神经生长因子及抑制因子对鸡胚背根神经节轴突生长的影响

神经生长因子及抑制因子对鸡胚背根神经节轴突生长的影响 第 20 卷第 2 期 南 京 医 科 大 学 学 报 2000 年 3 月87 A C TA U N IV ER S ITA T IS M ED IC IN A L IS N A N J IN G 神经生长因子及抑制因子对鸡胚背根神经节轴突生长的影响 1都爱莲 丁新生 沈 邓晓萱 程 虹 姚 娟 霞 1 南京医科大学第一附属医院神经内科, 南京 210029; 徐州医学院附属医院, 徐州 221002 () () () 摘 要 目的 研究神经生长因子 和神经生长抑制因子 对鸡胚背根神经节 轴突生长的影响。 N GF N G ID R G 分离培养鸡胚 加入 、并观察它们对轴突生长的影响。 结果 轴突在含 的培养液中迅速生长, 加 , D R GN GFN G I D R G N GF 入 后这种生长被抑制。 结论 可促进 轴突的生长, 而 抑制它的生长。N G I N GF D R G N G I 关键词 背根神经节; 细胞, 培养的; 神经生长因子; 神经生长抑制因子 102741中图号 R The Effe c t o f N e u ro n G row th F a c to rs a nd N e u ro n G row th Inh ib ito rs o n the G row th o f C h ic k Em b ryo n ic D o rs a l R o o t G a ng lio n A xo n ., ,, D u A ilian D in g X in sh en g Sh en X iae t a l ,,D ep a r tm en t of N eu rology th e F irs t A f f il ia ted H osp ita l of N a nj in g M ed ica l U n iv e rs ity 210029 N a nj in g () eva lu a te th e effec t o f n eu ro n g row th fac to r s N GF an d n eu ro n g row thA bstra c t O bjec t ive T o () () . in h ib ito r s N G Io n th e g row th o f ch ick em b ryo n ic do r sa l roo t gan g lio n D R G axo nM e thod s C h ick . em b ryo n ic D R G w a s dep a r ted an d cu ltu redN GF an d N G I w e re added in th e cu ltu re re sp ec t ive ly an d th e ir 2 T h e axo n o f D R G g rew rap id ly in cu ltu re o f N GF supp lem en t in g an d th e ireffec t w a s no ted. Re sults g row th w a s in h ib ited w h en N G I w a s added. Con c lus ion N GF m ay ac t iva te th e g row th o f D R G axo n w h ile .N G I m ay in h ib it it Key word s do r sa l roo t gan g lio n; tum o r ce lls, cu ltu red; n eu ro n g row th fac to r s; n eu ro n g row th in h ib ito r s 在神经系统发育过程中, 神经纤维的正常投射 , 解剖显微镜下, 用显微剪沿腹中线剖开, 清除 皿中 受到其生长环境中起营养作用的信号因子如神经生 体 腔 内 脏 器, 完 全 暴 露 脊 柱 和 沿 脊 柱 两 侧 排 列 的 () 长因子 , 和抑制性信 。在的上方切开脊柱, 将脊髓尾侧端向头 n eu ro n g row th fac to r sN GF D R GD R G ( 号 因 子 如 神 经 生 长 抑 制 因 子 侧端掀起, 清除脊髓组织。用镊子夹 外周侧神 n eu ro n g row th D R G 1 ) 经纤维根部摘取 立即置于 4? ƒ212 , , 的共同调控。 