蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究硕士论文

蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究硕士论文 分类号: 密级: U D C : 编号: 硕士学位论文 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 Effect of propolis on the prevention and control of Tobacco bacterial wilt 硕士研究生:孔聪聪 指 导 教 师:兰建强 副教授 申请学位类别:农学硕士 专 业: 农药学 培 养 学 院: 植物保护学院 二O一三年四月 Effect of propolis on the prevention and control of Tobacco bacterial wilt Kong Congcong A Thesis submitted to Yunnan Agricultural University In special Fulfillment of the Requirements for Master Degree of Pesticide Directed by Associate Professor Lan Jian-qiang Department of Pesticide Science of Plant Protection College Yunnan Agricultural University ,Yunnan, Kunming 650201 , China April 2013 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名: 时间: 年 月 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定，即:云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名: 时间: 年 月 日 导师签名: 时间: 年 月 日 目录 摘要 ........................................................................................................................................................... 1 ABSTRACT .............................................................................................................................................. 2 引言 ........................................................................................................................................................ 3 1. 1.1我国烟草病害的研究进展 .......................................................................................................... 3 1.2烟草青枯病 ................................................................................................................................. 3 1.2.1病原 .................................................................................................................................. 4 1.2.2症状 .................................................................................................................................. 4 1.2.3致病性变异 ....................................................................................................................... 4 1.2.4生化型研究 ....................................................................................................................... 5 1.2.5发病机制........................................................................................................................... 6 1.2.6田间发病动态 ................................................................................................................... 7 1.2.7病害流行规律 ................................................................................................................... 7 1.3烟草青枯病的防治研究 .............................................................................................................. 8 1.3.1抗病品种的利用 ............................................................................................................... 8 1.3.2农业防治........................................................................................................................... 8 1.3.3生物防治........................................................................................................................... 9 1.3.4化学防治......................................................................................................................... 10 1.3.5施用抗性诱导剂 ............................................................................................................. 10 1.3.6转基因植物的利用 ......................................................................................................... 10 1.4蜂胶 ........................................................................................................................................... 11 1.4.1蜂胶特性......................................................................................................................... 11 1.4.2蜂胶的主要化学成分及差异性 ..................................................................................... 12 1.4.3蜂胶中的主要活性物质 ................................................................................................. 12 1.4.4蜂胶中主要活性物质的功能 ......................................................................................... 12 1.4.5蜂胶的应用 ..................................................................................................................... 13 1.5绿色有机烟草............................................................................................................................ 15 1.5.1国内外有机烟叶发展现状 ............................................................................................. 15 1.5.2有机烟叶种植技术体系研究 ......................................................................................... 17 1.5.3我国有机烟叶的发展优势与对策 ................................................................................. 18 1.6本实验的目的及意义 ................................................................................................................ 19 2.材料与方法 .......................................................................................................................................... 20 2.1 材料 .......................................................................................................................................... 20 2.1.1菌种 ................................................................................................................................ 20 2.1.2培养基............................................................................................................................. 20 2.1.3供试烟苗......................................................................................................................... 21 2.1.4供试药剂......................................................................................................................... 21 2.1.5实验仪器......................................................................................................................... 21 2.2试验方法 ................................................................................................................................... 21 2.2.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验 ................................................................. 21 2.2.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验 ................................................................................. 