siRNA特异性“沉默”Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响

siRNA特异性“沉默”Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响 siRNA特异性“沉默”Bim基因对胃腺癌细 胞凋亡的影响 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?595? ?基础医学研究? siRNA特异性"沉默"Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响 江蓓蕾,叶艳,程文晋,陈思,吴萍,张旭东,张林杰 摘要目的研究BID-only蛋白Bim在紫杉醇诱导胃腺癌 细胞凋亡中的作用.方法流式细胞仪PI单染法检测细胞 凋亡率;JC.1染色检测线粒体膜电位的变化;在紫杉醇相对 敏感SGC-7901胃腺癌细胞株中采用小干扰RNA(siRNA)技 术特异性"沉默"Bim基因;Westernblot分别检测紫杉醇诱 导siRNA"沉默"Bim基因前后Bim蛋白的达水平变化. 结果紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性, SGC-7901较BGC-823胃腺癌细胞株对紫杉醇更为敏感.紫 杉醇诱导SGC-7901及BGC-823胃腺癌细胞很大程度依赖线 粒体途径凋亡.特异性"沉默"Bim基因的转录,紫杉醇诱导 凋亡敏感细胞株SGC-7901的凋亡率明显降低.结论Bim 在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥关键调节作用. 主词胃肿瘤;细胞凋亡;紫杉醇;siRNA;RNA;小分子干 扰 自由词Bim 中图分类号R735.2;R329.2;R282.71;R342.2 文献标识码A文章编号1000—1492(2007)o6—0595—04 Bim(Bcl-2interactingmediatorofcelldeath)是 BH3.only蛋白家族中促凋亡成员,也是线粒体凋亡 途径上游重要的凋亡调节蛋白?I2J.目前研究认为 抗微管化疗药物治疗实体肿瘤可通过上调Bim活 性,诱发细胞凋亡,从而降低肿瘤的发展I4J.本课 题组在前期研究中发现,Bim蛋白在紫杉醇诱导的 胃腺癌细胞凋亡中表达增高,同时Bim移位于线粒 体膜呈高表达J.本研究在前期研究的基础上,采 用Bim的小分子干扰RNA(siRNA)特异性下调Bim 蛋白的表达,同时联合抗微管化疗药物紫杉醇处理, 以进一步探讨Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡 的作用. 1材料与方法 1.1细胞培养及药物处理SGC-7901及BGC一823 200r7一l1—15接收 基金项目:国家自然科学基金(编号:30572118),安徽省自然科学基 金(编号:070413077) 作者单位:安徽医科大学免疫学教研室,合肥230032 作者简介:江蓓蕾,女,硕士研究生; 张林杰,男,教授,硕士生导师,责任作者,E—mail:z33@ ahlnu.edu.ell 胃腺癌细胞系(购自中科院上海细胞库)在含10% 小牛血清,1%双抗,1%L一谷胺酰胺的高糖DMEM 培养基(Gibco公司),37?,5%CO2,饱和湿度下 培养.紫杉醇(美国百时美施贵宝公司)用细胞培 养液配置0.3~mol/L贮存液一20?保存,使用前 稀释成工作浓度.细胞传代后24h,PBS洗涤2次, 对照组更换新鲜培养液,药物组加入所需要不同浓 度紫杉醇诱导,并按所需要的不同时间收集备用. 1.2PI单染流式细胞仪检测凋亡率将对数生长 期的SGC-7901及BGC一823胃腺癌细胞接种于24 孔板培养过夜,不同时间加入不同浓度的紫杉醇处 理,均设立阴性对照.分别收集24孔板中不同浓度 及各时间点的上清液,各孔再用PBS洗涤1遍,低 速离心弃上清,每孔加750的PI(Biosharp)染液, 37?避光,10,20min完全消化后收集,4?避光 过夜.上流式细胞仪(FASCalibur)检测.每组实验 重复3次.资料用WinMDI2.8软件分析,PI阳性 细胞百分率即细胞凋亡率.绘制量效及时效曲线. 1.3JC-1染色检测线粒体膜电位变化将对数生 长期的SGC.7901及BGC一823胃腺癌细胞接种于24 孔板培养过夜,以0.3~mol/L紫杉醇分别诱导8, 24,48h,设立阴性对照.胰酶消化法收集各孔细胞 于流式管中,PBS洗涤离心,jc.1染色(终浓度为10 mg/L,MolecularProbes,Eugene,OR),37?避光, 15min,弃染液,PBS重悬,流式细胞仪检测.