【doc】热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化

【doc】热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化 热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化 FOODANDFERMENTATIONINDUS1,RIES 热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化 何圣楠林影吴晓英陈璐菲 (华南理工大学生物科学与学院,广州,510641) 摘要探讨了热带假丝酵母中木糖醇脱氢酶的分离纯化工艺.分步采用硫酸铵分级沉淀,DEAE—Sepharose离 子交换层析,SephacrylS-200凝胶层析以及HiTrapBlueHP亲和层析等纯化,得到电泳纯的木糖醇脱氢酶. 经SDS-PAGE和native—PAGE分析表明,木糖醇脱氢酶分子质量约为90ku,由2个分子质量为45ku的亚基组 成.最终酶蛋白纯化倍数达到60.8倍,回收率为10.9%. 关键词热带假丝酵母,木糖醇脱氢酶,纯化 随着社会经济的高速发展,能源危机日益困扰着 整个世界,开发新的替代能源显得越发重要.木质纤 维素是地球上最丰富,最廉价的可再生资源,木质纤 维素的开发利用已成为国际研究的热点.在酸或酶 的作用下,木质纤维素的水解产物主要为六碳糖(葡 萄糖,甘露糖和半乳糖)和五碳糖(木糖和阿拉伯糖), 其中六碳糖可由传统的酿酒酵母发酵生成乙醇,而五 碳糖则不能被酿酒酵母发酵利用.研究表明,热带假 丝酵母(Candidatropicalis)可代谢利用木糖产生乙 醇_1].生物技术的发展为构建以木质纤维素为原料 生产燃料乙醇的酵母工程菌铺展了技术平台,目前主 要手段有原生质体融合和克隆木糖代谢关键酶基因 构建基因工程菌等j. 木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase,XDH,EC 1.1.1.9)是酵母菌中木糖代谢的关键酶之一.木糖 首先在木糖还原酶的作用下转化为木糖醇,然后由木 糖醇脱氢酶的催化转化为木酮糖,木酮糖经木酮糖激 酶作用磷酸化后进入戊糖磷酸循环,再经过糖酵解循 环生成乙醇….研究木糖醇脱氢酶的分离纯化和酶 学性质对构建以木质纤维素为原料生产燃料乙醇的 酵母工程菌,开发利用新能源具有重要意义,因此,木 糖醇脱氢酶性质及酶的定向进化研究备受关注_4J. 文中通过硫酸铵分级沉淀,离子交换层析,凝胶层析 以及亲和层析等方法对热带假丝酵母中木糖醇脱氢 酶的分离纯化及进一步的酶动力学的研究,为木糖醇 脱氢酶的分子生物学研究及利用木糖发酵生产乙醇 工程酵母的构建打下基础. 第一作者:硕士研究生. *广东省自然科学基金资助项目(04020051) 收稿日期:2006—02—14,改回日期:2006—04—12 46l2006VO『32No7(Tota『223)_...........'......'.'.......................'.......................................... —— 1材料与方法 1.1实验材料及仪器 1.1.1茵株 热带假丝酵母(Candidatropicalis1779),来自 中国工业微生物菌种保藏中心. 1.1.2培养基 种子培养基:葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,麦芽 糖3g/L,酵母提取物3g/L. 发酵培养基:K2HP041g/L,NaC10.1g/L,Mg— SO40.5g/L,CaC120.1g/L,酵母粉2g/L,木糖20g/L. 1.1.3试剂 木糖(上海伯奥生物科技有限公司);木糖醇(国 药集团化学制剂有限公司);8一NAD(上海伯奥生物科 技有限公司);低分子质量蛋白质(Takala公司); 其他试剂均为生化或分析纯试剂. 1.1.4主要仪器 Bio—RadBiologic中压层析仪;ThermoSpectronic Biomate3型紫外可见分光光度计;宁波新芝科器研 究所JY88一II型超声波细胞破碎仪;Eppendorf5810R 型冷冻离心机;HetoMaxi—DryLYO大容量真空冷冻 干燥系统;北京市六一仪器厂DYY一6C型电泳仪. DEAE—SepharoseFF和SephacrylS-200为Pharmacia 公司产品,HiTrapBlueHP(5mL)为Amersham公司 生产的预装柱. 