22 2.2.3室内盆栽试验 ................................................................................................................. 23 2.2.4田间药效试验 ................................................................................................................. 24 3.结果分析 .............................................................................................................................................. 24 3.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验 ............................................................................ 24 3.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验 ............................................................................................ 27 28 3.2.1农用链霉素的抑菌活性 ................................................................................................. 3.2.2多菌灵的抑菌活性 ......................................................................................................... 28 3.2.3蜂胶的抑菌活性 ............................................................................................................. 28 3.2.4复配I(农用链霉素+蜂胶)的抑菌活性 .................................................................... 28 3.2.5复配II(多菌灵+蜂胶)的抑菌活性 ........................................................................... 29 3.2.6几种药剂处理对烟草青枯病防治的综合 ............................................................. 29 3.3室内盆栽药效试验 .................................................................................................................... 29 3.4田间药效试验............................................................................................................................ 30 4.讨论 ...................................................................................................................................................... 30 4.1烟草青枯病的接种方法 ............................................................................................................ 30 4.2五种烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗性 ................................................................................ 30 4.3蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果 ........................................................................................ 31 4.4蜂胶对烟草青枯病的防治效果 ................................................................................................ 31 4.5盆栽试验与田间药效试验中防效的比较 ................................................................................ 32 4.6烟草青枯病的防治 .................................................................................................................... 32 5.结论 ...................................................................................................................................................... 32 参考文献 ................................................................................................................................................. 34 致 谢 ................................................................................................................................................... 39 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 摘要 在有机烟叶生产过程中，不能使用任何化学合成的农药，所以对蜂胶的防治效果进行了测试。分别通过药剂筛选实验、抗病性实验、盆栽实验及田间药效实验，为蜂胶防治烟草青枯病提供了初步依据: 1(抗病性实验中，通过针刺接种方法与注射接种方法的比较，表明注射接种能使植株更易更快发病，易于本实验研究;通过红花大金元、NC297、MSK326、云87、云97五个烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗病性试验，结果表明红花大金元与云87为高感品种，MSK326与云97为中感品种，NC297为中抗品种，生产种植中应选种NC297。 2(药剂筛选实验中，通过对比72%农用链霉素、90%多菌灵与蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果，结果显示蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果不佳，与72%农用链霉素差别明显。 3(盆栽实验与田间药效实验中，通过蜂胶与72%农用链霉素防治烟草青枯病的比较，结果显示蜂胶的防治效果都不超过30%，而72%农用链霉素的防治效果均在65%以上，可见蜂胶对烟草青枯病的防治效果没有农用链霉素好，但还是有一定的防治效果的，尤其作为一种天然产物，对有机、绿色烟叶的生产种植还是有一定的价值跟意义的。 关键字:烟草青枯病;青枯假单胞杆菌;蜂胶;防治;效果 1 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 ABSTRACT Effect of propolis on the prevention and control of Tobacco bacterial wilt Kong Congcong Directed by Associate Professor LAN Jian-qiang In the organic tobacco production process, any chemical synthesis of pesticides can not be used.So propolis were tested. Through the resistance experiment, the drug sensitivity test, the Pathogenicity test and the field experiment, it provided a preliminary basis for the control of tobacco bacterial wilt of propolis: .The resistance experiment, through the comparison of acupuncture inoculation method and 1 injection inoculation method, showed that the injection could make plants more easy and fast onset.So the injection inoculation method applied to this experimental study. By pathogenicity to Pseudomonas solanacearum of Honghuadajinyuan, NC297, MSK326, yun 87 and yun 97, the results showed that Honghuadajinyuan and yun 87 were highly susceptible varieties, MSK326 and yun 97 were moderate susceptible cultivars, NC297 was moderate resistant variety.So NC297 should be chose to plant. 2.The drug sensitivity test, by inhibiting effect of 72% streptomycin, 90% carbendazol and propolis on Pseudomonas solanacearum, indicated that the inhibitory effect of propolis on Pseudomonas solanacearum is poor, with 72% streptomycin was significantly different. 3.The pot experiment and field efficacy experiment, by propolis and 72% streptomycin control tobacco bacterial wilt, the results showed that the control effect of propolis was more than 30%, and the control effect of 72% streptomycin was more than 65%.It showed that the control effect of streptomycin on tobacco bacterial was better than the propolis’. But propolis still have certain effect. Especially the propolis as a biological source of drugs，have a certain value and significance to the production of the organic tobacco. Keyword : Tobacco bacterial wilt; Pseudomonas solanacearum ; propolis; control; effect 2 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 1.引言 烟草是重要的经济作物，在云南省一些经济落后的贫困地区，许多农民靠种植烟草维系生活，是山区农民脱贫致富，提高生活水平的有效途径。在烟草种植过程中，烟草病害是影响烟草产量、品质的重要因素，因此世界各烟草栽培国均高度重视病害防治。 1.1我国烟草病害的研究进展 根据1997年我国16个产烟省(区)的调查，目前有烟草侵染性病害68种，其中主要病害15种。已鉴定的62种病害中，真菌性病害30种、细菌性病害8种、病毒病害17种、类菌原体病害2种、线虫病害3种及寄生性种子植物2种。其中有15种主要烟草病害，他们是(按为害严重程度及分布范围为序)普通花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、赤星病、黑胫病、炭疽病、青枯病、野火病、马铃薯Y病毒病、蛙眼病、根结线虫病、空茎病、猝倒病、角斑病、根黑腐病、蚀纹病毒病。真菌病害中，烟草黑胫病、根黑腐病和赤星病为害最为严重。细菌病害中，为害最为严重的是烟草青枯病和烟草野火病。病毒病害中，烟草普通花叶病和烟草黄瓜花叶病最为严重，其次是 [1]烟草马铃薯Y病毒病。 近年来烤烟苗期病害越来越严重，对烟苗造成了严重影响。做好烟草苗期病害的综合防治，是培育足够壮苗、提高烟叶产、质量，获得较好经济效益的基础性工作。目前烤烟苗期病害最普遍、严重的病害主要有烟草炭疽病，猝倒病，立枯病和病毒病。 