【word】 软肝冲剂对肝纤维化大鼠组织金属蛋白酶抑制剂的影响

【word】 软肝冲剂对肝纤维化大鼠组织金属蛋白酶抑制剂的影响 软肝冲剂对肝纤维化大鼠组织金属蛋白酶 抑制剂的影响 ? 160?中西医结合肝病杂志2008年第18卷第3期 软肝冲剂对肝纤维化大鼠组织金属蛋白酶抑制剂的影响 莫其农 贺劲松 黄涛 周小舟 方晓艺 童光东 广州中医药大学附属深圳市中医院 周小梅何进才 熊益群周大桥 (广东深圳,518033)1.检验科2.体检中心3.肝病研究所 摘要目的:探讨软肝冲剂治疗肝纤维化和肝硬化的机制是否与抑制TIMP.1的达有关.方法:用CC1诱导 大鼠的肝纤维化模型(病理分期为0一V期),将大鼠随机分成两组,分别用软肝冲剂和生理盐水治疗2个月后.对 肝组织TIMP一1mRNA的表达进行,并检测羟脯氨酸(Hyp)的 量,同时检测血清中TIMP.1和TGF.131的浓度. 结果:软肝冲剂能够降低大鼠肝组织中TIMP一1mRNA的表达和胶 原蛋白的含量,同时血清中TIMP.1和TGF.131较 CC1诱导的模型组和生理盐水治疗组显着降低(P<0.05).结论:软 肝冲剂治疗肝纤维化可能通过阻止TIMP.1的表 达起作用. 关键词软肝冲剂/药理作用;组织金属蛋白酶抑制剂;肝纤维化;动物 模型 ResolutionofCCl4-inducedratliverfibrosisviaTIMP.1expressioninhibitio n byRuangangranule MOQi-nong,HUANGTao,FANGXiao—yi,eta1.LaboratoryMedicine,ShenzhenTraditionalChineseMedicineHospital (ShenzhenGuangdong,518033)China AbstractObjective:TostudytherelationbetweentheeffectofRuangangranul etoliverfibrosisandtissueinhibitorof metalloproteinases一1(TIMP一1)mRNAexpression.Methods:CC14一inducedratswererandomlydividedintotwogroupswhich weretreatedbyRuangangranuleandNormalSaline(NS)respectively.Theex pressionofTIMP一1mRNAandhydroxyprolinein livertissuewasanalyzed.AndserumlevelsofTIMP一1mRNAandTGF一 131weredetected.Results:TheexpressionofmRNAand collageninlivertissueofCC14一 inducedratstreatedbyRuanganchen~iweresignificantlydecreased,theserumlevelsofTIMP.1 andTGF-131weresignificantlydecreasedcomparedwiththoseofmodeland treatedgroups.Conclusion:Themechanismof NS— RuangangranuletreatmentforliverfibrosisispossibletobeblockadeofTIMP一1expressioninliver. KeyWordsRuangangranule;tissueinhibitorofmetalloproteinases-1(TIMP-1);liverfibrosis;animalmodel 细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)由胶原蛋白,特 别是I型胶原蛋白,和其他基质成分,如糖蛋白,透明质酸 组成,肝纤维化和肝硬化是ECM改变的结果”.J.以前认为 即使除去肝损伤的因子,肝纤维化也是不可逆的.但目前 认为肝纤维化是一个动态可逆的过程,这已在实验动物和临 床中得到证实,如用干扰素治疗病毒性肝炎.ECM的合成 和降解受到基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)和基质金属蛋白酶的组织抑制剂(tissueinhibitorsof metalloproteinases,TIMPs)的调节,其中MMPs能够降解 ECM中的成分,而TIMPs以1:1与MMPs形成非共价复合物 对MMPs进行调节』.