细胞,常规培养耐只能用作 胎儿性别的诊断.而这种诊断的准确串不高.Kitsch— Volders用氟芥喳吖因(OM)染片,通过期翔桉荧光 Y小体诊断胎儿性别的准确事是83通过分析中期 分裂相的准确率为89两者准确率合为72.其他 一 些作者诊断的准确率与此相近.1975年,Herzenberg 采用荧光擞活的细胞分类器将孕妇外周血淋巴细胞中 胎儿细胞进行富集.虽此j軎使产前胎儿性别诊断的准 确率有了提高但由于富集后的胎儿细胞不能继续 培养和分离.在产前诊断中的应用受到了限制 1988年,Selypes采用空气培养法在培养孕妇 外周血的过程中,富集胎儿细胞17倍,有利于母血中 胎儿细胞在产前诊断中的应用.Selypes采用的空 气培养j軎与一般的细胞培养方法无本质不同,前者 是在细胞培养的最初6小时不培培养瓶加盖,让细胞 与培莽基暴露于空气中.但Selypes采用的培养方法 还有如下特点,(1)采用无血清或低血清(1.5)培 养基.(2,采用M型植物凝血索(PHA)作为有丝分 裂原(3)6.5ml培养基接种1,1.8ml肝素化垒血. 在采用空气培养睡后恻备的集色体敢片上只需计 数6O个分裂相,就可观察到5,12个胎儿细胞的分裂, 相,并可进行桉型分折.Selypes在观察到的194个胎 儿细胞棱型中.34个有染色体数目或结构异常,其 中4种棱型异常见于2或2个以上的细胞,见表2. 遗4种接型异常中.有3种在出生后的耍儿中得刊证 实.Selypes认为垃珐可用来研究胎儿的染色体异 常. 衰=胎儿细胞富集后观察刊的接型异常m 按型异常细胞教茸 d5,XX,一l9 45,XY,一l9 45,XX,一2l d8.xY.+2,+16 4e.xY,de1(21(q22一teT) 4e,X,de1(X)(q24一pter) 蚰,XY,d~l(Y)(ql2-ter) d6,xX,t(622(p21jp儿) 6,XX,t(1017)(pi3iplS) 46,XX,t(1117)(q22Iq25) I6.XY,t(18pt) ‘校型异常晏儿在出生后得到了证实 , 七,前景与展望 现牛遗传病的产前诊断主要靠疆取绒毛或抽职羊 水,但吸取城毛和抽取羊水的拄术难度大,且可对母 体和腑儿造成一定危害.因此,如能进一步富集,甚 至分离孕妇外周血中胎儿细胞,应用于产前诊断,可望 成为一种非刨伤性产前诊断方珐.特殊种类有丝分裂 原的应用以及免疫攀技术,特别是单克蘑抗体技术,免 疫括性培养背景以及流动细胞培养拄来的发展t将有 助于母血中胎儿细胞的富集,分离与纯化.近年来, 迅速发展的,种体外脱氧棱糖接酸(DNA)扩增技 术一DNA多聚酶链式反应(PcR),可望促进非创 伤性产前诊断技术的建立和发展.在相应引物存在 时,从小量DNA出发,PCR可迅速地扩增相 应的基因,戒DNA片段选敦十或百万倍.用PCR技术 扩增后的产物,不仅可根据电抹结果直接对相应基因 或DNA片段的存在和性质作出判断,在酶切后还可 作限制性片段长度多志性分析,对遗传病或亲投等作 出诊断和判断”.尽管理论上PCR技术所需楼 板DNA为量极少,但实际上仍达刊一定量的 DNA.因此,如能够结合母血中胎儿细胞的富集,分 离纯化,微量DNA的提取以及PCR技术,将能迅速, 大量,特异地扩增胎儿DNA和用于诊断.此方珐具 有安垒,省时,简便等优点,如能成功,将为广大孕 妇所乐于接受,从而为遗传病产前诊断的普厦,为我 国人日素质的提高作出贡献. 参考文献 ?117- 1.WalknowshaJ,eta1.PracticalandtheoreticBI implicationsoffetal/maternallymphocytetransfer. 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