1.2烟草青枯病 烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的重要病害，1880年该病首先在美国的北卡罗来纳州格兰维尔(Granville)被发现，故当时被广泛称为格兰维尔凋蔫病，在中 [2]国则俗称为“烟瘟”、“半边疯”。 1940年前后，该病在美国和印度尼西亚的为害最为严重，此后，在许多产烟国 [2]家逐渐演变为烟草上的重要病害，如日本、澳大利亚、韩国等。 目前在中国，长江流域及其以南烟区普遍发生，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。云南省烟草青枯病早在1987年就有报道，但危害一直 [3,4]较轻。自2002年以来，云南省南部旱地烟区，烟草青枯病危害上升速度很快，局 3 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 部地块发病率达到80,以上，且常与烟草黑胫病混合发生，严重时可使全田烟草枯[5]死。目前，该病造成的损失已居各类病害的第4位，必须重视该病的防治工作。 1.2.1病原 [2]烟草青枯病病原曾用名Pseudomonas solanacearum Smith 或Burkholderia [3]solanacearum。1996 年由IJSB 正式更名为青枯雷尔氏菌(Ralstonia soanacearum E [3,4]F Smith)。此后，在国际重大刊物上发表的文章均使用该名。菌体杆状，革兰氏染色阴性，菌体大小为0.5,0.8×1.3,2.2 μm，极生鞭毛1,4 根，不形成荚膜和芽孢，为好气性细菌，在兼气下培养，其毒力迅速丧失。不同寄主上的菌落形态无明显差异。病菌生长的温度范围为18,37 ?，最适温度30,35 ?，致死温度为52 ?，持续10 min;pH 值4,8，最适为6.6。烟草青枯病菌在病残体中可以存活7 个月，在土壤或堆肥中可存活2,3 年以上，有的竟达8,25年，但在干燥的条件下很快就死亡，在种子表面的病菌2 d后即可全部死亡。在TTC培养基上，菌落中央呈粉红 [6]色，周围乳白色流动性较强(郑继法等，1998)。 1.2.2症状 烟草青枯病属典型的维管束病害，根、茎、叶各部位均可受害，但以为害根、茎为主。最典型的症状是:叶片枯萎后仍呈绿色，故称“青枯病”。在病株发病的一侧，叶片枯萎，无病的一侧叶片生长正常，呈现“半边疯”症状。茎部发病后，外表出现黑色条斑，发病严重时黑色条斑一直延伸到烟株顶部，将病株茎部横切，可见维管束变 [7]成褐色，用力挤压切口，会从导管中渗出黄白色乳状粘液，即细菌“菌脓”。受烟草青枯病菌感染的烟株一般仍然保持直立，不折倒，未摘除的病叶紧贴茎秆上。烤后症状:病叶烤后，单叶重减少，光滑，等级下降，化学成份失调。发病烟叶半片变黄或全片叶变黄时采收，烤后叶色为半叶或全叶杂色;整株烟全部枯萎变黄采收烘烤，烤 [8]后叶片为糟片，多为级外烟。 1.2.3致病性变异 青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)寄主范围虽然广泛，但菌株间的致病性具 [9,10]有明显寄主专化性。Budenhagen 1964 年依据不同寄主的致病性，将供试青枯菌 [11]株分为3 个小种。近年来的研究发现，桑树青枯菌株的致病性与3个小种都具有 [9,12]明显差异，称为小种4。烟草青枯菌属于小种1，只能侵染茄科植物。而且进一步 4 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 的研究表明，不同地区来源的烟草青枯病菌株，对其他不同寄主植物的致病性以及对 [13]烟草不同品种的致病性都有显著差异。王国平等根据烟草青枯病菌株对烤烟品种MSK326的平均致病病级不同，分为强、中和弱致病类群，大多数调查地点强、弱致病类群并存，这表明烟草青枯病菌株间有很大的致病性差异。 青枯菌的致病性在人工培养基上还很容易减弱或丧失，从TTC 培养基上菌落的形态可以鉴别致病性不同的菌落。致病性强的野生型菌株，菌落一般较大，稍凸起，不规则圆形，中央粉红色，边缘乳白色，对光观察可见有轮纹，流动性较强;弱毒或无毒菌株的菌落一般较小，圆形，中央深红色，白边较窄或无白边，菌落表面粗糙或光滑有光泽。来源不同的菌株之间致病性丧失的速率有很大差异。研究表明，青枯菌致病性丧失与诸多因素有关，如菌株来源，培养基中碳、氮来源、种类、培养条件等[14]。青枯菌在培养基上培养时间过长，易产生无毒突变体，而在无菌水中失毒则相对较慢。分子遗传学研究指出，青枯菌的致病性基因主要携带在一个特大质粒上，而且 [15]分布在7 个限制性内切酶片段上。这可能是该菌易变异的主要原因之一。 1.2.4生化型研究 Ralstonia solanacearum 可利用多种有机碳源、无机碳源、氮源，不同来源的菌株对不同碳、氮化合物的利用能力有很大差异。自20世纪60年代以来，国际上对不 [16]同寄主上的青枯病菌株的生化型进行了研究，澳大利亚的A C Hayword依据对3种 (甘露醇、甜醇、山梨醇)的利用能力，将双糖(麦芽糖、纤维二糖、蔗糖)和3种己醇 [9,12]149个青枯病菌株分为4个生化型。1986年，华静月等又将桑树青枯菌株分为新生化型，即生化型V。烟草青枯菌的生化型变异很大，不同来源的菌株其生化型有很 [11,17][17]大差异，而且菌株经长时间保存后，其所属生化型也会发生变化。美国北卡的 [18][19]烟草青枯菌菌株主要为生化型?，中国台湾省以生化型?和?为主，朝鲜则主 [20][9,12,21]要为生化型?和?。据报道，中国大陆上烟草青枯菌为生化型?和?，张建 [21]华等研究了30个烟草青枯病菌株对3种双糖和3种已醇的利用能力，结果表明，供试青枯菌可分为2个生化型(?、?)，生化型?在测试地区和品种上均有发生。王 [22]敏等测定了81个烟草青枯菌菌株的生化型，结果表明，云南省以生化型?为主。在自然或人工培养条件下，青枯菌易产生无毒突变体，其生化型也发生变化，在同一 [21]个地区和同一寄主上可以分离到生化型不同的菌株。张建华等的研究从同一地区的同一品种上也分离到两个或两个以上的生化型。此外，随着对烟草青枯菌菌株研究数 [12,21-23]量的增多，还出现了越来越多的不能归入现有任何生化型的中间型菌株。故有的学者又提出了生物亚型的概念，但对生化型与生化型之间的关系及其划分尚缺 5 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 乏统一的认识。 1.2.5发病机制 在自然条件下，病原菌通常是从烟株的根部侵入，而且在根系又伤口的条件下更容易侵入。Lucas等(1975)的研究结果是烟株根系形成伤口后立即进行接种，要比在24h后再接种的感染率要高得多，在伤根48h后再接种，烟株受害率更明显减少，这说明伤口在形成48h后已经基本愈合，可阻止病原菌入侵。移栽时造成的伤口也比移栽后造成的伤口更易侵入。病原菌在烟株其他部位侵入也是通过伤口进行的。但是，在接种细菌数量很大的情况下，即使没有伤口也能侵入。 青枯病菌对烟株的致病作用大致可以分为三个过程，即诱导局部枯萎、破坏组织和整株枯萎。病原菌侵入皮层后于细胞间隙生长，破坏细胞间的中胶层，使细胞质壁分离，变形，并形成空腔，继而侵染木质部薄壁组织，使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体，并移入侵填体。侵填体破裂后既被释放进入导管，青枯菌在导管内大量繁殖菌体及其代谢产生的大分子物质(主要是胞外多糖，EPS)，其影响和阻碍植物体内的水分运输，EPS堵塞导管，并在导管内大量增殖和快速传播扩张，影响和阻碍植物体内水分运输，同时青枯菌还向胞外分泌多种细胞壁降解酶，破坏导管组织，从而引 [24]起植株萎蔫和死亡。 青枯病菌引起多种植物的致死性枯萎，主要通过根和茎的伤口，或次生根的根冠进入植物体，侵染寄主的木质部，然后在整个维管束中蔓延，引起严重的萎蔫，最终导致植物死亡。青枯菌虽然寄主范围广泛，但某些菌系在自然条件下，只能侵染少数几种或某一种植物，因此青枯菌的致病机理十分复杂。目前，国内外对青枯菌致病机理的研究大量集中在对胞外多糖(EPS，由eps基因编码)、果胶酶(主要为内聚半乳糖醛酸酶，PG，由pgIA基因编码)和纤维素酶(主要为内切葡聚糖酶EG，由egl基因编 [24]码)在致病过程中的作用。青枯病菌在导管中生长时可产生大量胞外多糖，影响和阻塞植物内的水分运输，特别是易于对叶柄结和小叶处较小孔径的导管穿孔板造成堵 [25]塞，因而引起植株萎蔫。20世纪80年代中期以来，已从分子水平上来研究这些因素的作用。美国威斯康星大学Sequeira实验室在多年研究胞外多糖的基础上，于1991年报道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇，佐治亚大学Denny实验室克隆出了控制胞外多糖等表型转变的基因，美国的Schell等和Allen等已在分子水平上进行了研究，对聚半乳糖醛酸酶的结构基因及内葡聚糖酶的结构基因均已进行了克隆、测 [26]序和功能分析。结论是这两种酶在青枯菌致病中有一定作用。此外，在该菌中被鉴 [26]定出hrp基因在寄主和病原菌互作中起到重要作用，引起寄主发病。 6 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 1.2.6田间发病动态 由于各地地理环境和气候条件不同，青枯病在各地区的发生消长态势存在很大差异。了解病区烟草青枯病的侵染与发病动态，对病害早期监测，以及药剂防治适宜时期的确定具有重要的指导意义。有关根部侵染的早期监测研究很少，陈顺辉等提出通 [27]过20cm土温和高感品种红花大金元的萎蔫症状监测烟草青枯病的流行动态。青枯 [28]病在我国呈由北向南、由西向东始病期逐渐提早，为害程度逐渐加重的趋势。烟草 [29]青枯病发生危害与品种、耕作类型、栽培管理、地形地势等有密切关系。据广东省的调查结果表明，在春季5月份日均气温达到23?以上开始出现烟草青枯病病株;当旬降水50cm以下，相对湿度80%以下，日照率高于15%，青枯病轻度发生;当日均气温为25,30?，多雨、高温、少日照条件下病害则严重流行。病原菌从根部侵入后1周或稍长时间，烟株地上部出现青枯症状。发病后25d内病情发展快，以后病 [28][30]情逐渐减弱。同一省区平原与山区发病时期也不同，山区比平原发病稍晚一些。 1.2.7病害流行规律 烟草青枯病是高温高湿型病害。低温高湿或高温干旱都不能使病害发生和流行。发病最适宜的温度为30,35?。湿度是影响该病发病流行的另一重要因素。雨量多、湿度大，病害发展快，为害重，相反雨量少、湿度低，病害发展受抑制，为害相对较轻。暴风雨或久旱后遇暴风雨或时雨时晴的闷热天气，更有利于病害的发生和流行， [1]往往易于造成该病的大发生。不同土壤类型，青枯病的发病程度差异较大。土质粘重易板结或土壤含沙量过高都易诱发病害。一般情况下，水田烟发病较轻，旱地烟发病较重，砂壤土发病较轻。通常地势高的烟地发病较轻，地势低的烟地发病较重，低洼积水处更重，田块的入水口或流水经过处也较重。 青枯病菌主要在土壤中及遗落在土壤中的病残体上越冬，也能在各种生长着的寄主体内及根际越冬。种子一般是不带菌的。因此，青枯病菌的主要初侵染源是土壤、病残体和肥料。病菌靠流水、肥料、病苗、人、畜及生产工具带菌传播。人工操作和昆虫为害常使该病传播和入侵同时完成。在诸多因素中，带菌土壤是最重要的初侵染源。桥本光司(1986)对不同的土层生物鉴定研究表明，在2—25cm的土壤表层，青枯菌分布密度大，幼苗发病率高，累计发病株率为45%一66%， 25cm以下的土层病菌少，发病率低于18%。病田流水是病害再侵染和传播的重要方式。病组织腐烂后，病菌遗留在土壤中或粪肥中越冬，成为下年的初侵染源。 7 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 1.3烟草青枯病的防治研究 青枯病的防治长期以来都是许多学者探索的问题。1976年，在美国举行了第一届国际细菌性青枯病学术研讨会;1985年，在菲律宾又举行了亚太地区细菌性青枯病学术研讨会;1992年在中国台湾举行了亚洲细菌性青枯病学术研讨会;1997年， [31]在法国举行了第二届国际细菌性青枯病学术研讨会。各国植病工作者极为关注青枯病的研究，虽然在各领域中的研究结果对青枯病的防治均取得一定效果，但仍有不足之处。目前烟草青枯病仍然是生产上尚待解决的一大难题，人们仍难以单用一种方法从根本上解决烟草青枯病的问题。 1.3.1抗病品种的利用 [32]从理论上讲，青枯病最根本的防治方法是培育和推广抗病品种，国外已有这方面报道。20世纪70年代以来从事作物青枯病研究的专家和学者对作物品种抗性鉴定筛选工作十分重视，利用不同作物大量的品种资源，选取不同致病力的菌株，采用多 [33]种方法进行大量的抗性测定工作。郑继法等研究了24个烟草品种对青枯菌的相对抗性水平，方差分析表明，只有少数品种间抗性水平有显著差异。根据不同接菌浓度下品种的抗性水平分析，相对抗性较强的品种有Nc95、Nc82和Oxfod26等;较感病的品种有青梗和Ky9两个品种，其余品种介于两者之间。周清明、匡传富、林海、 [34-38]潘建菁、巫升鑫等对青枯病抗病品种筛选进行了大量的研究，结果发现没有免疫 [36]品种，只有少数几个品种表现抗病，多数为中感和高感品种。其中林海的研究中， [38]有4份抗病材料，且都是国外品种，即RG17、0X2028、RG8和SPGll7。在巫升鑫的研究中发现迄今为止抗病谱广且能抗强菌系的种质资源，即G3、反帝3号和G6等3份，它们对青枯病I、II、III型菌系表现抗病至高抗(R—LR)。但是，抗病育种依赖于品种资源的抗病性鉴定来提供抗源，而且青枯病菌为土藏病害，其腐生性较强，存在许多不同的生理小种，相比较之下青枯病的抗病育种工作就显得更为复杂和艰巨[39]。 1.3.2农业防治 (1)轮作 对于细菌性青枯病的防治，前人已做了大量的工作，提出的农业防治措施主要是轮作。轮作，曾是防治青枯病的有效措施，但是由于中国人多地少，耕地有限，此措施运用受到极大的限制，所以轮作措施也只是在局部地区起到部分的防治 8 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 [40]作用。轮作是一种用地养地相结合的生物学措施。根据青枯病的特点可实行“稻—稻—烟”的轮作制度，旱地烟的轮作间隔年限至少3年，轮作作物最好选用禾本科作物及甘薯、大豆、豇豆、绿豆等，不与马铃薯、番茄、辣椒、茄子、花生、芝麻及姜类等作物轮作; 宜大面积连片种植烟叶。 (2)培育和使用无病壮苗 选择地势平坦、背风向阳、交通方便、有清洁水源的地方作苗床地，前作不能为茄科作物。