在有4个TIMP组成的TIMPs家族中, TIMP-1的活性最强,其在肝纤维化和肝硬化的病理过程中起 重要作用”,并且其表达的强度与肝组织的纤维化程度一 致,可以作为肝纤维化和肝硬化的一个指标”]. CC1诱导的大鼠模型与人的肝纤维化和肝硬化的发展类 似.中医对肝纤维化的治疗有独特的疗效,根据中医理论组 建的软肝冲剂是深圳市中医院治疗肝纤维化和肝硬化的验方, 其临床疗效确切,但作用机制尚未明了.本课题研究软肝冲 剂对在肝纤维化和肝硬化形成中起重要作用的TIMP一1的影 响,为软肝冲剂的临床治疗提供实验依据. 1材料与方法 1.1药物组成软肝冲剂由黄芪,穿山甲,田七,丹参,桃 基金项目:深圳市科技局立项项目(No.JH200507130998A);A通讯作者 扣西医结合肝病杂志2008年第18卷第3期 仁,鳖甲,叶下珠,茯苓,枳壳等9味中药组成,由深圳市 中医院制剂室经水煎醇提,制成颗粒剂,每包10g. 1.2CC1诱导小鼠肝纤维化模型雌性Wistar大鼠,体重 150—180g(购自广州中医药大学),以40%CC1矿物油溶液 3ml/kg腹膜内注射,每周2次,共10周,对照的小鼠用矿物 油注射.随机取实验大鼠5只,病理检查为肝纤维化V期, 将已形成肝纤维化的大鼠随机分成软肝冲剂组12只,生理盐 水组12只,灌胃1次/d,软肝冲剂为10g/次,持续2个月. 正常组为10只.在处死前禁食1天,留血清和肝脏组织用于 分析.肝脏样品在液氮罐中冷冻,在4%甲醛中固定包埋,用 HE染色,肝纤维化程度用形态学分析评估,而胶原蛋白用 Hyp(hydroxyproline)进行定量分析. 13实时逆转录聚合酶链反应(Real—timeRT—PCR) 1.3.1肝脏组织在TRIzol试剂(invitrogenlifetechnologies, carlsbad,CA)中匀浆,RNA按试剂说明提取,琼脂糖凝胶 电泳检查RNA的提取质量.将RNA用P(dN)9作为随机引 物进行反转录后得到cDNA,然后进行几种细胞因子的real— timeRT—PCR分析. 1.3.2引物以B—actin作为内参,它们的引物如下,TIMP一1 的引物:TIMP.1一for:5’一TrcGTGGGGACACCAGAAGTC一 3’;TIMP一1一rev:5’一TATCTGGGACCGCAGGGACTG一3’; Actin—for:5’一GGAGAAGATGACCCAGATCA一3’:Actin— rev:5’GATC’Iq”CATGAGGTAGTCAG一3’. 1.3.3具体操作先对基因进行普通PCR,在琼脂糖凝胶上 每个基因只见到一条带,同时,用不含反转录酶的样品作为 对照,以确保RNA中不含DNA.然后进行定量PCR.3tzlcD— NA作为模板,每条引物25pmol,2.5110×PCR缓冲液, 2.5tzlUtaq聚合酶,1tzlSYBRGreenl,4jxl25mmol/LMgC12; 加水至总体积为25tzl.PCR反应在Rotor—Gene3000PCR扩增 仪(Corbettresearch,Australia)上进行. 1.4TIMP一1组化染色肝脏样品用paraffin包埋,冰冻切片, 厚度为4jxm,然后用链霉素一亲和素(streptomycinavidin—per— oxidase,SP)(购自MaximBiologicalTechnologyCompany)染 色,除去paraffin,用乙醇再水化.抗原修复后,用正常人血 清预孵育20分钟,除去非特异结合位点.然后用TIMP.1单 克隆抗体在4?过夜,用PBS洗3次,加第二抗体孵育3O, 4O分钟,又用PBS洗3次,加亲和素一过氧化物酶孵育2O分 钟,最后加DAB显色,然后用HE反染. 1.5肝纤维化程度的病理分期根据Wang15j等报道的病理 分期为0一?,对各组动物的肝组织标本进行病理分期. 1.6血清TIMP一1和TGF一131的浓度ELISA用于检测TIMP.1 和TGF.131小鼠抗大鼠的TIMP一1和TGF一131单克隆抗体(购 自AmericanMaximCompany).用ELISA读板仪(EL×800, Bio?TekInstruments,Inc,USA)在450nm确定TIMP一1的 水平. 1.7统计学方法数据采用t检验,P<0.05时,被认为差 异有显着性意义. ? 161? 2结果 2.1肝组织TIMP一1的免疫组化分析7只已肝纤维化大鼠用 生理盐水灌胃(从12只随机选择),病理分期为V期,图像 分析表示TIMP一1的表达主要见于肌纤维母细胞,纤维母细胞 和血管内皮细胞,特别在肝门区和纤维间隔.TIMP一1位于胞 浆内,在细胞核中未见到.软肝冲剂组的大鼠肝组织也见到 TIMP.1在肌纤维母细胞,纤维母细胞和血管内皮细胞有表达, 不过其信号较弱,表明软肝冲剂能够减少TIMP一1的表达,但 还不能完全抑制TIMP一1的表达. 2.2肝组织中TIMP一1mRNA的表达用Real—timePCR分析 大鼠肝组织中TIMP.1的mRNA的水平,见图1.