EdU细胞增殖检测（荧光显微镜检测）

1 Cell-Light TM EdU 荧光显微镜 检测试剂盒 使 用 说 明 书 v 1.0 For the Research use only, not for diagnostic or therapeutic uses. Cat. No. C10310/C10312 广州市锐博生物科技有限公司 2 组成和储存 Cat. No. C10310 Size: 100 tests Cat. No. C10312 Size: 200 tests Cell-Light TM EdU荧光显微镜 检测试剂盒(适用于细胞增殖研究)包括以下组分： 试剂 C10310 C10312 浓度 储存条件 C00003 EdU溶液（试剂 A） 20 µL 40 µL 1000X C00012 EdU反应缓冲液（试剂 B） 500 µL 1 mL 20X C00017 EdU催化剂溶液（试剂 C） 100 µL 200 µL 100X C00031 Apollo®荧光染料溶液（试剂 D） 30 µL 60 µL 300X C00019 EdU缓冲添加剂（试剂 E） 100 mg 200 mg 粉末 C00033 Hoechst 33342（试剂 F） 150µL 300µL 100X •2–6˚C储存 •干燥 •避光 •勿冻存 •按保 存可稳定储 存半年 注：试剂配置前请短暂离心，荧光染料溶液离心时请避光。 产品说明 本试剂盒将直接测定细胞内DNA的变化，适用于细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、生长与发育、DNA修 复、病毒复制等方面的研究，能够进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。Cell-LightTM检 测方法基于EdU与Apollo®荧光染料的完美结合准确检测细胞内的DNA，简单，快速，准确。 EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine，5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其乙炔基团 在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，基于EdU与染料的共轭反应可以高效 快速地检测细胞增殖，可以有效地检测处于S期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比， 更简单，更快速，更准确。EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性 (酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情 况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。 图1 EdU能有效测定Hela细胞增殖 3 实验方法 检测方法简便，只需三步即可细胞增殖数据：EdU孵育样品；细胞固定化；Apollo®染料检测 EdU。 图2 Cell-LightTM EdU检测方法示意图 实验准备 自备物品 • 完全细胞培养液：用于支持细胞生长的营养液 •96孔板或其他规格板(依据您的培养需求) • 去离子水 • PBS溶液, pH 7.2~7.6 • 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS) 注：甲醛可代替多聚甲醛，但有可能对细胞产生较大破坏； • 渗透剂(含0.5% TritonX-100的PBS) • 甘氨酸溶液（2 mg/mL） 4 试剂准备 图3 试剂配置示意图 注：试剂配置前请短暂离心 ：避光保存 • 制备1X Hoechst33342反应液：Hoechst 33342 (试剂F) 按1：100比例用去离子水进行 稀释，避光保存； • 按下制备适量的1X Apollo®染色反应液： 1) 请按下列顺序依次配置Apollo®染色反应液，以免破坏正常的反应体系：去离子水—EdU 反应缓冲液（试剂B）-- EdU催化剂溶液（试剂C）-- Apollo®荧光染料（试剂D）—EdU缓 冲添加剂（试剂E）； 2) Apollo®染色反应液容易氧化，随时间的推移可能影响Apollo®染色反应液的反应效力，需 现用现配。 3) 以下实验配置以96孔板为例，您也可以根据自己的实验目的，使用6孔板/12 孔板/24孔板进行孵育，配置试剂使用量请适当调整，Apollo®染色反应液以浸没细 胞为宜，确保EdU染色充分。 5 表1 Apollo®染色反应液的配置比例 96孔板 Apollo®染色反应液 10孔 50孔 100孔 去离子水 938 µL 4.69 mL 9.38 mL EdU反应缓冲液（试剂B） 50 µL 250 µL 500 µL EdU催化剂溶液（试剂C） 10 µL 50 µL 100 µL Apollo®荧光染料溶液（试剂D） 3 µL 15 µL 30 µL EdU缓冲添加剂（试剂E） 9 mg 44 mg 88 mg 总体积 1 mL 5 mL 10 mL 6 实验步骤 图4 Cell-LightTM EdU检测步骤流程图 注：实验时间仅供参考 7 EdU标记细胞 培养基、细胞类型、细胞密度、培养时间、细胞活力等因素都可能影响EdU的标记效 率，我们建议使用50µM EdU培养基孵育，但您可以在预实验时根据细胞类型和实验目的 以一系列浓度(10~100µM)的EdU培养基孵育进行优化。