加强育苗场地与育苗物资消毒，育苗用水必须是清洁水，日常管理注重消毒措施和操作卫生，在苗棚入口处和育苗棚四周要覆盖防虫网以防烟蚜; 老病烟区尽量早播早栽，移栽时避免伤害根系。 (3)均衡营养 营养是烟株生长发育的基础，生产上提倡平衡施肥，适当增施磷钾肥，氮肥应尽量使用硝态氮肥，在缺硼的烟田适当追施硼肥，多施有机肥。对于发病重的烟田，可施偏心肥，大田普遍发病时，对发病烟株施速效氮肥，以促其开片，也可用1,的尿素喷施。 (4)农事操作 多雨的地区，提倡高起垄、高培土技术;雨季做到烟田无积水，健全排灌系统，防止串灌和雨水串流，以减少病原在田间扩散传播。烟田残留物必须带出田间，田间发现病株及时拔除后用生石灰消毒病穴。 (5)微生态调节 微生态调节将生态学原理应用于病害的防治，是一种病害防治的新思维、新途径。合理施用有机肥或将有机肥与生物防治、拮抗菌应用相结合，可改善和修复土壤生态环境，提高土壤和烟株自身抗御病害的能力，减少肥料和化学农 [41]药使用，改善烟叶品质和实现烟叶生产的可持续发展。张永春等的研究表明，使用堆沤圈肥的土壤对青枯病的发生具有一定的抑制作用，可推迟其始发病期，降低发病 [42]程度。陈态利用小区试验验证烟草专用多抗生物有机肥对烟草黑胫病、青枯病等病害的防治效果、产值和产量的影响，结果表明，植株抗性得到增强，病害发生率降低，尤其是2D多抗生物有机肥配方效果较为显著。生产上常用的微生态调节方法是在酸 2性土壤中施石灰，根据pH值，每667 m用量50 kg左右。 1.3.3生物防治 [43]近年来青枯病的生物防治越来越引起国内外的重视。用于青枯病生物防治的因 [44][45][46]子主要集中于弱毒力的青枯假单孢杆菌、链霉菌、假单胞杆菌、菌根真菌和 [47]芽孢杆菌。目前，对青枯菌有拮抗作用的微生物主要有芽孢多粘菌(Bacillus polymyxa)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)和芽孢杆菌方面的拮抗菌，国内外有不少用这些拮抗菌防治细菌青枯病取得不同程度的成功的例子，如弱毒力青枯 [46][48,49]假单孢杆菌的利用(任欣正等，1987)、荧光假单孢杆菌以及芽孢杆菌的利用。 9 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 尽管如此，青枯菌的生物防治还不能适应生产需要，青枯病生防菌仍处于研究阶段， [50]防治效果不稳定。 1.3.4化学防治 [51]在化学防治上，许多研究者筛选出不少对青枯病菌有较好抑制作用的药剂。陈 [52]永惠经室内毒力测定，田间小区试验和大面积示范试验，参试的12种药剂中，90%乙霜青可湿性粉剂防治青枯病的效果较好，小区试验防治效果，1 000倍液为53.65%,77.51%，1 500倍为50.63%,59.49%，大田在1 500倍两次用药条件下，各地的平均 [53,54]防效达64.78%,89.19%;卢洪兴等的研究也表明，90%乙霜青可溶性粉剂防治烟草青枯病效果显著，好于1 000万单位硫酸链霉素，其防治效果可达80%以上;孔 [55]凡玉等在1999—2000年进行了20%青枯灵可湿性粉剂400倍、60倍、800倍3个处理防治烟草青枯病药效试验，结果表明，400倍、600倍两个处理平均防效在62.1%,81.5%，每公顷可挽回经济损失1 740元以上。近年来有的试验表明，用50%DT杀菌剂200,400倍液和叶枯净300倍液灌根也有较好的防治效果。国外广泛采用杀线虫剂或多用途熏蒸剂处理土壤，可杀死线虫和多种病原菌，以减少根的伤口和病菌的侵染机会。 1.3.5施用抗性诱导剂 抗性诱导是一种利用植物自身抗性资源的措施，具有多抗、高抗和安全等优点， [56]是现代植物病害防治的一条重要途径。Harrison等在烟草根部接种青枯病菌的死菌来诱发植物体的抗性，诱导后的植株显示出了对青枯病菌的强烈抑菌作用。陈泽鹏等[57]利用50μg/mL的苯并噻二唑诱导烟株抗性，离体和活体诱导抗病效率分别为60.96%和52.76%，且其自身对病原菌无抑制作用。 1.3.6转基因植物的利用 近年来，国内外分子生物学技术的迅速发展为青枯病的防治开拓了新的途径，将与抗病有关的其他一些基因转入寄主植物中而产生防病效果已有成功的例子 (郭坚华等，1997;朱圣杰等，2003)。荷兰Floraek等(1995)将可抑制R.solanaeearum的抗菌肽cecropin B转入烟草植株，并成功地得到了mRNA水平上的表达。但是植株体内可检测的cecropin B蛋白水平和对青枯病的抗性并未提高，很可能是由于cecropin B被植物内生蛋白酶降解的原因。美国路易斯安那州立大学Jaynes等(1993)将cecropinB 10 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 的类似物shival的基因转入烟草植株，发现此植株的子代在接种了强毒性R.solanacearum后能够比对照推迟显症，降低发病程度和死亡率。中国农科院生物技术中心贾士荣等(Jiaeral，1993)将cecropin B和shival基因成功地转入马铃薯叶碟和薯块，转基因植物对中国R.solanaceaom优势小种3的野生型或强毒株表现出抗性。傅荣昭等(1998)研究发现兔防御素NP-1基因在转基因烟草植株中同样增强了烟草对青枯病的抗性并推迟了烟草青枯病的发病期。李乃坚等(1998)应用花粉管通道技术将天蚕抗菌肽B基因转入烟草子房，经多世代接种青枯菌鉴定及各项检测表明，抗菌肽B基因已整合到烟草基因组并传递到后代中，田间发病率和病情指数分析显示T3、T4代转基因株系抗青枯病能力有明显提高。陈艳等(2003)通过PcR从芡属植物千穗谷的总DNA中扩增出觅菜抗菌肤(Ah-AMP)的核基因片段，通过根癌土壤杆菌介导方法转入了烟草，提高了烟草的抗病性。张景宁等(1995)研究报道柞蚕杀菌肤D能迅速将青枯菌菌体包围，作用于细胞膜，造成许多小孔并进入胞内，而后损坏的小孔形成喇叭口，细胞内含物由此泄出胞外，导致菌体变成空囊而死亡。在此基础上，他们将产生柞蚕杀菌肤D的基因导入按树，并获得了转基因植株提高了按树对青枯病的抗病力。田长恩等(2000)用花粉管通道法将柞蚕抗菌肤D基因导入番茄，得到了具有较强青枯病抗性的转基因后代。利用转基因植物进行防病增产应用，尽管在安全性方面还有许多争议，而且要想通过这种方法最终达到目的还需经过很长一段时间的努力，但它仍不失为一条极有希望的防病途径，值得探索。 综合目前各国防治研究的结果，要成功地控制烟草青枯病对烟草的为害，无论采用哪一种单一的防治方法都很难奏效，只有通过包括选用抗病品种、各项农业防治和化学防治的综合应用，一环扣一环，才能获得最佳的防治效果。 1.4蜂胶 蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂(树胶)，混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。 1.4.1蜂胶特性 蜂胶是蜜蜂用于维持整个群体健康的有效物质，一个5,6万只的蜂群一年只能生产蜂胶70,110克，被誉为“紫色黄金”。蜂胶生产期多为夏、秋季，我国的胶源植物大致有桦木科、杨柳科、松科、柏科和漆树科中的多数树种，以及桃、李、杏、栗、橡胶、桉树和向日葵等。蜂胶为不透明固体，表面光滑或粗糙，折断面呈砂粒状，切面与大理石外形相似。呈黄褐色、棕褐色、灰褐色、灰绿色、暗绿色，极少数深似黑 11 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 色。具有令人喜爱的特殊的芳香味。味微苦，略带辛辣味，嚼之粘牙，用手搓捏能软化。温度低于15?时变硬、变脆、易粉碎;36?时质软、有粘性和可塑性;温度达60~70?时熔化成为粘稠流体，并分离出蜂蜡。比重随不同植物种类而异，一般在1.112~1.136之间。不溶于水，微溶于松节油，部分溶于乙醇，极易溶于乙醚和氯仿。溶于95%乙醇中呈透明的栗色，并有颗粒状沉淀。纯蜂胶不应有其它杂质。 [58,59]1.4.2蜂胶的主要化学成分及差异性 天然蜂胶的基本成分一般是:树脂树香复合物39,—53,、多酚类12,—17,、多糖类2,—3,，蜂蜡19,—35,、杂质(含花粉等)8,—12,。各类蜂胶中已知的化学成分达300余种。主要包括高良姜素、乔松素等71种黄酮类化合物，肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸等59种芳香酸与芳香酸酯类化合物，肉桂醇等24种酚类、醇类和17种醛与酮类化合物，25种氨基酸，50种脂肪酸与脂肪酸酯，19种萜类化合物，6种甾体化合物，9种糖类化合物，25种烃类化合物等。同时，蜂胶中含有微量的维生素B族以及丰富的矿物质与微量元素。 由于蜂胶的产生受所处产地的地理环境因素影响很大，因此，来自于不同产地的 [59]蜂胶品种，在化学成分组成上也存在着细微的差异。例如:根据董捷等的研究报道，在智利蜂胶、巴西蜂胶、埃及蜂胶、新西兰蜂胶和索拉纳沙漠地区蜂胶中，都检出了各不相同的新化学成分。陈嘉南、黄中洋等人研究了台湾蜂胶的化学成分组成，发现台湾绿蜂胶的化学组成与其它地区产蜂胶的化学组成不同，目前已分离出10种具活性的蜂胶素(propolins)，它们属于prenylflavanones类的化合物，其中有6种是新的化合物。 1.4.3蜂胶中的主要活性物质 蜂胶是自然界中总酚含量最多的天然产物之一，其含量高出蔬菜、水果、植物药材的几万倍至几百万倍。它们作为蜂胶的主要活性成分发挥着重要的生理功效。蜂胶中的酚类化合物，主要包括黄酮类化合物、酚酸类化合物以及它们的缩合体。随着色谱、光谱等高效的分离分析技术的不断发展，不同地域蜂胶中新的酚类化合物组成和结构逐渐被分析鉴定出来。 1.4.4蜂胶中主要活性物质的功能 近年来，对于蜂胶的活性物质的功能研究较多，相关研究成果也很丰富。特别是 12 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 [60]对于蜂胶中黄酮类化合物的功能研究成果较为集中。根据陈国有等人的研究总结，蜂胶中的黄酮类化合物的生物活性主要有以下几方面。(1)对心血管系统的作用;(2)抗肝脏毒性作用;(3)抗炎作用及提高机体免疫力;(4)雌激素样作用;(5)抗菌及抗病毒作用;(6)清除自由基、抗氧化作用;(7)其他，包括止咳、祛痰、平喘以及中枢神经调节等作用。 [61][62]桑慧、徐颖等人着重研究了黄酮类化合物在抗氧化和清除自由基方面的作用机理与效果，研究表明，蜂胶中黄酮类化合物在抗氧化和清除自由基方面的作用效果明显，优于银杏黄酮，更加优于VC，是一种良好的抗氧化剂和自由基清除剂，故蜂胶对于自由基和脂质过氧化引起的多种疾病都有较好的治疗作用。 [63][64][65][66][67]卢兆芸、孟日增、许合金、赵强、Lucrecia L. Chaillou等人分别研究了蜂胶黄酮类化合物在食品保鲜、抗菌，畜牧业中的应用，以及蜂胶中挥发油的抗氧化活性，并阐述了相关机理。这些研究开拓了蜂胶活性物质的应用领域，也大大提升了蜂胶应用的前景，而其中的一些理论基础也为后续研究提供了参考与借鉴。 1.4.5蜂胶的应用 在食品工业上，为了使产品有一定的贮藏期，需要添加防腐剂，常使用的化学防腐剂有苯甲酸钠、尼泊金等，它们往往对食品的口味和人体健康产生不利的影响，而以蜂胶为原料制作的保鲜防腐剂，具有独特的优点:一是纯天然物质，对人体无毒无任何毒副作用，可以放心的应用于食品、饮料上;二是蜂胶中含有人体所必需的维生素、氨基酸、微量元素，有补充营养，促进健康的作用;三是蜂胶具有很强的杀菌能力，能抑制多种霉菌和微生物毒素。宋心仿、邵有全研究发现，以蜂胶为主料制成保鲜剂用作果蔬和鸡蛋保鲜，可先将药液与清水配兑成一定浓度的乳浊液，采用喷洒或浸渍方法处理被保鲜物，使其表面形成一层被膜，可有效的灭杀或抑制霉菌等微生物的侵袭，调节果蔬和鸡蛋的新陈代谢，防止水份散失，延长了保鲜期。试验组与对照组相比较，苹果减少烂果率7.94%和6.06%，失重率降低13.88%和11.00%;西红柿减少烂果率62.09%和59.68%，失重率降低51.55%和50.33%;菜椒减少烂果率12.07%和6.27%，失重率降低25.95%和12.22%。鸡蛋试验组在60天时大部分还比较完好， [68]而对照组则全部散黄，有的变臭，不能食用。汤凤霞、高飞云等用蜂胶乙醇提取液处理的鲜肉保藏期明显延长，且高浓度组比低浓度组效果显著。此外，由于蜂胶含有多种活性成分，具有增强人体免疫、抗菌、抗肿瘤等特性，可作为保健品开发。 蜂胶可作为畜禽的饲料添加剂。云南农业大学的研究者将蜂胶制剂按0.1%的比例作为添加剂加人到饲料中去，结果试验组的平均体重比对照组提高12.4%，每增重 13 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 1公斤，比对照组饲料消耗降低巧76%。利用蜂胶作为饲料添加剂，不但能使畜禽增重，提高畜禽的肉质，还对畜禽健康生长有所保证。因为蜂胶中具有抗多种病原微生物的作用，能有效地预防畜禽可能发生的许多疾病，减少饲料管理中的麻烦。 蜂胶很早作为木本植物嫁接时用的翁合剂。云南动物研究所等单位用95%的乙醇提取液(含蜂胶0.2%一2%)施用于稻瘟病菌、白叶粘病菌、棉花枯萎病菌、玉米茎病菌等病菌，表现了强烈的抑制作用。捷克斯洛伐克在温室内用10%蜂胶乙醇防治黄瓜花叶病、烟草斑点病和烟草坏死病都取得一定效果，使烟草坏死等有害病毒损害降低20%一50%。 利用蜂胶能保护皮肤湿润、防治皮肤教裂、控制冻伤的功能，用羊毛脂乳化成软膏，可制成“蜂胶护肤灵”;利用蜂胶抗菌抗病毒的作用和有软化骨质组织，并能自然脱落之功能，可用高脂肪醇等为基础原料，乳化制成“营养雪花膏”，其作用在于保护皮肤柔润、光泽、除疵去斑、防粉刺和皮肤炎症;利用蜂胶能杀菌止痒、且无刺激、无异味的特点，可配制于花露水中，成为“蜂胶花露水”，其效用可以提高花露水的清洁功能，达到消炎去痒、杀菌除癣和防治蚊虫叮咬，消除疮疖肿痛;利用蜂胶有很强的杀菌功能，可有效地控制皮肤表面微生物的生长繁殖，并能清除皮肤表面污垢，使皮肤失去生成扉子的条件，可以制作成“蜂胶痒子水”。 蜂胶在紫外线UVB和UVC范围内均有良好的吸收性能，能吸收和降低致红斑紫外光的辐射，则其可做成天然防晒剂。此外，由于皮肤上的分泌物，即不饱和脂肪酸的双键易氧化，引起体臭，而蜂胶中的类黄酮能够吸收氧自由基，有良好的抗氧化性，可应用于皮肤保健卫生方面，如皮肤净洗剂，以保护皮肤;还可利用蜂胶对牙周致病菌的抑菌作用，做成蜂胶牙膏。 蜂胶具有广谱抗菌作用，能治疗内外科的多种疾病，且久服无副作用。临床证实，对A型流感病毒、牛痘病毒、疹疙病毒等有灭活作用;对多种病原虫及白喉杆菌、破伤风杆菌、恶性水肿杆菌外毒素有理想的中和作用。