在模型组中, TIMP.1的表达水平最高,其次为生理盐水,但差异无显着性 意义(P>0.05);软肝冲剂组大鼠肝组织TIMP一1的表达高于 正常组,但差异无显着性意义(P>0.05),低于生理盐水组 与模型组,差异均有显着性意义(P<0.05). 图1大鼠肝组织TIMP一1的表达水平 软肝冲剂组与生理盐水组和空白组比较,P<0.05;软肝冲剂组 与正常组比较,P>0.05. 2.3肝组织中Hyp检测情况见图2. 图2大鼠肝组织中Hyp含量检测 软肝冲剂组与生理盐水组比较,P<0.05;软肝冲剂组与正常组 比较,P>0.05 2.4肝纤维化的病理分期所有大鼠的肝脏组织均进行病理 分期,见表1.正常大鼠肝组织的纤维化程度为0期,而模型 组大鼠肝组织的肝纤维化程度为V,?期,生理盐水组大鼠 肝组织的肝纤维化程度,有9只为?一?期,3只为?一V 期,这表明当大鼠肝组织纤维化的诱导因素除去后,有自动 ? 162? 恢复的趋势,但不能完全恢复.而软肝冲剂组大鼠肝组织的 纤维化程度,有8只处于I一?期,有3只处于?,?期, 有1只处于0一I期,这表明处于肝纤维化V期的大鼠,服用 软肝冲剂3个月后,肝纤维化被逆转,并且与TIMP一1被抑制 的结果一致. 表1实验动物肝纤维化的病理分期 组别n0I???V? 正常组 生理盐水组 软肝冲剂组 模型组 2.5血清中TIMP一1和TGF一131的浓度用ELISA法检测不同 组大鼠血清中TIMP一1和TGF一131的浓度,模型组大鼠血清 TIMP一1和TGF一131浓度高于其他组(P<0.05),软肝冲剂组 大鼠TIMP一1和TGF一131浓度比正常组高,但差异无显着性意 义(P>0.05).见图3,图4. 图3大鼠血清TGF一131浓度检测 软肝冲剂组与生理盐水组和模型组比较,P<0.05 图4大鼠血清TIMP一1浓度检测 软肝冲剂与生理盐水组和模型组比较,P<0.05 3讨论 对肝纤维化和肝硬化的治疗目前还没有特异性的药物, 但中药治疗肝纤维化和肝硬化已得到临床的证明.软肝冲剂 中西医结合肝病杂志2008年第18卷第3期 以叶下珠解毒清热,抗病毒,去除肝纤维化的诱因,阻止肝 硬化的形成,同黄芪,茯苓配伍,又具除湿利水之功;黄芪 益气补虚,调节机体免疫功能,鳖甲味咸微寒,有滋阴潜阳, 软坚散结等功效,二者可奏补气养阴之功,同时又可制约穿 山甲耗气伤阴之弊;穿山甲活血祛瘀,抗肝损伤及纤维化; 另外,黄芪,茯苓,枳壳相伍有行气健脾之效,丹参,三七, 桃仁相伍有养血活血之功.全方以益气补虚的黄芪和活血软 坚的穿山甲为主药,并辅以叶下珠解毒清热利湿,诸药配伍, 扶正祛邪,攻补兼施,共奏解毒清热,益气活血,消瘀散结 之功效. 本实验结果表明软肝冲剂对CC1诱导的肝纤维化有明显 的改善作用,病理分期为V,?的大鼠肝组织经软肝冲剂治 疗后,其病理分期多改善到I,?期.软肝冲剂组大鼠肝组 织Hyp定量也较模型组和生理盐水组少.以前我们的实验证 实.n,软肝冲剂能抑制Ang?诱导肝星状细胞(HSCs)上调 基因的表达,包括细胞外基质的基因表达,如Collagen6 (IV),Collagen1(VI),Collagen4(VI),Collagen1(I) 和Collagen2(VI),使HSCs分泌的胶原蛋白减少,生长因子 /细胞因子,如IGF—bindingprotein-5,TGF一2,TGF一1reeeptor, EGFreceptor表达减少,软肝冲剂能抑制Ang?诱导的细胞因 子TGF一1,TGF一2,IL一13,IL一15,MCP一2的表达.本次实验 中,免疫组化和实时定量PCR证明了CC1诱导的肝纤维化大 鼠经软肝冲剂治疗后,肝组织中TIMP一1的表达明显减少,血 清中TIMP一1和TGF一131的浓度明显降低,并且肝纤维化的严 重程度与TIMP-1的表达是一致的.软肝冲剂治疗肝纤维化和 肝硬化的一个可能机制与抑制TIMP一1的表达有关. 我们用软肝冲剂治疗慢性乙型肝炎患者,患者血清中 TIMP.1和TGF一81的浓度降低,而MMP.1的浓度增加,并且 与患者肝功能的生化指标ALT和AST正相关.这些研究资 料表明血清中TIMP.1与肝组织中TIMP.1的水平相关,证明 了TIMP.1能够作为肝纤维化和肝硬化程度的一个指标.有研 究表明在用CC1诱导的大鼠模型中,TIMP.1的单克隆抗体抑 制TIMP.1的活性能够减轻肝纤维化193.Nie等证明用反义核 苷酸抑制TIMP.1的表达能够逆转CC1诱导的肝纤维化_如j. Yoshiji等用TIMP一1转基因小鼠证明TIMP-1能抑制肝星状细 胞的凋亡,显着地减弱CC14诱导的肝纤维化的恢复.