长期以来, 国内外 D R G DM EM F in h ib ito r sN G I ( )培 养液中 培养液中加有 和青、链霉素。 学者对神经营养因子做了大量的研究, 建立了较为 N aH CO 3 成熟的细胞模型。自问世以来, 一直是国外研 用 显 微 尖 镊 子 仔 细 剥 去 外 膜 和 背 根 神 经 残 N G I D R G 根。将 剪成 12 或 14 的小块。加入胰蛋白酶 ƒƒ究的热点, 国内尚缺乏有关的报道。我们在美国同道 D R G () 的协助下, 建立了 7 鸡胚背根神经节 的体 使终浓度为 01125% , 4?下消化 30 , 10% 马血 E D R G m in 外培养方法。验证了 的神经营养作用, 成功地 清终止消化。 N GF 检测了成年鸡脑源性的 ——21 对轴 N G ICo llap sin 突生长冠的抑制活性。 112 神经节细胞的培养 2 预先将硝酸清洗过、 U V射线灭菌处理过的 盖 片 浸 入 40 的 溶 液 中, 37?下ƒΛgm l L am in in 1 材料和方法 3 液中温育 30 。将剪下的 小块置于 H an k m in D R G 111 鸡胚 的取材和分离 D R G 包被好的盖片上。连同盖片一起放入含有 212 F 无菌条件下取 鸡胚, 置于盛有 液的平7 E H an k 培养液的 12 孔无菌培养板中, 每孔放一块神经节。 其中两个孔不加 作为对照, 其余各孔均加入N GF () (国 家 自 然 科 学 基 金 39840011和 江 苏 省 自 然 科 学 基 金 N o N o 20 。置 37?、5% 培养箱中培养ƒ7n g m l S N GFCO 2 ) 97057资助项目B K 16, 24 。h 第 20 卷第 2 期 南 京 医 科 大 学 学 报 88 2000 年 3 月 F 212 标准培养液中含有 200 Λgm l 牛垂体提 ƒN G I 的作用提供了良好的体外试验模型。 ( )取 物 212 中 透 析 过 夜、14 、2 ƒ我们的检测结果明: 是 神经细胞 F mm o lL N aH CO 3N GF D R G 谷氨酰胺、100 的青霉素、100 ƒƒƒ生长的必需因子。 而 的促生长活性可以被成 mm o lL U m l Λgm l N GF 年鸡脑源性的神经抑制因子 21 阻断。这与的链霉素、6 的葡萄糖、5 胰岛素、5 ƒƒƒCo llap sin g L Λgm l Λg 4 320 等和 等 的观察结果相一致, 证实了 腐 胺、m l 转 铁 蛋 白、5 n g ƒm l 硒 酸、100 Λm o lƒL R ap e r F an 孕酮。中枢神经系统中抑制因子的存在。 近几年国外研究 ƒnm o lL 发现抑制因子为一大家族结构和功能相近的蛋白 113 观察前处理5 质, 命名为 ƒ家族。动物实 Sem ap ho r in sCo ll ap sin s , 用 含 有 14 在将 培 养 物 转 移 到 显 微 镜 上 之 前验证明, 这个家族的部分成员在胚胎发育期对神经 () 和 20 的 7. 4 ƒƒmm o lL N aC l mm o lL H ep e s pH 6 轴突的生长和正常投射具有明显的诱向作用。 这 非依赖性培养液替换原来的 培养液。 CO 2 N aH CO 3 ( 个 家 族 的 ? 21 现 在 统 一 命 名 为ƒSem a Co llap sin () 取用 212 平衡过的矿物油 0. 5, 1. 0 浮 F S igm am l 在培养液上面以防观察过程中培养液的蒸发。 将培 7) () 3 养板置于 37?微育器中 222, 倒置显微镜下 Sem a A 对 成 年 期 的 外 周 神 经 元 也 有 抑 制 作O PM I 8 观察。 用。 总之, 神经抑制因子的发现打破了神经元损伤 后不能再生的旧观念, 为解决中枢和周围神经元的 2 结 果 再生问开辟了新的思路, 具有广阔的研究前景。我 们的研究为进一步研究神经生长发育和神经损伤的 211 生长冠形态和活动的观察 相差显微镜下, 感觉神经元呈球形、椭圆形或不 再生、修复提供了可靠的方法。 规则形, 立体感和折光性好。 在加有 的孔中, N GF ( ) 本实验得到美国罗宇龄博士 宾夕法尼亚大学和何志神经元有长的轴突和短的树突向四周生长。 轴突生 () 刚博士 的支持, 特此感谢。U C SF 长的尖端—— 生长冠上有伸展的板状伪足和 10 余 个丝状伪足。连续观察 7 , 可观察到丝状伪足伸 m in 参考文献 展、收缩, 然后伸长, 在培养液中自由地摆动。板状伪 足的形状也随时间的变化而变化。