在线 粒体膜电位较高时,JC一1聚集在线粒体的基质(ma— trix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧 光,即右上1/4象限;在线粒体膜电位较低时,JC一1 不能聚集在线粒体的基质中,JC一1为单体(mono— mer),可以产生绿色荧光,即右下1/4象限;每组实 验重复3次,资料用WinMDI2.8软件分析. 1.4siRNA技术"沉默"Bim基因的表达将对数 生长期的SGC.7901及BGC一823胃腺癌细胞,调整 细胞密度为4×10和1×10分别接种于6,24孔 板.用含10%小牛血清无抗生素HyQDMEM(海克 隆生物化学制品北京有限公司)培养24h,转染前 弃原液换成含5%小牛血清无抗生素HyQDMEM,设 空白及阴性对照组.特异性Bim—smartpool,Bim一8m一 ? 596?安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6) artpool阴性对照(siRNA;SMARTpool,Dhannacon, Lafayette,CO)及Lipofectamine2000分别用不含抗 生素及血清的HyQDMEM稀释,室温混匀静置 20min后加入培养孔中,smartpool的终浓度为100 nmol/L.转染后6h换为含10%小牛血清HyQD— MEM培养,24h后加0.3I.Lmol/L紫杉醇处理.药 物作用24和48h后分别收集6,24孔板细胞,West— emblot鉴定Bim转染效率及PI单染流式细胞仪分 析细胞凋亡率. 1.5Westernblot胰酶消化收集细胞,预冷PBS 洗涤2次,加入2倍体积的细胞裂解液(10mmol/L Tfis—HC1pH7.4,140mmol/LNaC1,0.5mmol/L CaC12,0.5mmol/LMgCl2,0.02%NaN3,1%Tri— tonX一100,1mmol/LPMSF,10mg/LAprotinin,10 mg/LLeupeptin)冰上孵育1h,低温高速离心后取 上清,此为细胞总蛋白.SDS—PAGE电泳,样品上样 量均100,转膜后用5%脱脂牛奶/TBST封闭2 h,加鼠抗人Bim多抗(1:1000,Calbiochem)4? 孵育过夜,TBST洗3次,加辣根过氧化物酶标记的 相应的二抗(1:20000,武汉博士德)室温孵育2h, TBST洗3次.用ECL系统(Pierce)进行检测,胶片 曝光,扫描图像保存.将曝完光的膜用TBS洗3次 后加小鼠抗人B—tubulin单抗(1:1000,武汉博士 德),相应的二抗继续孵育,ECL系统进行检测,胶 片曝光,扫描保存. 1.6统计学处理数据的录入和分析采用SPSS 10.0统计软件.数据以?s表示,组间比较采用方 差分析. 2结果 2.1紫杉醇诱导SGC-79o1及BGC-823胃腺癌细 胞凋亡紫杉醇诱导SGC-7901及BGC一823胃腺癌 细胞凋亡呈剂量和时间依赖性,IC如为0.3I.Lmol/L, 48h细胞凋亡达到高峰.图中可看出相同浓度的 紫杉醇作用SGC-7901相对BGC一823凋亡率高,说 明SGC-7901较BGC一823对紫杉醇诱导的凋亡更为 敏感.见图1. 2.2紫杉醇诱导SGC-79o1及BGC-823胃腺癌细 胞凋亡很大程度依赖线粒体凋亡途径JC一1从红 色荧光到绿色荧光的转变,即线粒体膜电位的下降, 是作为细胞凋亡早期的一个检测指标,从图中我们 可以观察到紫杉醇诱导SGC-7901及BGC-823不同 时间点线粒体膜电位的变化,8h时,JC一1开始从右 上1/4象限移位至右下1/4象限,随着紫杉醇诱导时 ^ 褂 U 基 6O 50 40 褂 , 熙 1-130 基 2O lO O O.1O.2O.30.40.5 剂量(mmol/L) 08l6243648 时间(h) A B 图1紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡 A:不同剂量紫杉醇诱导胃腺癌细胞48h凋亡率;B:O.3~mol/L 紫杉醇不同时间点诱导的胃腺癌细胞凋亡率 间的增加,移位的趋势也越加明显,在48h达到移位 的高峰.表明了紫杉醇诱导的胃腺癌细胞凋亡极大 程度依赖于线粒体凋亡途径. 2.3特异性"沉默"Bim基因转录.紫杉醇诱导凋 亡敏感细胞株SGC-7901的凋亡率明显降低本课 题组前期实验结果表明紫杉醇作用敏感细胞株 SGC-7901,Bim蛋白的表达水平呈增高趋势,且16h 时达到高峰,并出现移位线粒体的高表达J.为了 明确Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥的 作用,我们采用siRNA"沉默"Bim基因.实验设置 4组,见图3A,紫杉醇处理后3组24h.Westernblot 结果表明经过特异性siRNA"沉默"Bim基因后,紫 杉醇诱导后胃腺癌细胞的Bim蛋白表达水平明显 降低.