1.2实验方法 1.2.1粗酶液的制备 将斜面菌株接到种子培养基中,30?下180r/ min振荡培养12h,再按5%接种量接种到发酵培养 基中,相同培养条件下培养15,17h. 加入少量1mmol/LEDTA,以3000r/min离心 发酵液10min,收集菌体,用含2mmol/LMgC12的 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)以相同离心条件洗 涤2次,并用同样的缓冲液悬浮.将菌体悬浮液置于 冰浴中,200W超声波破碎25min,工作时间和间歇 时间分别为5S和10S;8000r/min的转速离心5 min,除去细胞残片,即得到粗酶液,4"C保藏备用. 1.2.2木糖醇脱氢酶酶活力测定【4, 木糖醇脱氢酶需要NAD作为辅助因子,催化 木糖醇生成木酮糖以及NADH,由于NADH在340 nm有最大吸收峰,故可通过测量单位时间内酶催化 反应体系在340nm处吸光度的增量从而计算出木 糖醇脱氢酶的酶活.酶活单位定义为25?时,每分 钟还原1#mol的NAD所需的酶量.测量酶活需用 10mmol/L的NAD溶液,0.4mol/L的木糖醇溶 液,10mmol/LMgC1,溶液和0.1tool/LTris—HC1 (pH8.4)缓冲液.各溶液的体积为: 2.3mLTris—HC1缓冲液+0.1mLMgC12溶液 +0.5mLNAD溶液+1mL木糖醇溶液+0.1mL 酶样品. 1.2.3蛋白含量测定 以牛血清蛋白为标准样,用Bradford法测定蛋白 含量. 1.2.4木糖醇脱氢酶的分离纯化 硫酸铵分级沉淀:取5mL粗酶液8份,加硫酸 铵分别至20%,30%,40%,50%,60%,70%, 80%,90%饱和度,4?静止过夜,10000r/min低温 离心15min,弃上清液,沉淀用一定量缓冲液溶解, 立刻测定各组样品的酶活性和蛋白质含量,绘制硫酸 铵盐析曲线.根据盐析曲线选取适当的饱和度进行 硫酸铵分步盐析制得粗酶沉淀,用少量含2mmol/L MgC12的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)溶解后经 SephadexG一25柱(夺1.5cm×30cm)以相同的缓冲液 过滤脱盐,浓缩备用. 阴离子交换层析:硫酸铵分级沉淀所得的样品上 样到DEAE—SepharoseF.F.离子交换柱(夺5cmX25 cm),先用含2mmol/LMgC12的0.02mol/L磷酸缓 冲液(pH7.2)洗脱未吸附的蛋白质,再用含0.5mol/ LNaC1和2mmol/LMgC12的0.02mol/L磷酸缓冲 液(pH7.2)进行盐浓度为0.15,0.5tool,eL的梯度 洗脱,体积流量1mL/min,紫外检测器在线检测 A280,测定收集器各管活性并收集活性组分,除盐 后浓缩备用. 凝胶层析:经过离子交换层析得到的活性组分用 含2mmol/LMgC12的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡.酶样品上样到SephacrylS-200柱(夺1.5 cmx30cm),再用相同的缓冲液以0.3mL/min的流 速洗脱,紫外检测器在线检测A280,收集活性峰. 亲和层析:经过离子交换层析和凝胶层析得到的 活性组分用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)平衡. 酶样品上样到HiTrapBlueHP(5mL)进行亲和层 析.先用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱未吸 附的蛋白质,再用含2mol/LNaC1的20mmol/L磷 酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱,体积流量2.5mL/min, 紫外检测器在线检测A280,收集活性峰. 1.2.5木糖醇脱氢酶纯度和分子量检测LJ SDS-PAGE电泳,采用10%的分离胶,考马斯亮 蓝R一250染色. native-PAGE电泳,采用12%的分离胶,考马斯 亮蓝R一250染色. 