在生长冠以 50, 1 T e ssie r LM , Goo dm an C S. T h e m o lecu la r b io lo gy o f 70 ƒ速度的生长过程中, 板状伪足有的伸展, 有 Λm h 1996, 274: 1123 axo n gu idance. Sc ience, 的 回缩。 在不加 的对照孔中, 神经元形态较 N GF 2 C h ang S, R a th jen F G, R ap e r JA. E x ten sio n o f neu r ite s 小, 突起较少, 短时间内看不到明显的生长现象。 o n axo n s is im p a ired by an t ibo d ie s aga in st sp ec if ic . , 1987, 104:neu ra l ce ll su rface g lycop ro te inJ C e ll B io l 355 212 21 抑制活性的观察 Co llap sin , , , . 3 F an JH M an sf ie ld SGR edm o nd T e t a lT h e 加入 21 的 1 内, 就可看到板状伪m in Co llap sin 2o rgan iza t io n o f F ac t io n and m ic ro tubu le s in g row th 2. co ne s expo sed to a b ra in de r ived co llap sing fac to rJ 足伸展停止, 生长冠的生长也随之停止, 丝状伪足也 停止摆动。继之, 丝状伪足和板状伪足开始回缩。在 1993, 121: 867 C e ll B io l, 以后的 10, 70 内, 丝状伪足不断地变短、减少, m in 4 R ap e r JA , Kap fh amm e r J P. T h e en r ichm en t o f a 板状伪足也缩回形成浓缩的残球。 neu ro na l g row th co ne co llap sing ac t iv ity f rom 1990, 4: 21 em b ryo n ic ch ick b ra in. N eu ro n, 3 讨 论 5 Keyne s R , Coo k GM W . A xo n gu idance m o lecu le s. , 1995, 83: 161C e ll 周围神经节的体外培养具有胞体大、成分单一、 , , , .6 M e sse r sm ith E F L eo na rdo ED Sh a t s CJ e t a l 可保持结构和功能上的某些特征等特点。 我们在培 ? Sem ap ho r in can func t io n a s a se lec t ive 养液中加入了葡萄糖、氨基酸、、胰岛素、孕酮 N GFch em o rep e llen t to p a t te rn sen so ry p ro jec t io n s in th e 等神经元生长必需的营养成分, 模拟了神经元在体 sp ina l co rd. N eu ro n, 1995, 14: 949 内的生长环境并加速了神经元的生长分化。 有研究 7 .Sem ap ho r in N om enc la tu re Comm it tee U n if ied 表明, 有促进胚胎期神经细胞分化成熟的 L am in in 功 能, 表 现 为 使 神 经 细 胞 的 突 起 增 加。 我 们 用 nom enc la tu re fo r th e Sem ap ho r in sƒCo llap sin s. C e ll, 作为递质, 一方面起到粘连和支持作用, 另 L am in in 1999, 97: 551 一方面能促进生长冠的长出, 利于迅速地获得目的 , , , . 8 P a ste rk am p R J D e W F H o ltm o a t A J e t a lE v idence 细胞。相差显微镜的应用, 使我们能够连续动态观察 ? fo r a ro le o f th e ch em o rep e llen t sem ap ho r in and it s 生长冠的活动情况, 为研究神经生长以及 和N GF 21 recep to r neu rop ilinin th e regene ra t io n o f p r im a ry . , 1998, 18: 9962o lfac to r axo n sJ N eu ro sc i ()1999207209 收稿