我国一些大中医院把蜂胶药品用于临床，均显示出良好效果。解放军广州医学高校、上海第一医院等把蜂胶制剂用于细菌性炎症、真菌性皮肤病、白色念珠菌、抱子菌等引起的疾病，均表现出良好的效果。尤其令人可喜的是蜂胶制剂用于治疗癌症，已显示出很好的疗效。日本国防医学研究所松野哲也先生用蜂胶提纯液作肝癌细胞培养，7h后显示出病变作用，72h后癌细胞死亡。 蜂胶作为一种具有广泛应用前景的天然保健物质，其生物活性正越来越被人所重视。特别是近几年来，关于蜂胶的成分、提取工艺以及分析检测方法等方面的研究成果很多，这为我们进一步认识蜂胶、利用蜂胶打下了良好的科学理论基础。 14 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 1.5绿色有机烟草 1972年，国际上一个致力于拯救农业生态环境、促进健康安全食品的组织——国际有机农业运动联合会( 简称IFOAM) 应运而生。IFOAM所倡导的有机农业是一种农业发展的高级阶段，它将农业经济系统纳入到了自然生态系统的物质循环过程中。有机农业是遵照一定的有机农业生产标准，在生产中不采用基因工程获得的生物及其产物，不使用化学合成的农药、化肥、生长调节剂等物质，遵循自然规律和生态学原理，采取一系列可持续发展的农业技术，协调种植业和畜牧业的关系，促进生态平衡，保护生物多样性和资源可持续利用的农业生产体系。有机农业生产三要素中社 [69,70]会、经济和环境三者并不排斥，而是战略性和理性的整合。 发展有机农业的好处有很多，可减少对环境的压力，有利于生态环境的恢复:可以减少化肥、农药的使用，减轻环境的污染，从而提高农产品的质量，保障农产品的安全性;发展有机农业生产模式可以增加就业岗位，解决农村劳动力就业问题;有机农产品符合国际市场需求:增加出口可以给农民带来良好的经济效益，并且在缓解气 [71,72]候变化、发展低碳农业经济方面具有极大的潜力。 我国加入WTO后，烟叶市场日趋国际化，国外烟叶已直接参与国内烟叶市场的竞争。国外烟叶质量好、安全性好，但其与国内烟叶价格相近，导致了我国烟叶进口数量逐年增加，由此在很大程度上影响了国内烟叶的生产。而且随着2005年《烟草控制框架公约》的正式生效，必将推动控烟运动的高涨，愈会引起人们对于吸烟与健 [73-75]康的关注。有机烟叶的开发与生产也将成为必然的趋势。 1.5.1国内外有机烟叶发展现状 烟叶作为吸食农产品，其品质及安全性同样受到化学农药和无机肥的影响。随着人民生活水平的不断提高，卷烟消费者也同样希望有符合有机食品标准的卷烟。有机烟叶生产始于20世纪90年代，它是随着有机农业的发展顺势而产生的，并且有不断增长的趋势。目前在美国、加拿大、德国和巴西等国已开展了有机烟叶生产。 2001年，一家独立的叶丝生产商Proto企业开始生产100%有机烟草叶丝，成为罗马尼亚第一家不使用杀虫剂和化肥生产烟草产品的公司;同时，他们的产品不添加任何化学产品，不对烟草进行膨胀处理就加工为叶丝。从加工到最终产品完成的整个过程，包括卷烟、自卷烟和管烟都保证不含不会被授予有机产品的添加剂;卷烟纸和胶水也将获得认证;采用最新烟草烘烤技术，使致癌物质含量较低。目前意大利北部 Tiber山谷的上游也种植了几百公顷的有机烟草，罗马尼亚的Proto烟草工厂将其加工 15 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 成烟丝。 美国收购有机烟叶公司Santa Fe Natural Tobacco Co(自1997年开始与北卡、南卡、肯塔基、弗吉尼亚、田纳西、俄亥俄等州签订购销协议，与该公司有购销关系的有机烟叶生产商已多达43个。该公司在美国收购的有机烟叶总量从1999的40.86t递增到2001年的186.14 t。美国Sotoya Ceremonial Tobacco Company是以销售有机和天然烟叶为特色的批发商，销售的产品包括维吉尼亚型、肯塔基型、MYO、RYO有机烟叶;北美是其主要市场，有机烟叶的年销售额为100万美元。美国农业部在2002年10月实施了一套“国家有机项目”( NOP) 的标准。 加拿大涉及有机烟叶的公司有3个，Original Tobacco Company NC是第1个得到销售许可的有机烟叶销售商。2005年秋季Mother Earth Tobacco公司的第1个Ceremonial Tobacco产品开始销售，其产品采用100%的有机烟叶加工而成。2006年11月6日根据《Act Respecting Reserved Designations and Added-Value Claims》( L(R(Q( ，chapitre A 2 22.03)由魁北克政府成立了OCPP/Pro-Cert Canada Inc，其目的是保护通过基于来源、特殊性或特征性有关的生产方式和特异性的产品证书，以及所使用认证产品、产品时限的确实性，其操作所涉及的国家包括保加利亚、古巴、加拿大、塞尔维亚、美国。 YUMA公司花了5年在巴西推广生产有机烟叶，成为目前第1家完全用有机烟叶生产有机卷烟的企业。印度烟草公司派遣了由3名成员组成的核心委员会到麦索( Mysore)地区，开展模范烟农项目来提高当地的出口烟草质量。重点是通过有机种植 [76,77]方法开发“安全”烟草。 在我国，2001年国家烟草专卖局科教司提出开展“无公害”烟叶的研发，2002年大理州烟草公司提出“绿色烟叶”的研发，2007年提出特色烟叶开发重大专项。2008年国家烟草专卖局将无公害烟叶工程作为国家烟草重点攻关项目提出，标志着有机、 [78]绿色烟叶的研发在国内正式启动。2007年云南中烟工业公司原料部与宾川县烟草分公司合作在宾川县拉乌乡进行了有机烟叶生产的初步探索，在国内尚属首次，旨在对有机烟叶生产地环境条件和有机烟叶农药、重金属残留量进行评估，为规模生产有机烟叶及其在卷烟工业上的使用作前期研究。2008年云南中烟工业公司《云南特色有机、绿色烟叶及其生产技术标准研发》项目立项，标志着有机、绿色烟叶的研发在国内正式启动。该项目分2个层面分别在云南中烟工业公司和所属红塔、红云红河2个集团和集团相应的州( 市) 公司烟叶基地开展。项目将研发有机、绿色烟叶产地环境评价体系;有机、绿色烟叶生产、加工技术标准规程;有机、绿色烟叶产品质量标 [76]准;完成有机、绿色烟叶相关认证、包装及其烟叶工业可用性评估等。随后，山东、贵州、四川、安徽等各烟叶公司与工业公司也相继开展有机烟叶的研究与开发。 16 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 1.5.2有机烟叶种植技术体系研究 围绕有机烟叶的环境评价，大量烟草科研部门开展了烟叶的生产技术以及有机烟叶的质量评价等方面的相关研究。北卡州立大学结合传统烟叶生产，提出了许多适应有机烟叶生产的技术措施。他们先后开展了认证有机烟叶生产用氮肥替代品的研究、有机烟叶成苗的移栽试验、有机烟叶栽后的田间评估。南印度卡纳塔喀省胡苏尔( Hunsur) 的印度中央烟草研究所,Central Tobacco Research Institute( CTRI) ,发布了他们对有机烟叶的研究结果:应用于卷烟中的有机烟叶的烟碱、焦油和一氧化碳等有害物质含量更少，通过有机农场生产更安全的卷烟产品是可能的，有机烟叶的颜色较常规偏淡，使烟叶质量更出色、更稳定。但是研究者也指出，与常规烟叶相比，有机烟叶有害物质百分数的下降是建立在减产35%的基础之上的，因此，弥补有机烟叶与常规烟叶间的产量差距也是当前研究的重点之一。此外，烤烟品种的研究是一个重点，研究者期望新一代品种不但能保持有机烟叶低烟碱、低焦油以及亚硝氨( TSNA) 的基 [79]础，而且能在有机烟叶与常规烟叶产量上架起一座桥梁。贵州有机生态烟叶质量特色研究表明:有机生态烟叶和常规栽培烟叶在外观质量、常规化学成分和感官质量之间存在差异。有机生态烟叶色泽及油分好于常规生产烟叶;有机生态烟叶比常规生产烟叶的总糖、还原糖含量高，总植物碱、总氮含量低，主要化学成分含量适宜，比例协调。由此，可认为有机生态烟叶可获得比常规生产烟叶更好的质量。此外，研究发现有机生态烟叶的钾含量略低于常规生产烟叶，因此进一步提高有机生态烟叶的钾含量，进而提高有机生态烟叶的质量和可用性也是有机生态烟叶需进一步研究的问题[80]。 要实现有机烟叶的生产，必须根据有机食品的要求，在不使用基因工程获得品种，不施用化学肥料、化学除草剂、化学杀虫剂的情况下，合理地解决基地的选种和栽培、 [81]土壤培肥、病虫草害防治等问题。为实现有机烟叶生产技术体系，各个国家都发展形成了各自成体系的一套种植模式和相关技术:种植系统包括土壤管理、作物区划与栽培管理两方面，在提高土壤质量、实现土壤可持续利用的同时，保证作物稳产，以提高经济效益;结合区域生产实际和市场需求制定整体的生产安排及其与生产活动相适应的管理体系，确保按照有机农业生产标准进行。 借鉴国外有机农业种植技术体系，有机烟叶种植体系应包括:?保持时空的多样性和连续性。为了保护土壤，保持农产品的稳定生产和长时间的植被覆盖，同一区域内既要有合理的种植作物布局与间作、轮作制度，又要保留非生产作物的生长区域，达到保证稳定和多样化的产品供应、多种作物共存，增加田间作物光合时间与光合面积，提高单位面积作物产量，也为天敌等益虫生物提供适宜的生存环境，增强农业生 17 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 产系统的稳定性。?保证养分循环的封闭性。有机农业经常通过保持养分、能量、水分和废弃物等在系统内部的闭合循环来维持土壤肥力，通过从农业生态系统的有机畜牧养殖中收集有机肥来培肥土壤，或者是通过适当的土壤耕作和农艺活动 ( 如土地休闲、轮作) 来维持土壤肥力，以减少对外在环境的依赖。?提高作物的自我调控系统和作物保护能力。不同作物和品种的间、套、混种有利于控制病虫的危害，也有利于控制杂草的生长。采用合理的栽培技术，如增加覆盖、调整播期和成熟期、利用抗 [82]性品种、应用植物杀虫剂及驱虫剂等，使农业生产系统病虫危害减到最小。 1.5.3我国有机烟叶的发展优势与对策 1.5.3.1发展优势 首先，我国的传统农业有着悠久的历史，在精耕细作、用养结合、农牧结合等方面都积累了丰富的经验，这也是有机农业的精髓。其次，我国地域广阔，农业生态景观多样，生产条件各不相同，在偏远山区或贫困地区，农民很少或完全不用化肥农药，为有机农业的发展提供了有利的发展基础。第三，有机农业是劳动力密集产业，而我国农村劳动力众多，这有利于有机农业的发展，也可以解决大批农村剩余劳动力。第四，中国加入世贸组织后，农产品的出口会受到绿色非贸易壁垒的限制，发展有机食品与国际接轨，可以开拓国际市场。另外，我国人民生活水平不断提高和对环境意识的不断增强，国内对有机食品的需求在近几年将有较快增长，因此有机食品在国内外 [79]发展潜力巨大。这些都为我国发展有机生态烟叶提供了坚实的基础和广阔的前景。 1.5.3.2对策 (1)建立有机烟叶生产基地及评价体系。目前我国没有制定相关有机烟叶的标准，而国家标准《有机产品》只对作物种植产地环境条件和有机产品加工作了原则性的规定和通用与要求，没有相关的产品质量标准。有机烟叶的生产可参照相关国家标准，借鉴其他有机产品质量标准，从有机烟生产基地建设入手，对烟叶生产技术进行系统研究，对制定相关的标准与生产技术规程进行探索，建立有机烟叶生产基地及其 [78]评价体系。 (2)建立有机烟叶生产技术体系。导入低碳循环经济理念，研究有机烟叶标准化生产技术体系，开展有机烟叶的品种选择试验，加大抗病优良品种筛选;构建有机种植体系;加强烟叶病害的预测、预报及防治研究，推广物理、生物防病防虫技术; 采用有机肥料施用技术，全面实施保健栽培;加强生产组织管理模式创新，建立一站式联程绩效考核管理、科技联产承包责任制等制度，不断完善有机烟叶生产体系。 (3)建立健全有机烟叶管理、生产和监控评价体系。建立和完善“有机烟叶产地管 18 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 理办法和实施细则”、“有机烟叶生产技术标准体系”、“有机烟叶质量安全与评价标准” [83,84]等系列配套标准和管理规范，完善管理认证、生产控制、监督评价三大体系。 (4)加强有机烟叶生产及理念的普及。通过宣传教育，提高烟叶生产者和管理者的生态、环保和有机意识，同时加大培训力度，培训一大批农业科技骨干与科技烟农，通过典型引导、技术辅助、生产示范等措施，提高其科技致富的能力与自觉性，加速无公害烟叶生产技术的推广。 (5)完善对有机烟叶收购、工商交接、复烤加工的管理。有机烟叶较传统烟叶生产费工费时，尤其是增加了病虫防治、抑芽等环节的劳动强度。因此，必须提高对有机烟叶的收购价格，才能确保烟农按照标准来种植。同时，还应针对性地规范有机烟叶分级、工商交接、复烤等环节的管理。在有机卷烟产品的开发方面，至少存在 3 种类型:?有机卷烟，其产品以100%有机认证烟叶为原料，适量使用添加剂，以形成卷烟产品的特定风格;?生态卷烟，其产品以常规烟叶为原料，配方中不使用添加剂;?有机生态卷烟，其产品以100% 有机认证烟叶为原料，且配方中不使用添加剂。各种类型卷烟产品对烟叶原料的要求不同，应针对性制订每一种产品的原料要求、包装 [79,81]设计及风格设定。 有机烟叶是现代农业可持续、健康、环保、低碳发展的方向之一，必将受到广大消费者的青睐。但是，由于生产有机烟叶存在劳动力强度大、对环境及生产技术要求高，而且存在一定的自然风险和社会经济风险，所以必须切实地从系统、长远和高品质的角度，结合当地的实际情况，小面积小范围内适时适地发展有机烟叶，不断地深化和灵活运用有机农业的理念，解决好有机烟叶生产技术关键，积累经营管理经验，更好地规划和指导有机烟叶生产销售和利用工作，保证有机烟叶的健康、和谐发展。 1.6本实验的目的及意义 烟草青枯病是危害烟草最重要的病害之一，通过烟草青枯病不同品种的抗性鉴定，分辨出感病和抗病品种，为农民种植烟草提供品种选择的依据。 目前生产中对烟草青枯病的防治依然是以化学防治为主，但是化学农药存在不易分解、污染环境、易产生抗药性等不好因素，尤其在抗药性方面面临严峻的考验。长期使用同一种农药或者高浓度的使用一种农药，能够使病虫害产生抗药性，出现抗药性的病原，同时也导致在生产中不断淘汰旧农药开发新的农药周期越来越短，而一种新的农药开发需要花费大量的人力物力。因此生产上需要不断的研究开发新的更安全更科学的农药新产品。而天然生物源农药与化学农药相比具有低毒、无残留、选择性高，不易使害虫、病原菌产生抗药性的特点，是一种与环境有良好相容性的新型环保农药，成为开发心农药的特点。因此本实验中，采用天然有机化合物蜂胶作为潜在的 19 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 生物源农药，进行蜂胶对病原菌的室内抑菌效果试验，寻找生物药剂防治该病害的可能性。 