低分子质量标准蛋白的组成:兔磷酸化酶B, Mw97400;牛血清白蛋白,Mw66200;肌动蛋白, 43000;牛碳酸酐酶,Mw31000;鸡蛋清溶菌酶,Mw 14400. 2结果与讨论 2.1硫酸铵分级沉淀 木糖醇脱氢酶粗酶液的盐析曲线见图1.由图 可见当硫酸铵饱和度小于30%时,木糖醇脱氢酶尚 未沉淀;在30%,60%饱和度范围内,木糖醇脱氢酶 的沉淀量随硫酸铵饱和度增加而增加;当硫酸铵饱和 度达到60%时,木糖醇脱氢酶沉淀量基本不再增加. 综合考虑硫酸铵沉淀过程中杂蛋白除去效果和酶回 收率等因素,选用30%饱和度硫酸铵沉淀去除杂蛋 白,再用60%饱和度硫酸铵对上清液盐析沉淀木糖 醇脱氢酶. ? R 廷 罐 翟 203(1405I)6')70809010(1 硫酸铵饱和度,% 图1硫酸铵盐析曲线 2.2DEAE-SepharoseF.F.离子交换柱层析 将离子交换层析放在木糖醇脱氢酶提纯第2步 Q堡蔓丝鲞蔓塑星蔓垫塑2f47 l F00DANDFERMENTAT10NINDU汀RIES 的优点在于其样品处理量较大,适合作为分离纯化的 前期方法.本实验选用DEAE—SepharoseF.F.阴离 子交换剂进行分离纯化,先用含2mmol/LMgC12的 0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)洗脱未吸附的蛋白 质,再用含0.5mol/LNaC1和2mmol/LMgC12的 0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)进行盐浓度为0.15 , 0.5mol/L的梯度洗脱.层析图谱如图2所示. 100 蛙 罐 靛 0 SepharoseF.F.离子交换洗脱曲线 图2DEAE— (峰4下的折线表示各管样品木糖醇脱氢酶相对酶活力) 酶活性成分在梯度洗脱后期被洗脱出来,主要集 中在峰4,证明木糖醇脱氢酶是酸性蛋白质.实验结 果表明,样品中含有多种等电点小于7.2的杂蛋白, 被离子交换剂吸附,与目标木糖醇脱氢酶一起得到分 离.经过阴离子交换柱后,样品得到进一步的纯化和 浓缩,其活性回收和纯化倍数计算结果见表1. 2.3SephacrylS.200凝胶层析 与离子交换层析相比,凝胶层析的特点是上样量 较小,而且样品中不能有太多的待分离组分,否则会 严重影响分离效果,因此将其放在离子交换层析之 后.实验中选用分离范围为5000,250000u的 SephacrylS-200进行凝胶过滤.层析图谱如图3所 示.经活性检测,洗脱峰2为活性组分. 0.09 ()07 0.05 0.03 ().()l 蛏 罐 靛 图3SephacrylS-200凝胶层析洗脱曲线 (峰2下的折线表示各管样品木糖醇脱氢酶相对酶活力) 2.4HiTrapBlueHP亲和层析 亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结 合,所以分离提纯的效率很高,但由于柱容量的限制, 48l2—006Vol,32No—.7(Total723) 上样量较小,因此将其安排在木糖醇脱氢酶纯化的最 后一步.木糖醇脱氢酶需要NAD作为辅助因子, 因此可选用HiTrapBlueHP(5mL)进行亲和层析. 层析图谱如图4所示.经活性检测,在盐洗脱开始时 被洗脱出的峰3为活性组分,符合亲和层析洗脱曲线 的规律. E 商 基 Z 100堡 蓑 0 图4HiTrapBlueHP亲和层析洗脱曲线 (峰3下的折线表示各管样品木糖醇脱氢酶相对酶活力) 2.5木糖醇脱氢酶的电泳分析 把每步层析后所得的酶样品液浓缩脱盐后分别 进行native.PAGE电泳和SDS-PAGE电泳分析,结果 见图5和图6. l23marker I一经过离子交换层析,凝胶层析和亲和层析纯化的酶样 2一经过离子交换层析和凝胶层析纯化的酶样 3一经过离子交换层析纯化的酶样 图5木糖醇脱氢酶的native.PAGE电泳图 4Ix]U 2{XIkU O00kU 000ku 4o0ku 1一经离子交换层析,凝胶层析和亲和层析纯化的酶样 2一经离子交换层析和凝胶层析纯化的酶样 3一经离子交换层析纯化的酶样 图6木糖醇脱氢醇的SDS—PAGE电泳图 亲和层析后的酶样品SDS-PAGE电泳呈现单一 条带,根据标准蛋白质分子质量与相对迁移率的关系 可以计算SDS-PAGE电泳中条带位置的分子质量为 45ku,而在native—PAGE电泳中的条带位置的分子 质量大约是其2倍,因此推断木糖醇脱氢酶分子质量 约为90ku,由2个分子质量为45ku的亚基组成. 