所 以,针对TIMP-1的治疗可能是肝纤维化和肝硬化治疗的一个 理想靶位. (本课题得到深圳市中医院肝病研究所和清华大学深圳研 究生院郑义博士提供大力技术支持,在此表示真诚感谢!) 参考文献 1OlasoE,FriedmanSLMolecularregulationofhepaticfibrogenesis.JHepa- 847 tol,1998,29:836— 2ArthurMJ.Degradationofmatrixproteinsinliverfibrosis.PmhdRes— Pract,1994,190:825?833 3WoessnerJFJr.Matrixmetalloproteinasesandtheirinhibitorsinconnec— tivetissueremodeling.FASEBJ,1991,5:2145-2154 4BonisPA.FriedmanSL,KaZanMM.Isliverfibrosisreversible?N 0003 0207 07O0 0320 0080 0020 000 0220 中西医结合肝病杂志2008年第18卷第3期 EnglMed.2001,344:452454 5DufourJF,DelelisR,KaplanMM.Regressionofhepaticfibrosisin hepatitisCwithlong-terminterferontreatment.DigDisSci,1998,43: 2573.2576 6GomezDE,AlonsoDF,YoshijiH,eta1.Tissueinhibitorsofmetallo- proteinases:structure,regulationandbiologicalfunctions.EurJCell 122 Bio1.1997.74:111— 7IredaleJP,BenyonRC,PickeringJ,eta1.Mechanismsofspontaneous resolutionofratliverfibrosis.Hepaticstellatecellapoptosisandreduced hepaticexpressionofmetalloproteinaseinhibitors.JClinInvest,1998, 102:538-549 8KossakowskaAE,EdwardsDR,LeeSS,eta1.Alteredbalancebe- tweenmatrixmetall0pr0teinasesandtheirinhibitorsinexperimentalbili— aryfibrosis.AmJPathol,1998,153:1895-1902 9HerbstH,WegeT,MilaniS,eta1.Tissueinhibitorofmetalloprotein- ase-1and-2RNAexpressioninratandhumanliverfibrosis.AmJ Patho1.1997,l50:l647—1659 10WatanabeT,NiiokaM,HozawaS,eta1.Geneexpressionofintersti- tialcollagenaseinbothprogressiveandrecoveryphaseofratliverfibro- sisinducedbycarbontetrachloride.JHepatol,2000,33:224-235 11BenyonRC,IredaleJP,GoddardS,eta1.Expressionofinhibitorof metalloproteinases1and2isincreasedinfibrotichuman liver.Gastroenterology,1996,110:821—831 12MurawakiY,IkutaY,IdobeY,eta1.Tissueinhibitorofmetallopro- teinase一1intheliverofpatientswithchronicliverdisease.JHepatol, 1997,26:1213-1219 ? 163? 