以下依据A549细胞系的实验结果 得出的经验值，仅供参考。 孵育时间 细胞增殖率 EdU浓度 <45分钟 ~10% 较高浓度 50~100 µM 2小时 ~30% 中浓度 ~50 µM >24小时 ~80% 较低浓度 10~50 µM 以下方法已于A549、Hela等细胞系验证，但不同细胞类型之间有一定差异，可以先做 一个时间梯度，找出合适的孵育时间。该试剂盒将直接检测细胞中EdU孵育期间的DNA合 成情况，判断增殖细胞的种类及增殖速度，全面分析增殖细胞的定位、分布。 1.1 接种适当数量细胞于96孔板，用完全细胞培养液（可以含抗生素）培养过夜； 1.2 制备50µM EdU培养基：用细胞培养液以1：1000的比例稀释EdU溶液（试剂A）。 由于细胞之间的差异，最佳EdU的终浓度和培养时间可根据具体实验调整； 1.3 培养至合适阶段后（贴壁细胞贴壁，悬浮细胞密度达到合适），弃培养液，每孔 每次加入100 µL 50µM EdU培养基孵育2小时（加入EdU培养基的量可以<100µL，但 以没过细胞为宜；孵育时间，孵育浓度可以根据具体实验进行优化）。 细胞固定化 2.1 弃培养液； 2.2 每孔加入100 µL 细胞固定液（即含4% 多聚甲醛的PBS）室温孵育15~30 分钟； 2.3 2 mg/mL 甘氨酸孵育10分钟； 2.3 PBS冲洗2次； 2.4 弃上清，每孔加入100 µL渗透剂（0.5% TritonX-100的PBS）透化细胞； 2.5 PBS冲洗1次。 EdU检测 3.1 每孔加入100 µL的1X Apollo®染色反应液，避光，室温孵育30分钟（孵育时间可以根 8 据具体实验进行优化）； 3.2 每孔每次加入100 µL PBS 冲洗1次，沉淀细胞，弃上清； 如果需要进行细胞核染色，请接下来进行DNA染色步骤操作；如果无需进行细胞核染 色，请跳过DNA染色步骤，直接进行图像获取及分析操作。 DNA染色 4.1 弃上清，每孔加入100 µL 1X Hoechst 33342反应液，避光，室温孵育10-30分钟； 4.2 每孔每次加入100 µL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)冲洗若干次，洗脱Hoechst 33342反应液。 图像获取及分析 5.1 下表列有相应荧光染料的波长； 荧光染料 Excitation(nm) Emission(nm) Filter(nm) Apollo® 567 550 565 555±15 Apollo® 643 643 667 635±15 Hoechst 33342 350 461 488±15 相关文献 1. Salic A, et al. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 19;105(7):2415-20. 2. Chehrehasa F, et al. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. J Neurosci Methods. 2009 Feb 15;177(1):122-30. 3. Limsirichaikul S, et al. A rapid non-radioactive technique for measurement of repair synthesis in primary human fibroblasts by incorporation of ethynyl deoxyuridine (EdU). Nucleic Acids Res. 2009 March; 37(4): e31 4. Veres TZ, et al. Dendritic Cell-Nerve Clusters Are Sites of T Cell Proliferation in Allergic Airway Inflammation. Am J Pathol. 2009 March; 174(3): 808–817. 5. Michelle Warren, et al. Chick embryo proliferation studies using EdU labeling. Dev Dyn. 2009 Apr;238(4):944- 949. 6. Aparicio T, et al. The human GINS complex associates with Cdc45 and MCM and is essential for DNA replication. Nucleic Acids Res. 2009 April; 37(7): 2087–2095. 7. Kaiser CL, et al. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 2009 Sep;119(9):1770-5 联系方式 广州市锐博生物科技有限公司 广州市萝岗区科学城国际企业孵化器D906 电话: (020) 32290221 传真: (020) 32290137 本公司产品仅用于实验研究，不详之处请致电020-32290221 或E-mail至support@ribobio.com。