2.6木糖醇脱氢酶纯化结果 热带假丝酵母胞内木糖醇脱氢酶通过粗酶液制 备及四部分离纯化已获得电泳纯酶,纯化处理步骤木 糖醇脱氢酶酶活力回收率和纯化倍数如表1所示. 表1木糖醇脱氢酶的纯化结果 3结论 文中探索了用离子交换层析,凝胶层析和亲和层 析等方法对热带假丝酵母提取液木糖醇脱氢酶活性 组分进行分离提纯,得到了1条较高纯化倍数,较高 回收率的提取工艺路线.经分离纯化的木糖醇脱氢 酶最终比酶活可达11.37U/mg,纯化倍数达到60.8 倍,回收率达到10.9%.经sDS—PAGE电泳和na— tive—PAGE电泳分析可知木糖醇脱氢酶相对分子质 量约为90ku,由2个分子质量为45ku的亚基组成, 与其它微生物来源木糖醇脱氢酶报道的结果相 似_3.4.6J,并通过初步的研究热带假丝酵母木糖醇脱 氢酶主要以NAD为辅酶,进一步木糖醇脱氢酶酶学 性质的研究数据正在整理,研究为构建以木质纤维素 为原料生产燃料酒精的酵母工程菌奠定了基础. 参考文献 1刘娜,石淑兰.木质纤维素转化为燃料乙醇的研究进展 [J].现代化工,2005,25(3):19,24 2钟桂芳,傅秀辉.发酵木糖生产酒精的研究进展及其应用 前景[J].微生物学杂志,2004,24(1):42,45 3PhadtareSU,RawatUB.Purificationandcharacterisation ofxylitoldehydrogenasefromNeurosporaCras~[J].FEMS MicrobiologyLetters,1997,146:79--83 4EhrensbergerAH,EllingRA,WilsonDK.Structure~guid— edengineeringofxylitoldehydrogenasecosubstratespecificity [J].Structure,2006,14:567,675 5汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版 社,2000.77,123 6PanagiotouG,KekosD.Purificationandcharacterisationof NAD一dependentxylitoldehydrogenasefromfusarium oxysporium[J].BiotechnologyLetters,2002,24:2089, 2092 PurificationofXylitolDehydr0genasefromCandidatropicalis HeShengnanLinYingWuXiaoyingChenLufei (SchoolofBioscienceandBioengineeringSouthChinaUniversityofTechnology,Guangzh ou510641,China) ABSTRACTXylitoldehydrogenase(XDH)iSoneofthekeyenzymesintheconversionofxy losetoethano1. XDHfromCandidatropicaliswaspurifiedbyammoniumsulphateprecipitation.DEAESepharoseF.F.ionex— changechromatography.SephacrylS一 200gelfiltrationandHiTrapBlueHPaffinitychromatography.Purified XDHfollowingtheabovefourstepswas60.8一 foldandtheactivityrecoverywas10.9%.Thepurifiedenzymewas composedoftwoidenticalsubunitswiththemolecularweight45ku.ThenativemolecularweightiSabout90ku KeywordsCandidatropicalis,xylitoldehydrogenase,purification 2006年第32卷第7期(总第223期)