13KasaharaA,HayashiN,MochizukiK,eta1.Circulatingmatrixmet- alloproteinase--2andtissueinhibitorofmetalloproteimase--1asserum markersoffibrosisinpatientswithchronichepatitisC.Relationshipto interferonresponse.JHepatol,1997,26:574-583 14YoshijiH,KuriyamaS,YoshiiJ,eta1.Tissueinhibitorofmetallopro- teinases--1attenuatesspontaneousliverfibrosisresolutioninthetrans-- genicmouse.Hepatol,2002,36:850-860 15WangBE,WangHJ,ZhuJX.Experimentalstudyandclinicalobser- vationofhepaticfibrosisusingdifferentdosageformofcompoundDan- Shenroot.ZhonghuaGangzhangbingZazhi,1993,1:69-70 l6周大桥.软肝合剂防治肝纤维化的实验研究.中西医结合肝病杂 志,1995,5(2):26-27 l7莫其农,黄涛,方晓艺,等.软肝冲剂抑制血管紧张素?诱导的 肝星状细胞上调基因的表达.中西医结合肝病杂志,2007,17 (3):147—150 l8莫其农,黄涛,方晓艺,等.软肝冲剂对慢性乙型肝炎患者血浆 中TGF-131,MMP-1和TIMP-1浓度的影响.医药月刊,2007,4 (7):104—107 19ParsonsCJ,BradfordBU,PanCQ,eta1.Antifibroticeffectsofatis- sueinhibitorofmetalloproteinase-1antibodyonestablishedliverfibrosis inrats.Hepatol,2004,40:1106-1115 20NieQH,ChengYQ.XieYM,eta1.Inhibitingeffectofantisenseoli- gonucleotidesphosphorthioateongeneexpressionofTIMP-1inratliver fibrosis.WorldJGastroentero,2001,7(3):363-369 (收稿日期:2008—0l—l4编辑:胡肃平) (上接第139页)促进肝纤维化的降解与吸收等机制 发挥化纤溶纤的功效,能降低PC111,HA,LN,?一c 的水平,促进肝细胞表面纤维组织的吸收,改善肝脏 细胞的通透性,促进肝细胞的代谢,他,?]. 在我们的I临床观察中,安络化纤丸联合IFN一治 疗血吸虫病肝纤维化患者6个月,血清肝纤维化4项 指标及肝功能指标下降水平均优于对照组.因此,安 络化纤丸联合IFN一可作为血吸虫病肝纤维化的治疗 选择之一,两者联合应用相得益彰,能更好地发挥药 效. 参考文献 1唐结婷,房静远.一干扰素对肝纤维化的影响.中华消化杂志, 2003,23(6):368—370 2张岫美,张斌,魏欣冰.安络化纤丸对急慢性肝损伤的保护作用. 中国生化药物杂志,1999,20(1):27—30 3中华人民共和国.中华人民共和国国家.日本血吸虫病诊断 标准和处理标准.UDCGB15977.1995 4中华肝脏病学会肝纤维化学组.肝纤维化诊断与疗效评估共识. 中华肝脏病杂志,2002,10(5):327—328 5乌文琳,周学章,黄育英,等.吡喹酮治疗日本血吸虫病远期疗 效分析.中华传染病杂志,2004,22(4):238—241 6佘会元.安络化纤丸治疗慢性乙型肝炎35例.中西医结合肝病杂 志,2003,13(4):240—241 7张振鄂,王志忠,周江华.血清Pcm,HA,LN,?.C在肝病中 的临床意义.中西医结合肝病杂志,1999,9(4):16 8谢仕斌,姚集鲁,郑树森,等.血清纤维化指标水平与肝组织纤 维图像分析的关系.中华肝脏病杂志,2000,8(6):203 9WengHL,CaiWM,LiuRH.Animalexperimentandclinicalstudyof effectofgamma-interferononhepaticfibrosis.WorldJGas2troentero1. 2001,7(1):45-51 l0翁红雷,蔡卫民,汪国运,等.干扰素2抗肝纤维化的动物实 验研究.中华肝脏病杂志,1999,7(1):33—35 11翁红雷,蔡卫民,杨艳红.血吸虫感染兔I型和?型胶原动态变 化及_2干扰素对其作用.中国寄生虫与寄生虫病杂志,2001, l9(1):18—22 l2余为民,胡德昌,周朝晖,等.肝平胶囊治疗慢性乙型肝炎病人 血清纤维化指标的I隘床疗效观察.肝脏,2002,7(4):254— 256 l3陈悦,汤守兵,盂忠吉,等.安络化纤丸治疗慢性乙型肝炎早期 肝硬化20例.中西医结合肝病杂志,2004,14(6):369—370 (收稿日期:2008—03—13编辑:姚昌绶)