黄曲霉毒素试剂盒 说明书

RIDASCREEN®  Aflatoxin Total 酶联免疫法定量黄曲霉毒素总量 （R4701） 酶标免疫分析定量检测黄曲霉毒素总量。德国R-Biopharm公司制造（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）  简介    RIDASCREEN®Aflatoxin Total（订货号：R4701）黄曲霉毒素总量检测试剂盒，采用竞争性酶联免疫法定量测定谷物和饲料中的黄曲霉毒素的总含量。试剂盒中含有酶联免疫检测所需的所有试剂，包括标准品。试剂盒足够进行96次检测（包括标准测定）。 定量分析需要使用微孔板酶标仪。 样品处理： 谷物和饲料样品：提取、过滤和稀释 检测时间： 样品制备（以10个样品为例） 谷物和饲料样品：.............................约30分钟 检测过程（孵育时间）...........................45分钟 检测限： 谷物和饲料样品：....................约1.75 ppb （以标准品为基础测得） 回收率： 约85 % （以标准品为基础测得） 变异系数的中间值为15% 特异性： RIDASCREEN® Aflatoxin Total黄曲霉毒素总量检测 试剂盒的特异性根据与相关霉菌毒素的交叉反应确定。 黄曲霉毒素B1....................................100 % 黄曲霉毒素B2....................................约48 % 黄曲霉毒素G1 ...................................约75 % 黄曲霉毒素 G2...................................约18 % 1.  用途 RIDASCREEN® Aflatoxin Total（订货号：R4701）黄曲霉毒素总量试剂盒，采用竞争性酶联免疫法定量测定谷物和饲料中的黄曲霉毒素的总量。 2.  概要 黄曲霉毒素是霉菌Aspergillus flavus 及Aspergillus parasiticus 的二级代谢产物。这些霉菌生长于热带潮湿地区。在农业国家中经常出现因其导致的植物性食品污染现象。黄曲霉毒素是最强的产生于自然界的致癌物质之一。 黄曲霉毒素B1常和B2、G1和G2同时出现，具极强的毒性，通常存在于玉米、花生、巴西坚果、棉籽和开心果中。 鉴于这些霉菌毒素的毒性，欧盟国家规定，黄曲霉毒素B1 的残留限量值为2 ppb（ppb即：ug/L（微克/升）），黄曲霉毒素总残留限量值为4 ppb。 3. 测定原理 检测的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉毒素抗体的捕获抗体。加入标准品或样品溶液、酶标记黄曲霉毒素（酶连接物）和黄曲霉毒素抗体。游离的黄曲霉毒素和酶连接物竞争黄曲霉毒素抗体结合位点（竞争性酶联免疫分析）。同时黄曲霉毒素抗体也与微孔板上固定的捕获抗体结合。没有结合的酶连接物在洗涤步骤中被除去。在孔中加入底物（过氧化脲）和发色剂（四甲基对二氨基联苯），结合的酶连接物将发色剂转化为蓝色。加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色。在450 nm处测量，吸光度值与样品中的黄曲霉毒素浓度成反比。 4.  提供的试剂 每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔），盒中的材料如下： 1x96微孔板（12条每条8孔） 包被有针对黄曲霉毒素抗体的捕获抗体 6x标准品浓缩液，（每瓶1.3 ml）  0 ppb （零标准品），0.05 ppb，0.15 ppb，0.45 ppb，1.35 ppb，4.05 ppb 黄曲霉毒素B1甲醇/水溶液，即用型 1x酶连接物（6 ml）......................红色瓶盖 过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1 即用型 1x黄曲霉毒素抗体液（6 ml）.........................黑色瓶盖 单克隆抗体，即用型 1x底物/发色剂（10 ml）.....................................蓝色瓶盖 红色液体，含有四甲基对二氨基联苯 1x反应终止液（14 ml）.......................................黄色瓶盖 含1 N 的硫酸 1x洗涤缓冲液（盐） 用于制备10 mM磷酸缓冲液，pH 7.4 含0.05 % Tween 20 5. 需要的材料但盒中不提供 5.1设备 ----微孔板酶标仪（450nm）定量分析用----100ml量筒----50ml 漏斗及容量瓶 ----粉碎机----振荡器----Whatman No.1或相当的滤纸----刻度移液管 ----50µl，100µl及1000µl微量加样器 5.2 试剂 ----甲醇 ----70%甲醇溶液制备：30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70%甲醇溶液 ----蒸馏或去离子水 6.  