同时采用流式细胞仪分析紫杉醇作用后3组 48h,见图3B,随着siRNA特异性"沉默"Bim基因 抑制Bim蛋白的表达,紫杉醇诱导胃腺癌细胞的凋 亡率也明显降低.经统计学分析,两者存在相关性 (P<0.05). 3讨论 Bim是一种重要的凋亡调节蛋白,广泛表达于 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?597? ^ 蛆] 一 ? U 对照8h l1. 0 黾2 b 星 b lOlOlO lO.lOlO1OlO BimsiRNA 对照siRNA 紫杉醇 JC一1单体(绿色荧光) 0 黾2 b 芑 0 l 0 盖2 b 0 lO.lOlOlO FL1一Height 图2紫杉醇诱导胃腺癌细胞线粒体膜电位变化 图3特异性抑制Bim蛋白表达与紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡 A:Westernblot检测siRNA技术"沉默"Bim基因的效率;B:流式细胞仪检测特异性 抑制Bim蛋白表达对紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡的影 响.1:对照;2:紫杉醇;3:对照siRNA+紫杉醇;4:bimsiRNA紫杉醇 正常细胞,与防御自身免疫,维持造血内环境稳定, 以及肿瘤的发生发展及治疗都有着密切的关 ,Bim是研究比较热门的促凋亡家 系一.因此 族成员之一,作为肿瘤抑制因子的Bim在肿瘤细胞 凋亡中的基础研究,必然为临床治疗提供理论基础 与依据.本文仅初步探讨Bim在紫杉醇诱导胃腺 癌细胞凋亡中的作用. 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用.一 定的凋亡刺激信号(如细胞因子去除,ca流出,紫 外线照射,微管动摇,化疗药物等),经过各种途径 激活BH3一only蛋白家族中的促凋亡因子Bim,活化 的Bim分子移位于线粒体膜,通过与Bcl-2家族凋 亡诱导蛋白(如Bax或Balk)相互作用,引起线粒体 膜破裂,线粒体功能丧失,凋亡蛋白细胞色素C, caspase的二级线粒体激活蛋白Smac,内核酸酶G 和Omi/HtrA2的释放,ATP合成受阻等.多种细胞 凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,其中 线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反 应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特 征(染色质浓缩,DNA断裂)出现之前,一旦线粒体 膜电位崩溃,则细胞凋亡不可逆转J.本实验利 用JC一1染色检测线粒体膜电位变化,发现随着紫杉 醇作用SGC-7901及BGC.823胃腺癌细胞的时间延 长,线粒体膜电位下降的越加明显.这可能就是紫 杉醇活化Bim分子,引起的细胞凋亡级联反应. 据文献报道„:抗微管化疗药物通过上调BH3一 only蛋白家族中促凋亡蛋白Bim表达发挥促凋亡作 用.正常细胞中,Bim结合于微管动力蛋白的轻链 DLC1/LC8复合体上,呈无活性状态?„.转录因子 FOXO3和c—Jun(JNK是激酶)可以上调Bim的转 录„J,翻译后的Bim可以直接与BCL-2结合,阻止 其维持线粒体膜的稳定性;同时,活化的JNK不仅 能增加Bim的表达水平,而且使Bim的磷酸化位点 发生磷酸化,导致Bim从微管动力蛋白复合体上解 离出来?.一旦Bim解离便移位于线粒体,与线粒 体膜上的BCL-2/BCL—XL结合,使BAX/BAK的构 厂一一_【[0_【b_【_ol_【兰?}{.N 一一一2r__?寸』m 一一一m ,一一..一..b_【b_【b_【_ol_【_【b_【_olD0_【 }l__最}l_ ? 598?安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6) 象发生变化,引起线粒体膜通透性改变,释放细胞色 素C,Smac/DIABLO,促进细胞凋亡.Bim整个活化 调节过程处于线粒体和caspase的上游,因此可以看 作为凋亡的起始事件.本课题组前期的研究发现: 紫杉醇诱导SGC-7901凋亡,Bim蛋白表达水平呈增 高趋势,16h达到高峰,且移位于线粒体膜上高表 达.在此基础上,我们将敏感细胞系SGC-7901采 用siRNA技术"沉默"Bim基因的转录,经紫杉醇作 用16h,同时设置对照组.结果表明:特异性"沉 默"Bim的转录,可以使紫杉醇诱导的敏感SGC一 7901细胞株凋亡减少.Bim表达水平与紫杉醇诱 导胃腺癌细胞凋亡呈正相关,即Bim蛋白表达水平 的下调,紫杉醇诱导胃腺癌细胞的凋亡率也明显降 低.