芪贞增免颗粒质量控制方法的研究

芪贞增免颗粒质量控制方法的研究 河北地邦动物保健科技有限公司 叶超 摘要:本文研究了复方中药芪贞增免颗粒的质量控制。通过采用薄层色谱法(TLC)对“久清堂”芪贞增免颗粒中的黄芪、淫羊藿分别进行定性鉴别以及通过高效液相色谱法(HPLC)对其中的黄芪甲苷进行了定量检测。定性鉴别实验结果表明:该制剂中黄芪、淫羊藿斑点清晰，且阴性对照无明显干扰。定量检测实验测定了黄芪甲苷在0.256~2.324μg/ml之间呈现良好的线性关系，r=0.9996,并测得制剂中黄芪甲苷含量为0.135%(以最小误差计)，达到药典要求的原料含量水平。通过定性与定量的实验鉴别方法有效的控制芪贞增免颗粒的质量水平，为企业标准的制定提供参考依据。 关键词:芪贞增免颗粒;女贞子;黄芪;淫羊藿;薄层色谱法;液相色谱法 “久清堂”芪贞增免颗粒是由黄芪、女贞子、淫羊藿等药味组成。中医理论中，黄芪是一味具有益气作用的中药，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮、生肌的功效。现代研究表明黄芪由黄芪多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸等化学成分组成，其药理作用为提高免疫功能，增强抗氧化作用，保护细胞活力，保护心脑血管、肝脏、肾脏和肺脏等细胞活力，抗菌及抑制病毒等作用;女贞子是一味传统的扶正固本药物，具有滋补肝肾，明目乌发的功效。现代研究表明，女贞子由齐墩果酸、对羟基苯乙醇苷类、裂环环烯醚萜苷类以及磷脂、多糖、挥发油、微量元素等多种化学成分组成。具有提高机体免疫功能、抗衰老、保肝、抗炎等多种药理作用;淫羊藿属于小檗科，具有补肾阴、强筋骨、祛风湿等多种功效。其中有效化学成分为淫羊藿苷类黄酮化合以及生物碱、木脂素、多糖和微量元素等，对于改善心血管系统功能、调节内分泌、改善骨密度、增强免疫力等均表现出生理活性。由此，芪贞增免颗粒具有提高机体免疫、促进机体生长发育以及提高肉蛋奶质量等功效。 本文主要对“久清堂”芪贞增免颗粒三种主要成分的检验方法进行了概要总结，目的在于方便、快速地监控该制剂的质量，使该制剂质量可控，本研究采用TLC法对方中黄芪、女贞子、淫羊藿进行了定性鉴别，并建立了君药黄芪中的黄芪甲苷的含量测定方法。 1仪器与试药 LC-10AD高效液相色谱仪(日本岛津)、752型紫外光栅分光光度计、ZF-2三用紫外线分析仪、TG-332A微量分析天平、KQ118型超声波清洗器等。 实验所用药品为河北地邦动物保健科技有限公司提供的“久清堂”芪贞增免颗粒。实验中所采用的黄芪甲苷对照品、淫羊藿苷对照品与齐墩果酸对照品均由中国兽药监察所提供，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。 2薄层色谱鉴定 根据中华人民共和国农业部公告第1506号令中的要求，芪贞增免颗粒的鉴别项为黄芪与淫羊藿两项的鉴别。本实验按上述标准试验方法，分别对“久清堂”芪贞增免颗粒中的黄芪甲苷与淫羊藿苷进行色谱薄层鉴别。 2.1 黄芪 取三个批次“久清堂芪贞增免颗粒”每份各6g，加甲醇20mL，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100,120目，5g，内径10,15mm)上，用40%甲醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇提取两次，每次20mL，合并正丁醇液;用水洗涤两次，每次20mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5mL使溶解，作为供试品溶液。取缺黄芪阴性制剂，按上述制剂的处理方法，得阴性溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照色谱薄层法试验，吸取上述两种溶液各2µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2) 作者简介:叶超(1986—)，男，汉族，河北石家庄人，河北地邦动物保健科技有限公司，研发专员。 的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105?加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，而阴性对照制剂在相同位置无此斑点的存在。且在紫外光灯(365nm)下，供试品显与对照品相同的橙黄色荧光斑点。 2.2 淫羊藿 取三个批次“久清堂”芪贞增免颗粒每份各3g，加乙醇10mL,超声5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。取缺等量淫羊藿阴性制剂，按上述制剂的处理方法，得阴性溶液。