【doc】 人成熟卵泡液在卵母细胞体外成熟培养基中的作用

【doc】 人成熟卵泡液在卵母细胞体外成熟培养基中的作用 人成熟卵泡液在卵母细胞体外成熟培养基 中的作用 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2005Aug;40(4)’387? ?技术与方法? 人成熟卵泡液在卵母细胞体外成熟培养基中的作用 赵济华曹云霞魏兆莲周平丛林章心=E-国李芬张文香 摘要目的探讨人成熟卵泡液,血清替代物对人未成熟卵 母细胞体外成熟及发育的影响.方法在基本培养液中加 入人成熟卯泡液(humanfolliclefluids,HFF)(A组),或血清 替代物(serumsubtitutesupplement,SSS)(B组)用于未成熟 卵母细胞的体外培养(invitromaturation,IVM),观察成熟率 及进一步发育能力.结果两组之问成熟率,受精率差异无 显着性,A组的卵裂率,优质胚胎率及I临床妊娠率明显高于 .结论卵母细胞在两种培养液中均能完成核成熟,但 B组 人成熟卵泡液能同时促进卵母细胞的胞质成熟,两者相比 HFF效果更好. 主题词卵母细胞/出生和发育;卵泡液 中图分类号R321—33;R322.65;R329.2 文献标识码B文章编号1000—1492(2005)04—0387—02 随着体外受精一胚胎移植(IVF.ET)技术的发 展,未成熟卵母细胞体外成熟技术成为治疗不孕症 的一种新途径,在辅助生殖技术领域里得到越来越 多的应用和发展.虽然有大量的关于哺乳类和人类 未成熟卵母细胞体外成熟的能力和机制的研究,体 外培养(invitromaturation,IVM)的妊娠率仍然较 低,培养液一直是卵母细胞IVM技术的一项关键内 容.卵泡液是卵母细胞在发育过程中必不可少的体 内环境,它所含的多种激素,酶,蛋白质,细胞生长因 子等物质对卵母细胞的成熟和排放起着重要的营养 和调节作用.该研究模拟体内的成熟状态,将培养 液中加入人成熟卵泡液或血清替代物来研究它们对 IVM的影响. 1材料与方法 1.1研究对象2003年7月至2004年11月在我 院生殖中心行IVM治疗共51患者66个周期,年龄 23,38岁,平均28.74岁,自愿并知情接受未成熟 卵体外成熟技术的治疗. 1.2卵巢刺激及子宫内膜准备常规的促排 2004—12—30收稿,2005—01—27修回 作者单位:安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心,合肥 23(x】22 作者简介:赵济华,女,50岁,主管技师; 曹云霞,女,40岁,教授,硕士生导师 卵方案:克罗米芬50,100mg/a,周期第3,5天开 始口服,连服5d或尿促性素75,150mg/a,从周期 第3天起肌肉注射.每个周期均从周期第8,11天 开始B超监测卵泡直径和子宫内膜厚度,决定IVM 当El晚9时肌肉注射10000单位的人绒毛膜促性腺 激素,注射后36h行取卵术.一般取卵El患者的子 宫内膜厚度达8mm以上,卵泡8,10mm,无优势 卵泡出现. 1.3成熟卵泡液的准备 1.3.1收集HFF的患者选择收集IVF或单精子 胞浆内注射(ICSI)治疗患者采卵时的成熟卵泡液, 为防止感染应排除艾滋病,梅毒,乙型肝炎抗原阳性 患者,对于年龄>40岁,患有子宫内膜异位症,免疫 性不孕,不明原因不孕患者也排除在外,同时需考虑 患者的年龄,不孕原因,卵泡大小,卵子成熟程度以 及HFF中血液污染的情况. 1.3.2人成熟卵泡液的处理收集的卵泡液进行 离心3000r/min,30min,去除红细胞和其余杂质, 置于56?水浴箱中灭活30min后,用0.22m的 分子筛过滤除菌,一20~12冰箱冷冻保存,确定收集 HFF的患者在本次IVF/ICSI周期妊娠后,才将收集 的HFF用于体外成熟的培养基?j. 1.4IVM试剂的准备主要准备IVM冲洗液及 IVM培养液,所有的液体均需在采卵的前1d下午 准备好,置37oC,5%CO:的孵箱中平衡. 