本研究在一定程度上证实了Bim在紫杉醇诱 导的胃腺癌细胞凋亡中发挥了作用,同时提示我们 是否可以将Bim作为临床治疗胃腺癌的分子靶点 或联合其他药物进行特异性靶向治疗,为胃腺癌的 治疗开辟新的思路. [2] [3] 参考文献 StrasserA,PuthalakathH,BouilletP,eta1.TheroleofBim,a proapoptoticBH3??onlymemberoftheBcl-2familyincell-death control[J].AnnNYAcadSci,2000,917(1):541—58. SuntersA,MadureirPA,PomeranzKM,eta1.Paclitaxel-in- ducednucleartranslocationofFOXO3ainbreastcancercellsis mediatedbyc-JunNI-I2-terminalkinaseandAkt[J].CancerRes, 2006,66(1):212—20. ErieA,HarrisAW,BouilletP,eta1.Bimisasuppressorof myc—inducedmouseBcellleukemia[J].ProcNailAcadSci USA,2004,101(4):6164—9. [4]CorazzaN,JakobS,SchaerC,eta1.TRAILreceptor.mediated JNKactivationandBimphosphorylationcriticallyregulateFas--me-- diatedliverdamageandlethality[J].JClinInvest,2006,ll6 (9):2493—9. [5]叶艳,谢奇朋,郝延璋,等.BH3一only蛋白在紫杉醇诱导胃腺 癌细胞凋亡中的表达[J].安徽医科大学,2006,41(2): l27—3O. [6]OReillyLA,CullenL,VisvaderJ,eta1.ThepmapoptoticBH3- onlyproteinbimisexpressedinhematopoietic,epithelial,neuro- hal,andgermcells[J].AmJPathol,2000,157(8):449—61. 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EffectsofreducingBimexpressioninapoptosisof gastricadenocarcinomacellsviasiRNAtechnology JiangBeilei,YeYan,ChengWenjin,etal (DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032) AbstractObjectiveTostudytheroleofBH3?-onlyproapoptosisproteinBiminapoptosisofpaclitaxel?-induced gastricadenocarcinomacells.MethodsApoptosiswasmeasuredbyflowcytometryusingpropidiumiodidestai— ning.ChangesinmitochondrialmembranepotentialwerestudiedusingJC一1staining.Bim —specificsiRNAandcon— trolsiRNAwastransfectedintothesensitiveSGC-7901cells,respectively.Westernblotwasusedtodetectthetar- getgeneexpressionatproteinlevels.ResultsPaclitaxelinducedapoptosisofgastricadenocarcinomacellsina dose—andtime— dependentmanner.ItappearedthatSGC-7901cellsweremoresensitivetopaclitaxel— inducedapop— tosisthanBGC一823cells.Paclitaxelinducedmitochondrial— dependentapoptosisinSGC-7901andBGC一823.Inhib— itingBimexpressionbysiRNAprotectsgastricadenocarcinomacellsfrompaclitaxel— inducedapoptosis.Conclusion BH3一onlyproteinBimplaysacriticalroleinpaclitaxel— inducedapoptosisofgastricadenocarcinomacells. MeSHstomachneoplasms;apoptosis;paclitaxel;RNA;smallinterfering FreewordBim