另取淫羊藿苷对照品，加乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10µL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10:1:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品相同位置上，置显相同的橙黄色荧光斑点，而阴性制剂在相同位置上无此斑点存在。 3 黄芪甲苷含量的测定 对于黄芪甲苷的含量测定，已有的检测方法很多，如薄层扫描法、香草醛-硫酸比色法等，但均存在操作频繁、背景干扰多、误差大等缺点。利用高效液相色谱分析法测定黄芪甲苷的含量具有灵敏性高、重现性好等优点。 3.1 色谱及检测条件 色谱柱:(C18柱5μm 250mm×4.6mm);流动相:乙腈-水(37:63);流速:0.9ml/min;检验波长为200nm，柱温为室温。 3.2 标准曲线的绘制 精确称取黄芪甲苷对照品12.8mg置于50ml容量瓶中，加入色谱纯甲醇溶液溶解并定容，分别精密吸取0.5、1.5、2.5、5、10ml置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20μL，以进样量(μg)的常用对数为横坐标，以峰面积的常用对数为纵坐标，作标准曲线，得回归方程为Y=1.4372+4.3758，r=0.9996，进样量为0.256~2.324μg范围内，线性关系良好。样品测定采用外标两点法计算。 3.3 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续重复进样3次，每次进样20μL，测峰面积，RSD为1.32% 3.4 稳定性试验 样品溶液在室温下放置，每隔2小时进样测定一次，共测定6次。结果表明，在12h之内黄芪甲苷色谱峰面积无明显差异。RSD=2.46% 3.5 样品含量测定 取三批“久清堂”芪贞增免颗粒50g，溶于50ml水中，加热浓缩至20ml，用水饱和正丁醇溶液反复萃取三次，合并正丁醇部分，减压蒸干，残渣用甲醇定容至5ml，用0.45μm微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分析，以外表两点法计算含量，结果见下表 批号 含量(%) RSD(%) 1210181 0.135 0.86 1210182 0.142 1.45 1210183 0.129 2.14 (1)利用高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量已有文献报道，但对于成品芪贞增免颗粒中黄芪甲苷含量测定未见报道，本实验采用梯度洗脱，一次进样的方法测定芪贞增免颗粒中黄芪甲苷的含量，该方法可靠准确，具有一定实用性，为企业更好地控制产品质量提供了参考及依据。 (2)通过本实验测定的“久清堂”芪贞增免颗粒中含黄芪甲苷为0.135(RSD=0.86%)，在《兽药国家标准汇编》中，没有对黄芪甲苷的含量测定，《中华人民共和国兽药典》2000年版(二部)规定黄芪原药材中含黄芪甲苷不得少于0.040%。“久清堂”芪贞增免颗粒中的黄芪甲苷远远高于原药材的标准，充分证明了该产品具有较高的质量水平。 4结果与讨论 4.1 结果 本文研究了复方中药芪贞增免颗粒的质量标准控制。通过采用薄层色谱法对“久清堂”芪贞增免颗粒中的黄芪、淫羊藿分别进行定性鉴别以及通过高效液相色谱法对其中的黄芪甲苷进行了定量鉴别。定性鉴 别实验结果表明:该制剂中黄芪、淫羊藿斑点清晰，且阴性对照无明显干扰。定量鉴别实验表明:制剂中黄芪甲苷含量为0.043%(以最小误差计)，达到药典要求的原料含量水平。 4.2 讨论 关于芪贞增免颗粒的质量标准控制，农业部1795号中有明确规定，即制剂中两种成分黄芪和淫羊藿进行定性鉴别。但是由于中药材的质量控制本事就是一项复杂工作，只单单进行定性鉴别很难全面反映中药制剂的质量，因此定量鉴别中药制剂中一种或多种有效成分的含量并参照一定标准进行比较就显得尤为重要，实验对“久清堂”芪贞增免颗粒中的黄芪甲苷含量测定能更加有效的反映该制剂质量水平。 关于芪贞增免颗粒质量控制的研究还有待完善，比如对于女贞子的鉴别以及含量测定的相关方法及控制标准还有待进一步研究。 参考文献: [1]吕武清，龙新华(中成药中的药材波层色谱鉴别[M](北京:人民卫生出版社，1997:469-492. [2]中国兽典药委员会(《中华人民共和国兽药典》2010年版(二部) [S](北京:中国农业出版社2011.5. [3]中国兽典药委员会(《兽药质量标准》(三册)[S](北京:中国农业出版社. 2012. 8. [4]吴巧凤，范英(HPLC法测定血胶囊中黄芪甲苷的含量[J](中成药，2003，34(5):425. [5]侯云德，宋代军，付丰勇(黄芪某些生物活性的有效部分的研究[J](中西医结合杂志，1984，4:420.