目前正在推广有机、绿色烟叶生产种植，尤其不能使用任何人工合成的农药与化肥，所以寻找生物源农药势在必行。现在生产中多使用农用链霉素，但是从2011年国家已经开始限制农用链霉素的使用了，所以寻找新的生物源农药迫在眉睫。 本实验室的研究已经证明，蜂胶对多种烟草上的真菌病害具有良好的防治效果，但是还没有人对细菌病害做过系统的测试。所以本实验通过药敏试验、盆栽试验和田间药效试验来测试蜂胶对烟草青枯病这种细菌病害的防治效果，为其防治烟草青枯病提供初步依据，以寻找一种可代替化学农药的生物源农药，用于有机、绿色烟叶的生产中。同时，通过抗性鉴定试验，找到抗病品种，也有助于控制烟草青枯病的发生。 在室内药剂筛选实验中，对比了蜂胶与农用链霉素对青枯假单胞杆菌的抑制作用，大致了解蜂胶与化学防治的差距，为以后的实验工作提供理论基础。在盆栽实验与田间药效实验中，通过测试蜂胶这种生物源药物对烟草青枯病的防治效果，为其防治青枯病提供初步依据。 2.材料与方法 2.1 材料 2.1.1菌种 从云南农业大学植物保护学院细菌实验室分离培养获取烟草青枯病菌后，将菌种在TTC培养基上培养48h，用接种环挑取单菌落(连带培养基)放入带无菌水的离心管，密封，室温保存。用的时候要进行复壮，将保存的菌种采用划线方法接种于TTC培养基上，置于28?培养箱中进行扩大培养，48h后，将菌配成一定浓度的菌液，用灭过菌的医用注射器接种到烟苗的茎基部。发病后，再从病部分离纯化得到烟草青枯病菌。 2.1.2培养基 采用TTC培养基: 称取5gTTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)，加水100ml，121?高温灭菌8min， 20 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 制备好TTC溶液，保存于4?冰箱里。称取蛋白质10g，水解酪蛋白1g，葡萄糖10g，琼脂17g，加水至1000ml，经121?高温灭菌30min。待冷却至45?左右时加入1ml制备好的TTC溶液。 2.1.3供试烟苗 红花大金元、NC297、MSK326、云87、云97 2.1.4供试药剂 (1)72% 农用链霉素，可湿性粉剂，由石家庄曙光制药厂生产，生产批准文件号为HNP13085-D0582。 (2)90%多菌灵，水分散粒剂，由上海禾本药业有限公司生产，生产批准文件号为HNP31071-D4301。 (3)蜂胶，由云南农业大学蜜蜂研究所提供，用95%乙醇配制成20%蜂胶溶液保存。 2.1.5实验仪器 电子天平，注射器，移液枪，水浴锅，恒温培养箱，光照培养温室由植物保护学院昆虫实验室提供。 2.2试验方法 2.2.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验 (1) 注射接种 预备实验中通过针刺接种与注射器接种的比较，发现注射接种更易让烟苗发病，故选择此接种方法进行致病性实验。具体方法是将复壮后的菌种扩大培养48h后，制 8成菌液，浓度约为3×10cfu/ml。用医用注射器吸取菌液接种到烟苗茎基部，每株注射1ml，并用带菌液的脱脂棉包好伤口，使其持续侵染。共5个品种，每个品种30株，重复3次，并设清水对照。每天观察并烟苗生长情况及发病情况。 [85](2)病情分级标准: 21 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 0级:全株无病; 1级:茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎; 2级:茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎; 3级:茎部黑色条斑到达植株顶部，或病侧三分之二以上叶片调萎。; 4级:病株基本枯死。 (3)致病程度分级标准: 病情指数在0——25.0为高抗(O);病情指数在25.1——50.0为中抗(L);病情指数在50.1——75.0以上为中感(M)，病情指数在75.0以上为高感(H)。 附: 2.2.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验 (1)将青枯假单胞杆菌用划线方法接种在TTC培养基上，置于28?培养箱中 8培养48小时后，用无菌水洗下菌落，制成菌液。再用稀释法制成浓度为3×10cfu/ml的菌液。 (2)将不同药剂处理分别配成不同的浓度梯度: 链霉素:称取0.1g 72%农用链霉素，加入10ml无菌水，配成100倍液，72%农用 然后依次稀释成200倍液，400倍液，600倍液，800倍液。 90%多菌灵:称取0.1g 90%多菌灵，加入10ml无菌水，配成100倍液，然后依次稀释成200倍液，400倍液，600倍液，800倍液。 蜂胶:用移液枪移取0.5ml 20%蜂胶溶液，加入10ml无菌水，配成100倍液，然后依次稀释成200倍液，400倍液，600倍液，800倍液。 复配I:0.1g 72%农用链霉素:0.5ml 20%蜂胶=1:1，再加入10ml无菌水中，配成50倍液，然后依次稀释成100倍液，200倍液，300倍液，400倍液。 复配II:0.1g 90%多菌灵:0.5ml 20%蜂胶=1:1，再加入10ml无菌水中，配成50倍液，然后依次稀释成100倍液，200倍液，300倍液，400倍液。 对照:分别设置无菌水对照和乙醇对照。乙醇对照为:取8ml 75%乙醇，加入2ml无菌水，配成母液;然后根据蜂胶处理组中乙醇的浓度，分别配成相应浓度的乙醇浓度，作为对照。 (3)用涂抹棒将制备好的青枯假单胞杆菌菌液均匀涂布在培养基上。 (4)将滤纸片放入各处理药剂中吸取药液，然后放到培养基中间，每个浓度三 22 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 个重复，分别设置清水对照和乙醇对照。 (5)调查测量培养24h、48h后的抑菌圈大小。 (6)使用Excel和DPS数据分析软件进行但因素方差分析，并用LSD法比较各处理之间的差异显著性。 2.2.3室内盆栽试验 (1)材料 烟苗选用MSK326，为中感品种。采用72% 农用链霉素和20%蜂胶进行喷药处理，浓度分别为1:800和1:100。 (2)方法 将育好的烟苗移栽到一次性纸杯中，采用注射接种法进行接种。接种后第七天用喷壶对烟苗的茎部以及叶片进行喷药处理。每个处理30株，重复3次，并设置清水对照。总共3个处理，分别为A组:72%农用链霉素800倍药液进行喷药处理;B组:使用20%蜂胶100倍药液进行喷药处理;CK组:清水对照处理。每天观察并记录烟苗生长情况及发病情况。使用Excel和DPS数据分析软件进行但因素方差分析，并用LSD法比较各处理之间的差异显著性。 [85](3)病情分级标准: 0级:全株无病; 1级:茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎; 2级:茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎; 3级:茎部黑色条斑到达植株顶部，或病侧三分之二以上叶片调萎。; 4级:病株基本枯死。 (4)致病程度分级标准: 病情指数在0——25.0为高抗(O);病情指数在25.1——50.0为中抗(L);病情指数在50.1——75.0以上为中感(M)，病情指数在75.0以上为高感(H)。 附: 23 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 2.2.4田间药效试验 (1)供试药剂 供试药剂为20%蜂胶(1:100倍液)及72%农用链霉素(1:800倍液)。 (2)试验地概况 试验地设在会泽县迤车镇，田间管理及施肥同当地正常水平，并按照云南省优质烟栽培技术规范操作。供试品种为MSK326。 (3)实验设计 试验设3个处理，3次重复，共计9个小区，每个小区栽30株 2烟苗，小区面积为22m，小区为完全随机排列，四周设保护行。3处理分别如下:A组:72%农用链霉素800倍液;B组:20%蜂胶100倍液; CK:清水对照。 (4)实验方法 A组:使用72%农用链霉素作为处理药剂进行喷雾施药;B组:使用20%蜂胶作为处理药剂进行喷雾施药;CK:使用清水作为对照处理进行喷雾施药。每天观察并记录烟苗生长情况及发病情况。 (5)使用Excel和DPS数据分析软件进行但因素方差分析，并用LSD法比较各处理之间的差异显著性。 附: 3.结果分析 3.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验 从36天的调查结果中分别选取其中6天的数据进行分析: 24 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 表2 8月7日调查结果(发病初期) Table 2 The results of the August 7th(Early onset) 发病率死亡率病指 0级 I级 II级 III级 IV级 抗病性 /% /% /% CK 30 0 0 0 0 0 0 0 \ 25 3 2 0 0 16.67 0 11.67 \ 红大 297 24 4 2 0 0 20 0 13.33 \ 326 26 3 1 0 0 13.33 0 8.33 \ 87 23 4 3 0 0 23.33 0 16.67 \ 97 28 2 0 0 0 6.67 0 6.67 \ 表3 8月14日调查结果(发病中期) Table 3 The results of the August 14th(Mid-onset) 发病率死亡率病指 0级 I级 II级 III级 IV级 抗病性 /% /% /% CK 30 0 0 0 0 0 0 0 \ 5 10 9 6 0 83.33 0 51.11 M 红大 297 12 15 3 0 0 60 0 35 L 326 13 7 9 1 0 56.67 0 31.11 L 87 10 7 7 6 0 66.67 0 43.33 L 97 18 8 4 0 0 40 0 26.67 L 表4 8月21日调查结果(发病中期) Table 4 The results of the August 21st(Mid-onset) 0级 I级 II级 III级 IV级 发病率死亡率病指抗病性 /% /% /% CK 30 0 0 0 0 0 0 0 \ 1 3 8 7 11 96.67 36.67 70 M 红大 297 8 11 11 0 0 73.33 0 55 M 326 7 7 10 3 3 76.67 10 40 L 87 3 7 7 3 10 90 33.33 58.33 M 97 6 10 10 4 0 80 0 46.67 L 25 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 表5 8月28日调查结果(发病中后期) Table 5 The results of the August 28th(Mid-and late onset) 发病率死亡率病指 0级 I级 II级 III级 IV级 抗病性 /% /% /% CK 30 0 0 0 0 0 0 0 \ 1 2 7 2 18 96.67 60 78.33 H 红大 297 8 9 8 4 1 73.33 3.33 34.17 L 326 7 7 8 3 5 76.67 16.67 43.33 L 87 3 3 9 2 13 90 43.33 65.83 M 97 6 8 9 4 3 80 10 41.67 L 表6 9月4日调查结果(发病后期) Table 6 The results of the September 4th (Late onset) 发病率死亡率病指 0级 I级 II级 III级 IV级 抗病性 /% /% /% CK 30 0 0 0 0 0 0 0 \ 1 1 4 2 22 96.67 73.33 85.83 H 红大 297 6 7 9 5 3 80 10 43.33 L 326 7 2 7 4 10 76.67 33.33 56.67 M 87 3 1 5 6 15 90 50 74.17 M 97 4 1 11 6 8 86.67 26.67 60.83 M 表7 9月11日调查结果(发病末期) Table 7 The results of the September 11th (Final onset) 发病率死亡率病指 0级 I级 II级 III级 IV级 抗病性 /% /% /% CK 30 0 0 0 0 0 0 0 \ 1 0 4 0 25 96.67 83.33 90 H 红大 297 6 6 10 5 3 80 10 44.17 L 326 5 2 5 6 12 83.33 40 65 M 87 3 1 5 3 18 90 60 76.67 H 97 4 1 10 6 9 86.67 30 62.5 M 26 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 100 90 80 70 60红大 50297 40326病情指数 3087 9720 10 0 8.78.148.218.289.49.11 日期 图1 五个品种的病情指数变化曲线 Figure 1 The curve chart of disease index about five varieties 从图1中可以看出: 红花大金元:随着接种时间的增加，病情指数持续变大，发病越严重，病情指数超过了75，为高感品种。 NC297:在发病中期的时候病情指数发生了变动，可见这一时期对青枯病的抗性有所提高。病情指数在55以内，为中抗品种。 MSK326:随着接种时间的增加，病情指数持续变大，发病越严重，病情指数在75以内，为中感品种。 云87:随着接种时间的增加，病情指数持续变大，发病越严重，病情指数超过了75，为高感品种。 云97:在发病中期病情指数发生了变化，说明这一时期对青枯病的抗性有所提高。到了后期又迅速升高，抗性又降低了。病情指数在75以内，为中感品种。 3.