操作者应该注意之事项 ----标准液含有黄曲霉毒素B1，应特别小心 ----使用过的玻璃容器最好用pH7的高氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜 ----反应停止液为1M硫酸，避免接触皮肤 ----不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起  灵敏度的降低 ----不要交换使用不同批号的盒中试剂 7.  储存条件 ----保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻 ----将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封 ----标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下 ----基质/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下 8. 试剂变质的迹象 红色的基质/发色剂有任何蓝色明基质/发色剂变质，应当弃之。 0标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm<0.6)时，表示试剂可能变质。 9. 样品处理 样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存 谷物和饲料样品 采集的代表性样品用实验用粉碎机粉碎或者碾磨并充分混合。 − 称取 2 g 样品于可密闭的玻璃容器中 − 在室温条件下（20 - 25 °C）加入10 ml 甲醇水溶液（70/30），在振荡器中振荡10分钟使其充分混合。 − 提取液用滤纸过滤 − 100 μl滤液用600 μl 蒸馏水 − 每孔取50 μl 进行检测 备注： 如果黄曲霉毒素的含量预计大于120 ppb，必须继续对样品继续进行稀释，而使用的样品稀释缓冲液中必须含有10 %的甲醇。（比如：9 ml 的样品稀释缓冲液 + 1 ml 的甲醇（100 %））。所有的样品都必须用含有10 % 甲醇的样品缓冲液进行稀释。 滤液可以在冰箱（2 - 8 °C）中保存2个星期，在冷冻条件下（-20 °C）可以保存两个月。应使用棕色玻璃瓶避光保存。 除了谷物和饲料样品外，同样适用于其他的食品样品。然而根据我们的经验，一些样品比如坚果、药草、调料和茶叶，若不使用免疫亲和柱进行样品处理，则会出现过高的背景值。因此我们建议您在检测此类样品时，索要RIDA Aflatoxin column 黄曲霉毒素免疫亲和柱（R5001 / R5002）的产品信息。可根据需求提供RID Aflatoxin column 黄曲霉毒素免疫亲和柱（R5001 / R5002）针对生咖啡样品的处理方法。 请注意，在使用RIDAAflatoxin column （R5001 / R5002）进行样品处理后，提取液需要在蒸馏水中进行1:10 的稀释。在这步稀释之后，如果还需要做任何稀释，请使用10%的甲醇/水溶液进行稀释。 10.  酶标免疫分析程序 10.1. 检测前的准备 使用之前将所有试剂回温至室温（20 - 25 °C）。洗涤缓冲液是PBS-Tween 缓冲液，为此试剂盒中提供了一袋洗涤缓冲液盐（参见4.）。使用1 l 蒸馏水溶解一袋洗涤缓冲液盐制得缓冲液。制备好的缓冲液可在2 - 8 °C 下保存大约4 - 6 周时间。或者： 用100 ml 蒸馏水溶解袋中的洗涤缓冲液盐，得到10 倍的洗涤缓冲液盐浓缩液，此溶液能在室温（20 - 25 °C）下储存8 - 12 周。使用时，用9 份蒸馏水溶解1 份此浓缩液得到洗涤缓冲液 10.2测定程序  （在20-25℃条件下操作） 仔细进行洗板的操作非常重要。在使用中不要让微孔出现干燥。 1. 将足够标准品和样品检测所需数量的孔条插入微孔板架。标准品和样品的位置。 2. 将50 μl 标准品或者按照步骤9处理后的样品加入相应的微孔中，均做两个平行实验。 3. 向每一个对应的微孔中加入50 μl酶连接物溶液 4. 向每一个对应的微孔中加入50 μl抗体溶液，充分混合后在室温下（20 - 25 °C)）在暗处孵育30分钟。 5. 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。加入250 μl洗涤缓冲液（参见10.1.）洗涤，上述操作重复进行两遍。 6. 向每一个微孔中加入100 μl底物/发色剂（棕色瓶盖），充分混合后在室温下（20 - 25 °C）暗处孵育15分钟。 7. 向每一个微孔中加入100 μl反应终止液（黄色瓶盖），充分混合。在加入反应终止液后30分钟内于450 nm处测量吸光度值。 11.  结果 所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。 标准的吸光度值（或样品）----------------------------------x100= %吸光度值 0标准的吸光度值 计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素B1浓度（µg/kg）的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度（µg/kg）可以从标准曲线上读出。 为了真实反映黄曲霉毒素的浓度ng/kg，从校正曲线上读出的浓度值必须乘以相对应样品的稀释倍数。按照说明中给出的方法进行操作，可得到以下样品稀释倍数： 谷物和饲料样品 .........................................35倍