1.4.1IVM冲洗液主要应用磷酸盐缓冲液 (PBS)或者0.9%生理盐水(NS),将抽吸的含卵丘 复合物(COCs)的卵泡液采集在l0ml试管(Falcon) 中,为防止抽吸液凝血,管内放2ml抗凝预热的冲 洗液(含2X10IU/L的肝素). 1.4.2IVM培养液准备及方案基本细胞培养液: TCMI99(Sigma,USA),0.075×10IU/L促卵泡素 (FSH,Serono,瑞士),0.5X10IU/L绒毛膜促性腺 激素(HCG,Serono,瑞士),0.2mg/L雌二醇(E, Sigma,USA).A组:基本细胞培养液+15%HFF, B组:基本细胞培养液+10%SSS(Irvine,USA). 1.5未成熟卵母细胞的采集及捡出在阴道探头 B超介导下行卵子抽吸术,使用取卵针17.K.OPS. 388?安擞匡科学Al:tar*titzti~Medici~mlis4nh.I2005AL]g;40(4 1人成熟卵泡蒗殛血清替代物对卵母细胞成聃的影响 l035一RWH.E_rcCOOK公J.澳赶利亚)在负雎下进 行,在取卵的过程c需勤拽试管.【l防凝血..应H1细 胞筛(200目数,75la.rl1)过滤池抽吸液.主要去 除红细胞.再n{含l{fs的培养液冲洗至液体澄清, 透亮以方便捡卵.将含(:IPCs的培养液倒入培养皿 (Falcon),在体视显敞镜下捡卵,卵母细胞周匍 印丘包裹紧密观察确定来成熟印,随后放人体 外成熟培养赦中培养所有过程均在37qC的热台 上进行 1.6卵母细胞的IVM和受精行IVM治疗的患 者随机采用上述方案A或B,在37,5%CO恒温 箱中培养24—48h,显馓镜F观察印母细胞的形态, 卵丘细胞的松散程度.以第一极体排出为卵母细胞 成熟的标忐一日印母纽l眦成熟.行[CS1.受 精l6,l8lI后观察有无匣棱出现.蹦出现烈原核及 双极体为受精的标志受精后帮!灭或第3天评定 胚胎质量并目仟胚胎移植术lemb~otransfe~. ET).ET后l4tl洲硪HCG确定是否妊娠,ET后35 d行B超检查确定有无孕囊,芽厦心管搏动. 一??图I(;v期禾成熟即圈2体外或融的MII拥卵 图3IVM成熟卵行ICSI时 1.7统计分析以,检验和x检验进斤统汁分 析.以尸<0.05为差异彳r显着性 2结果 2.1不同培养液对卵母细胞成熟率的影响A组: 卵母细胞体外成熟率(M1I率J72.2%(473/6551,B 组:M?率701%(54/77I,进行阿比较,A,B组 之间差蛙善性(fJ>005) 2.2不同培养液对卵母细胞受精,卵裂及优质胚胎 率的影晌表Il: 2.3两组培养液对IVM临床妊娠率的影响A组 44例患肴共57个周期中,临床妊娠14例.其中I 例足月分娩一男一女,两例胚眙停止发育,其他继续 妊娠中:B组7例共9个周期中.临床妊娠1例,在 孕8周时胚H奇停止发育. 3讨论 卵泡澈山向浆渗出物和局部的分泌物如氨基多 糖午}】类固醇激素等组成,由于卵巢血管并未穿过卵 泡基膜进1,\印泡上皮.因此卵泡液的化学成分与血 清有所不同滚蛋白主要为纤维母细胞生长因子, 井且在培养摹中增加纤维母细胞生长因子的浓度会 不利于胚胎发育到桑椹期或囊胚期提示卵泡液培 养基中胚胎毒性物质较jIIL清培养基中少.研究比较 了HFI’和SSS对人类求成熟卵母细胞IVM的作用, 结果发现两组未成熟卵母细胞的成熟率及受精率无 明成熟 受精壁肺腑侈忸中华妇杆朵忐,2003~38(41:230—2 4nIt,CO…M.Tuomi~mJfL?prelacy憎吕_ chie~linputie,ltsIreatedwithintm,yt,.pl~miespem~injectiondue t0reviIMIs1…1rfailedfe1】l柚ll|1n…in—vitrofertifiz,atit)nHum fiepr,.:Jl098I3fI);65—0 5KanavaHVukIJ’IHA.OkuH”f1,1~’iLmrrmlumtlon0Fimmature lHK【IIl1ll1uhuremediaq~plerm-lIIwithlxatient.…tom paredtm~]iawithfollicularflllir]FerfilSle61.2t304;82【2): 25,6