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验 27 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 表1各药剂对青枯假单胞杆菌的抑制效果(48h) Table 1 The inhibiting effect of diffent medicaments on Pseudomonas solanacearum 农用链霉素 多菌灵 蜂胶 复配I 复配II 抑菌圈抑菌圈抑菌圈抑菌圈抑菌圈直浓度 直径浓度 直径浓度 直径浓度 直径浓度 径(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) 3.03Aa 1.03Cc 0.37Dd 2.10Bb 0.17Dd 100倍 100倍 100倍 50倍 50倍 2.53Aa 0.97Cc 0.13Dd 1.80Bb 0.03Dd 200倍 200倍 200倍 100倍 100倍 2.00Aa 0.83Cc 0.07Dd 1.57Bb 0.03Dd 400倍 400倍 400倍 200倍 200倍 1.98Aa 0.80Bc 0.10Cd 1.10Bb 0.01Cd 600倍 600倍 600倍 300倍 300倍 1.10Aa 0.80Aa 0.10Bb 0.93Aa 0.01Bb 800倍 800倍 800倍 400倍 400倍 3.2.1农用链霉素的抑菌活性 从表1中可以看出，由药敏片法测得，农用链霉素5个浓度对青枯假单胞杆菌都表现出了较好的抑菌活性。抑制效果随着浓度的降低而降低，浓度越高，抑制效果越好。 3.2.2多菌灵的抑菌活性 从表1中可以看出，由药敏片法测得，多菌灵5个浓度对青枯假单胞杆菌都有抑菌活性，但是效果较差。抑制效果随着浓度的降低而降低，浓度越高，抑制效果越好。 3.2.3蜂胶的抑菌活性 从表1可以看出，由药敏片法测得，蜂胶5个浓度对青枯假单胞杆菌都有抑菌活性，但是效果很差。当浓度在400倍以下时，基本没有抑制作用。 3.2.4复配I(农用链霉素+蜂胶)的抑菌活性 从表1可以看出，复配I五个浓度对青枯假单胞杆菌也有抑菌效果，每个浓度梯度的抑菌效果均低于相对应的农用链霉素的抑菌效果。在浓度高时，两者之间存在显著差异;当浓度达到800倍时，差异不显著。所以从这组实验数据可以得出，复配I 28 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 对青枯假单胞杆菌在高浓度时有抑制效果，随着浓度的降低，抑制效果减弱。通过与同浓度农用链霉素的抑菌效果的比较，可以看出蜂胶没有增效作用，且在高浓度下产生拮抗作用。 3.2.5复配II(多菌灵+蜂胶)的抑菌活性 从表1可以看出，复配II在100倍浓度时，抑菌圈直径只有0.17cm，随着浓度降低以后，抑菌圈直径也减小，基本没有抑制效果。 3.2.6几种药剂处理对烟草青枯病防治的综合评价 通过方差分析可以看出，这几种不同的药剂处理间差异比较大，农用链霉素的抑制效果最好，多菌灵的抑制效果较差，蜂胶的抑制效果最差，在浓度低于800倍时，农用链霉素与多菌灵的抑制效果并没有显著差异。蜂胶与农用链霉素的复配药剂抑制效果也较好，但没有农用链霉素单药剂使用时效果好，说明蜂胶并没有增效作用。蜂胶与多菌灵的复配药剂基本没有抑制效果。 3.3室内盆栽药效试验 表8 两种药剂的盆栽实验效果 Table 8 The effect of two medicaments in the pot experiment 用药后7d 用药后14d 用药后21d 发病发病发病 病指病指防效病指防效率防效(%) 率率(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 6.67 6.67 78.56Aa 20.00 12.50 71.15Aa 33.33 22.50 65.38Aa A组 46.67 22.22 28.58Bb 63.33 34.17 21.14Bb 73.33 56.67 12.82Bb B组 CK 56.67 31.11 / 76.67 43.33 / 83.33 65.00 / (附 A组:使用72%农用链霉素作为处理药剂进行喷雾施药;B组:使用20%蜂胶作为处理药剂进行喷雾施药;CK组:使用清水作为对照处理进行喷雾施药) 从表8中可以看出，农用链霉素的防治效果最高达到78.56%，即使施药后时间推移，其防效逐渐降低，但是最低也保持在65%以上，防治效果很好。蜂胶的防治效果不到30%，防治效果比较差，且随着施药后时间的增加，防治效果越来越差。通过方差分析已看出，两种药剂的防治效果差异明显，与室内药剂筛选结果保持一致。 29 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 3.4田间药效试验 表9 两种药剂的田间实验效果 Table 9 The effect of two medicaments in the field efficacy experiment 施药后7d 施药后14d 施药后21d 发病 病指防效 发病率病指 防效 发病率 病指防效 率 (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 0 0 100Aa 10.00 6.67 79.99Aa 16.67 10.00 76.47Aa A组 20.00 13.33 11.13Bb 40.00 24.44 26.67Bb 50.00 30.83 27.46Bb B组 CK 23.33 15.00 / 53.33 33.33 / 66.67 42.50 / (附 A组:使用72%农用链霉素作为处理药剂进行喷雾施药;B组:使用20%蜂胶作为处理药剂进行喷雾施药;CK组:使用清水作为对照处理进行喷雾施药) 从表9中可以看出，田间药效实验中，农用链霉素的防治效果达到了75%以上，防治效果很好;蜂胶施用后，随着天数的增加，其防治效果增高，但最大也只达到27.46%，防治效果较差。大田实验的结果与盆栽实验的结果基本保持一致。 4.讨论 4.1烟草青枯病的接种方法 在预备实验中，选用红花大金元作为供试烟苗，分别采用针刺接种与注射接种对红花大金元进行侵染接种。针刺接种方法具体操作为用针在烟苗茎基部对称方向分别刺4下，然后用带菌液的脱脂棉包裹好伤口;注射接种方法具体操作为用注射器吸取菌液后刺入烟苗茎基部，分别在左右两侧不对称方向分别注射，然后用带菌液的脱脂棉包裹好伤口。最后发现，用注射接种方法侵染接种的烟苗发病快，且发病严重，针刺接种方法侵染接种的烟苗发病慢，且发病较轻。故选择注射接种方法作为致病性实验和盆栽实验的接种方法。 4.2五种烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗性 从调查的数据结果中可以看出，在发病30天后，红花大金元与云87的死亡率已达到60%以上，病情指数大于75%，属于高感品种;MSK326和云97的死亡率分别为40%和30%，病情指数在65%以下，属于中感品种;NC297的死亡率仅有10%， 30 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 病情指数在50%以下，为中抗品种。 此外，分别给出了从发病初期开始，每隔7天的调查结果，这样，更能说明品种的抗性。红花大金元从开始发病到结束，病情指数不断增大，发病中前以前病情指数已达到70%，从发病中后期开始，病情指数均在75%以上，说明红花大金元是一个高度感病的品种。NC297从开始发病到发病中期，病情指数不断增大，且增大很快，说明这段时间应是NC297的发病高峰期，然后病情指数就急速减小，说明这段时期之内NC297表现出了明显的抗病性。之后，病情指数波动不大，一直保持在50%以下，说明NC297是一个中抗品种。MSK326从开始发病到结束，病情指数不断增大，始终不超过75%，是中感品种。云87从开始发病都结束病情指数一直在增大，在发病后期的时候病情指数达到了74.17%，接近于75%，在发病末期的时候超过了75%，说明云87也是一个高感品种。云97从发病到结束，病情指数的总体趋势是不断增大的，但是在中期到后期的时候病情指数发生了波动，发生了小幅度减小，之后又快速增大，这一变化趋势说明了云97在发病中期到后期的时候产生了不明显的抗病性，但后期病情指数均保持在50%到75%，所以云97也是一个中感品种。 此实验显示的结果与生产实践大致吻合。红花大金元因为产量高等因素是云南主要种植的烟草品种，但由于其对青枯假单胞杆菌的抗性较低，所以发病严重，烟草青枯病对其造成的损失也较大。虽然病害的发生与其他自然因素与农事操作也密切相关，但是从根本来说还是红花大金元的抗病性差。 4.3蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果 因为蜂胶不溶于水，故蜂胶溶液是用75%乙醇配制而成的。所以蜂胶的抑菌圈直径应为蜂胶处理组的测量直径减去乙醇对照组测量的直径，这样就可以避免蜂胶中乙醇对青枯假单胞杆菌的影响。 本实验结果显示，蜂胶在100倍浓度时抑菌圈直接为0.37cm，200倍浓度时抑菌圈直接为0.13cm，当浓度在400倍以下时，抑菌圈直接不超过0.1cm，可见，虽然蜂胶对青枯假单胞杆菌有抑制作用，但是抑制效果不佳。与农用链霉素相比，抑菌圈大小差别较大，故抑制效果差别也很大。本实验前后总共重复了三次，结果基本保持一致。可见，蜂胶这种天然生物源药物对青枯假单胞杆菌的抑制效果并不好。 4.4蜂胶对烟草青枯病的防治效果 蜂胶对烟草青枯病的防治效果分为盆栽实验和田间药效实验两部分。这两部分实验结果基本保持一致，与室内药剂筛选的结果相符合。其结果都表明了蜂胶对烟草青 31 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 枯病的防治效果不佳。 4.5盆栽试验与田间药效试验中防效的比较 盆栽实验与田间药效实验中侵染接种方法有所不同。盆栽实验采用的是注射接种方法对烟苗进行侵染接种，而田间药效实验则是不采用任何接种方法，让烟苗在自然条件下发病。所以盆栽实验中对照发病快速且发病严重，田间药效实验发病慢且发病较轻。由于接种方法的不同，以及生长环境也不一样，所以导致其防治效果也不同。对于农用链霉素，在施药后相同时间内，田间药效实验的防治效果比盆栽实验好，但其变化趋势一样，而且防治效果都很好，这充分说明了农用链霉素对烟草青枯病具有非常好的防治效果。对于蜂胶，无论是盆栽实验还是田间药效实验，其防治效果都不好，但两者的变化趋势却有不同。盆栽实验中，蜂胶防效的变化趋势是随着施药后时间的推移防效逐渐降低，而田间药效实验中，蜂胶防效则是随着施药后时间的推移防效逐渐增加。分析其原因，主要是一方面在发病中前期，盆栽实验发病快速且严重，蜂胶的对烟草青枯病的防效表现得明显，而田间药效实验发病慢且较轻，蜂胶对烟草青枯病的防效不明显。随着时间的推移，田间药效实验中对照发病越来越严重，于是蜂胶的防治效果开始明显表现出来，但是依然不高。 此外，盆栽实验与田间药效实验中烟苗的生长环境也不一样。盆栽实验中烟苗生长在温室里，通过人工调节温度、湿度等，而田间药效实验中烟苗则是生长在田间，与生产实践中是一样的环境条件，所以田间药效实验的结果应该更加准确可靠。 4.6烟草青枯病的防治 综上所述，农用链霉素对烟草青枯病具有良好的防治效果，是目前生产中主要的防治措施。同时通过种植中抗品种NC297，以及配合其他的农事操作来进行综合防治，从而达到控制缓解烟草青枯病带来的严重损失。由于绿色烟草的种植过程中不能使用一切人工合成的化学农药，所以就不能使用农用链霉素了。然而蜂胶作为一种生物源农药，对烟草青枯病具有一定的防治效果，在有机、绿色烟叶种植过程中具有一定的价值和意义。 5.结论 5.1青枯假单胞杆菌用注射接种方法侵染接种烟苗发病快速且发病严重，适于本 32 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 实验研究。 5.2抗病性试验说明，红花大金元与云87为高感品种，MSK326与云97为中感品种，NC297为中抗品种，生产种植中应选种NC297。 5.3药剂筛选试验说明，蜂胶对青枯假单包杆菌的抑制作用没有农用链霉素的抑制作用好，对青枯假单胞杆菌没有明显的抑制作用。 5.4盆栽试验与田间药效试验表明，蜂胶对烟草青枯病的防治效果没有农用链霉素的防治效果好，防治效果比较差。 5.5 蜂胶作为一种生物源药物，对烟草青枯病具有一定的防治效果，对有机、绿色烟叶的生产种植具有一定的价值和意义。 33 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 参考文献 [1] 朱亚滨，方晓字.我国烟草病害及抗赤星病育种研究进展[J].现代化农业,2004(5): 7-8. [2] 朱贤朝,王彦亭,王智发.中国烟草病害[M].北京:中国农业出版社,2002:152-162. [3] 杨铭,徐树德,陈慧明,等.云南烤烟病害普查报告[J].云南烟草科技,1987(2): 95-99. [4] 张世珖,陈兴全.云南省烟草真菌、细菌、线虫病害调查研究[J].云南农业大学学 报,1999(4):354-357. [5] 刘勇,秦西云,王敏,等.云南省烟草青枯病危害调查与病原菌分离[J].中国农学通报,2007(4): 311-314. [6] 郑继法,丁爱云,张建华,等.烟草青枯病研究进展[J].山东农业大学学报，1998(4):527-531. [7] 郑继法,丁爱云,王智发.烟草细菌性病害识别及其综合防治技术[J].烟草研究与管 ,2000(5):26-27. 理 [8] 朱红根,蒋正根,胡蓉花,等.烟草青枯病发生与防治对策[J].江西烟草,1998(4):26-27. [9] 任欣正.不同寄主青枯菌菌株的比较研究[J].植物病理报,1981,11(4):1-7. [10] Granada G A，Sequeira L.Chracteristics of colomdian isolates of Pseudomonas aolanacaarum from tobacco[J].Phytopathology,1983(65):1004. [11] Bueednwagen L,Kelman A.Biological and physiological aspects of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum [J]. Annual Review of phytopathology,1964(2):203-230. [12] 华静月,何礼远.我国植物青枯菌的生化型和其他生理差异[J].植物保护学报,1984,11(1):43-50. [13] Haque M A. Bacteriocin typing scheme and sistribution of Pseudomonas solanacaarum in fourecured tobacco in North Carolina[J].Tobacco Science,1986(30):50-52. [14] Chen W Y.Pathological characteristics of wilt types and spomtaneous mutants of Pseudomonas solanacearum[J].Plant Protection Bulletin of Taiwan Tobacco Research Institute,1983,25(3):149-256. [15] Rorales W M. Genetics of avirulence in Pseudomonas solan scearum [J].Tobacco Abstract,1988,32(2):340. [16] Hayward A C.Characteristics of Pseudomonas solanacearum[J]. Juornalof Applied Abstract,1964,27(2):265-277. [17] Chen W Y.Studies on the bacterial wilt of tobacco in Taiwan[J].Tobacco Abstract,1965,12(2):561. [18] Haque M A. Characteristics of North Carolina stains of Pseudomonas solanacearum from flurecured tobacco[J].Tobacco Ab-stract,1987, 31(1):78. [19] Chen W Y.Pathological characteristics of wilt types and spomtaneous mutants of Pseudomonas solanacearum[J]. Plant Protection Bulletin of Taiwan Tobacco Research 34 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 Institute,1983,25(3):149-256. [20] Yi T K.Classification of Pseudomonsa solanacearum isolates from tobacco plants in korea[J].Horean Journal of Plant Protection,1983,21(3):123-127. [21] 张建华,郑继法,陈瑞泰.我国南方主要烟区烟草青枯菌的生化型及产细菌素特性的研[J].中国 烟草学刊,1988 (1):107-117. [22] 王敏,刘勇,李梅云,等.云南省烟草青枯蕾尔氏菌的致病力、生化型和致病型研究[J].烟草农业 科学,2007,3(1):9-13. [23] Chen W Y. Control of tobacco with virulent bactiocin-producing strains of Pseudomonas solanacearum[J].Bulletin of the Taiwan Tobacco Research Institute,1983(18):53-61. [24] 何礼远,康耀卫.植物青枯病的致病机理[J].自然科学进展,1995,5(1):7-16. [25] 霍沁建，张深，王若焱.烟草青枯病研究进展[J].植物保护科学，2007，23(8):364-368. [26] 刘焕利,何礼远,毛国璋,等.植物青枯病原细菌胞外蛋白相关基因的克隆[J].植物病理学 报,1999,29(2):110-119. [27] 陈顺辉,顾钢,纪成灿,等.烟草青枯病流行动态监测[J].中国烟草科学,2003(3):32-33. [28] 郑继法,王智发,丁爱云.烟草青枯病在山东的发生与防治对策[J].烟草研究与管 理,2001(1):31-32. [29] 林滋銮,卢洪兴,陈炳全,等.福建省烟草侵染性病害种类分布与为害[J].福建农业科 技,1995(5):14-15. 4):42-43. [30] 孔凡玉.烟草青枯病的综合防治[J].烟草科技,2003( [31] 卢同.我国作物细菌性青枯菌的研究进展[J].福建农业学报, 1998,13(2):33-40. [32] 张衍荣.番茄抗青枯病育种研究进展[J].长江蔬菜,1999(3):1-4. [33] 郑继法,张建华.烟草不同品种对青枯菌的抗性分析[J].山东农业大学学报, 1995,26(1):2329. [34] 周清明,黎定军.烟草品种(系)对青枯病菌的抗性鉴定与分析[J].湖南农业大学学 报,1996,22(3):275-277. [35] 匡传富,罗宽.烟草品种对青枯病抗病性及抗性机制的研究[J].湖南农业大学学报(自然科学 版),2002 (5):395-398. [36] 林海,顾刚,纪成灿.烟草种质对青枯病抗性鉴定初报[J].作物品种资源,1999(4):37-38 . [37] 潘建菁,巫升鑫,谢小丹,等.烟草种质资源及烤烟杂交组合对青枯病的抗性评价[J].种子,2004 (7):13-16. [38] 巫升鑫,方树民,潘建菁,等.烟草种质资源抗青枯病筛选鉴定[J].中国烟草学 报,2004,10(1):22-25. [39] 谢圣汉.蕃茄青枯病发生规律及其防治措施[J].江西农业科技,1992(6):45. [40] 张培坤.玉米青枯病防治研究[J].广西植保,1997,10(2):7-9 35 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 [41] 张永春,黄镇,关国经,等.不同农业生态调控措施对烟草青枯病的影响[J].中国烟草科 学,2007,(4):49,52. [42] 陈态.烟草多抗生物有机肥对病虫害防治效果及烟株生长的影响[J].现代农业科 技,2009,(2):132,131. [43] 郭坚华,潘登明.抗青枯生防菌拮抗物性质的实步研究[J].南京农业大学学报,1995,18(5):59-62. [44] 原秀纪.利用弱毒力产细菌素青枯菌菌株预防烟草青枯病的效果[J].国外农学(植物保 护),1992(4):40-43. [45] 罗宽,匡传富.三株拮抗细菌对烟青枯病的抑制效果[J].2002,18(4):185-187. [46] 何礼远,康耀卫.利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性[J].植物保护学 报,1990,17(2):113-116. [47] 郭坚华,孙平华.植物细菌性青枯病的生物防治机制和途径[J].中国生物防治,1997,13(1):42-45. [48] 杨,任欣正.姜瘟病生物防治试验初报[J].山东科学,1990,3(4):42-46. [49] 林国宪，刘波,柯鼎新,等.三种生物农药防治花生蛴螬的效果比较[J].福建省农科院学报，1995， 10(2):27-29. [50] 杨合同,任欣正,王少杰,等.蕃茄根土区系中拮抗性细菌的分布与青枯病发生的关系[J]. 生物 防治通报,1994,10(4):162-165. [51] 翁祖信,李宝栋,冯东昕.嫁接黄瓜防病与增产效果的研究[J].中国蔬菜,1993(3):11-15. [52] 陈永惠,黄福兴,李友武,等.烟草青枯病药剂防治试验[J].广西植保,1996 (4):23-25. ] 卢洪兴,邱志丹.烟草青枯病发生与防治研究[J].烟草科技,1995(5):42-45. [53 [54] 卢洪兴,曾军.烟草青枯病发生与药剂防治研究[J].福建省农科院学报,1996,11(3):41-45. [55] 孔凡玉,卢平,许永峰,等.20%青枯灵可湿性粉剂防治烟草青枯病药效试验初报[J].中国烟草科 学,2004 (1):36-37. [56] Harrison U J,Frank J L.Disease management through suppressive soils[J] . Department of plantpathology,North Carolina state university(draft document),1999,23(9):14. [57] 陈泽鹏,王涛,陈伟明,等.烟草抗青枯病的药剂诱导效应与抑菌增效作用[J].烟草科 技,2011,282(1):74,78. [58] BANKOVA V. Resent trends and important development in propolis research[J]. Ecam, 2005,2(1): 29-32. [59] 董捷，张红城，尹策，李春阳. 蜂胶研究的最新进展.食品科学[J]，2007,9:637-642. [60] 陈国有，齐鹤，徐东花. 黄酮类化合物的生物活性研究进展[J]. 龙江医药，2008,21(3):81-82. [61] 桑慧，司艳红，王家富，商战平. 蜂胶抗氧化性的实验研究[J]. 中华中医药学刊， 2008,26(3):586-588. [62] 徐颖，方金凤，顾岚. 蜂胶黄酮清除自由基作用的研究[J]. 食品工业，2008,1:23-25. 36 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 [63] 卢兆芸. 蜂胶保鲜机理及其在食品保鲜中的应用[J]. 食品工业科技，2008,29(9):305-307. [64] 孟日增，石建平，郭娜，王文魁. 蜂胶粗提物提取工艺及抑菌活性研究[J]. 中国兽医医药杂 志，2008,2,:43-45. [65] 许合金，张军民，王修启，赵青余. 蜂胶黄酮的生物学功能及其在畜牧业中的应用[J]. 饲料 工业，2008,29(20):61-64. [66] 赵强，张彬. 蜂胶挥发油抗氧化性能及其成分研究[J].天然产物研究与开发，2008,20(1):82-86. [67] Lucrecia L, Chaillou, Monica A. Nazareno Bioactivity of propolis from Santiago del Estero, Argentina,related to their chemical composition[J].LWT-Food Science and Technology,2009,42:1422-1427. [68] 汤凤霞，高云飞，乔长晟.蜂胶对猪肉保鲜效果的初步研究[J].宁夏农学院学 报,1999,20(2):37-40. [69] 高振宁(保护生态环境，发展有机农业,J,(农村生态环境，2001，17( 2) :1 ,4( [70] LEGUN K. Cultivating institutions:Organic agriculture and integrative economic choice ,J,( Society , Natural Resources，2011，24: 455 ,468( [71] 吴斌(我国有机农业发展现状及对策研究,J,(东方企业文化?策略，2010( 4) : 67 ,68( [72] 邹成裔(低碳农业经济发展途径浅析,J,(产业经济，2011(2) :146( [73] 谢晓斌(开发无公害烟叶生产，促进烟草行业持续健康发展,J,(农业与技术，2004，24(4) : 47,48( ] 王彦亭，程多福(绿色是人类生活和生存的保障———无公害烟叶生产技术,J,(科技进步[74 与对策，2002(6) :178 ,179( [75] 王彦亭，程多福(无公害烟叶生产技术探讨,J,(烟草科技/烟草论坛，2001( 12) : 3 ,5( [76] 郭怡卿，张光煦，马剑雄，等(有机烟叶及其生产,J,(西南农业学报，2009，22( 6) : 1793 ,1798( [77] 朱鸿杰(有机烟草研究现状与发展趋势,J,(安徽农学通报，2009，15(3) :128 ,183( [78] 马剑雄，王洪云，常剑，等(有机烟叶及其生产地的评估研究,J,(西南农业学报，2008， 21(5) :1256 ,1261( [79] 马坤，杨辉，王玉平，等(有机生态烟叶的研究进展与展望,J,(贵州农业科学，2011，39( 1) : 69 , 72( [80] 杨佳玫，王玉平(贵州有机生态烟叶质量研究初报,J,(耕作与栽培，2010( 2) : 19 ,21( [81] 龙文，田劲松，徐兴强，等(浅议有机烟叶生产基地建设与技术体系,J,(天津农业科学， 2010，16(6) :48 ,51( [82] 刘雪，孟繁锡，郭丽，等(发达国家有机农业种植技术体系及其启示,J,(世界农业，2006(4) :16 ,17( 37 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 [83] 李义强，王凤龙，龚道新(我国无公害烟叶生产的问题、优势及对策,J,(中国烟草科学， 2009，30(3) :54-57( [84] 韩海东，林永辉，刘明香(低碳农业背景下闽台有机农业交流与发展的研究,J,(中国农学 通报，2011，27(2) :452-457( [85] 周清明，黎定军.烟草品种(系)对清苦病菌的抗性鉴定与分析[J].湖南农业大学学 报,1996,22(3):275-277. 38 蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究 致 谢 弹指一挥间，三载寒窗终结硕果。在我即将完成论文之际，我衷心地感谢在三年的学习和生活中给我关心和帮助的导师兰建强副教授。导师严谨的治学学风、渊博的知识、诲人不倦的教导和孜孜不倦的敬业精神使学生终身难忘。在这三年里，兰老师给予我学习、科研和生活上无微不至的关心和帮助，对我付出了极大的心血，都时刻温暖着我。在此，谨向我敬爱的导师兰建强副教授表示最衷心的感谢～ 感谢班主任马丽老师，感谢肖春教授、叶敏研究院、秦小萍副教授、吴国星副教授等任课老师的教导。 特别感谢刘云龙老师，他朴实的生活作风和正直诚恳的为人使我受益菲浅，他的治学和为人将永远是我学习的榜样，它将永远激励我在人生的道路上不断进步、奋发向上。 感谢罗文富老师、张中义老师、谢勇老师、王扬老师、何永宏老师等老师给予的关心和帮助～ 感谢师兄王力、劳超、皮金鹏，师弟高现亮、蒋洪春，师妹罗艺在实验过程中给予我的支持和帮助～ 感谢彭坚强、吴佳、刘美见、张晓娟等，在学习、生活、科研过程中给予我的帮助。 特别感谢在三年的学习、生活中一直无微不至的关心我、理解我、支持我的父母及家人。 三年的学习、工作、生活与老师、同学和朋友的殷切关心是密不可分的，在此一并向给予我支持和帮助的老师、同学、亲友表示深深的谢意～ 最后，再次衷心感谢所有给予我关心、帮助、支持和鼓励的老师、同学和朋友们，虽然即将毕业，但对您们所给予的一切我将永远铭记在心。 孔聪聪 二O一三四月 39