采用HPLC法柱前衍生检测乳粉中的牛磺酸

签复 鱼 鱼 丝 丝 ——— — — — 采用 HPLC法柱前衍生乳粉中的牛磺酸 张志国 刘 宁 贾云虹 谢 焱。 李 琦 1(石家庄三鹿集团股份有限公司 ，石家庄 ，050071)； 2(农业部乳品质量监督检验测试中心，天津，300381) 3(中国绿色食品发展中心，北京，100081) 摘 要 建立 了用 2，4一二硝基氟苯作为柱前衍 生试 剂，采用高效液相色谱仪 ，紫外检测器成功检 测出乳粉中牛磺酸含量的。色谱柱为C一18柱，在室温条件下采用磷酸盐缓冲溶液作为流动 相，测得的曲线的相关系数为0．999 9，回收率为在 96．25％～103．2％之间，方法的变异系数 为 2．79％，方法能满足使用要求。 关键词 高效液相色谱 ，乳粉 ，牛磺酸，柱前衍生 牛磺酸普遍存在于动物乳汁、脑与心脏中， 在肌肉中含量最高，以游离形式存在，不参与蛋 白质代谢。婴幼儿如果缺乏牛磺酸，会发生视 网膜功能紊乱与生长、智力发育迟缓 ，从而影响 到婴幼儿的生长、视力、心脏与脑的正常发育。 牛磺酸与胆酸结合后形成胆盐 ，牛磺酸缺乏会 减少胆盐的生成量，使脂肪的吸收发生紊乱。 这种情况对未足月的婴儿当喂养缺乏牛磺酸的 配方乳时容易发生，只有配方乳中补充牛磺酸 才能纠正。而牛乳中的牛磺酸含量很少，仅有 0．01／~mol／mL，而人乳中却有 0．25／~mol／mL， 人体肝脏中合成牛磺酸的胱氨酸一亚磺酸脱羧 酶数量很低。因此婴幼儿配方乳及乳粉中要添 加一定数量的牛磺酸⋯。目前国家标准中要 求婴幼儿配方乳粉中必须添加牛磺酸(≥0．30 mg／g)。 常用的牛磺酸检测方法有：酸碱滴定法、荧 光法、氨基酸仪法、薄层扫描法和高效液相 色谱法等【2 j。目前乳制品中牛磺酸的检测 以高效液相色谱法为主，我国国家标准 GB／T 5413．26—1997中规 定“婴幼 儿配方食 品和乳 粉中牛磺酸”采用高效液相色谱柱后衍生法进 行测定。该方法需要钠离子氨基酸分析专用 柱、氨基酸柱后反应器、衍生剂驱动泵等专用辅 助仪器，成本较高。本研究基于高效液相色谱 第一作者：学士 ，工程师。 *国家科技部“十五”科技攻关课题资助(No．2002BA518A10) 收稿时问：2004一O6一O1，改 回时间 ：2004一O7—13 (100) 法的优势和牛磺酸的相关理化性质采用柱前衍 生的技术对乳粉中牛磺酸含量进行测定。 1 试验仪器与材料 1．1 主要仪器 高效液相色谱仪，紫外检测器 ，N2000色谱 工作站 。 1．2 试 剂 牛磺 酸 (Sigma试 剂 )，2，4一二硝基 氟苯 (DNFB，Sigma试剂)，乙腈(色谱纯)，NaHCO3， Na2HPO4，NaHPO4，偏磷酸。 1．3 试验样品来源 本试验所用样品为三鹿集团生产的婴幼儿 配方乳粉。 1．4 色谱条件 流动相： 磷酸盐缓冲溶液(pH 7．5)]：V[乙 腈(色谱纯)]：V(水)=72：13：15。分离柱：反 相 C一18柱 (250 mm×4．6 mm i．d．，5 ptm)；流 动相流速：1mL／min；柱温：室温；检测波长： 360 nm 。 2 试验方法 2．1 分析方法的确定 目前国家标准 GB／T 5413．26—1997中规 定“婴幼儿配方食品和乳粉牛磺酸”是采用高效 维普资讯 http://www.cqvip.com 液相色谱柱后衍生法进行测定。该方法需要钠 离子氨基酸分析专用柱、氨基酸柱后反应器、衍 生剂驱动泵等专用辅助仪器。采用柱前衍生法 则不需要上述仪器，而目前柱前衍生试剂主要 有邻 苯 二 甲醛 (OPA)和 2，4一二 硝 基 氟 苯 (DNFB)。采用 OPA作为衍生试剂，测定条件 要求严格，易受外界条件干扰，不易操作。 国家标准中规定婴幼儿配方乳粉中牛磺酸 的含量≥0．3mg ，本研究根据牛磺酸的理化 性质，采用高效液相色谱仪 ，2，4一二硝基氟苯 (DNFB)柱前衍生的方法对样品中牛磺酸含量 进行分析[ ，引。 2．2 标准 曲线的制备 (1)精确称取牛磺酸标准品 10 mg，置 100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即 为牛磺酸标准溶液。 (2)精确吸取上述牛磺酸标准溶液 0．1、 0．2、0．3、0．4、0．5 mL，分别置于 10 mL容量瓶 中，加蒸馏水使总体积均为 0．5 mL(标准曲线 的浓 度 分 别 为 0．01、0．02、0．03、0．04、0．05 mg／mL)，然后依次加入 1．215 mol／L NaHCO 溶液 1．5 mL，0．65％2，4-二硝基氟苯乙睛溶液 0．7 mL。摇匀，置(55±2)℃水浴中避光加热 60 min后取出，加 pH 7磷酸盐缓冲液至刻度， 摇匀，分别取 3 L进样测定，以浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，进行线性回归。 2．3 样品处理 2．3．1 样 品处理 精密称取一定量的乳粉样品，用 10 g／L偏 磷酸溶液 60 mL转移至 100 mL容量瓶 中，放 入超声波中震荡 6 min取出，定容至刻度，混 匀 ，静置，过滤。 2．3．2 样品分析 吸取上述样品溶液 0．5 mL，置于 10 mL 容量瓶中，其余同 2．2(2)。根据保 留时间定 性，从标准曲线上查出相应的样品溶液的浓度 C(mg／mL)。 2．4 计算 用下面公式计算样品中牛磺酸含量 A ： ×100 ，，z 式 中：A——样 品 中牛 磺 酸 的 含 量，mg ； C——从标准曲线上查出的样品溶液中牛磺酸 的浓度，mg／mL； ——样 品液 的体积，mL； ，，z——样品的质量 ，g。 3 结果与讨论 3．1 最大吸收波长的确定 利用试 剂空 白调 零 ，对 2，4一二 硝基 氟苯 (DNFB)和牛磺酸标准溶液衍生产物分别进行 最大吸收波长的测试 ，结果见图 1、图 2。 图 1 DNFB最大吸收波长曲线 图 2 牛磺酸最 大吸收波长曲线 从最大 吸收波 长 曲线 可 以看 出 DNFB对 牛磺酸衍生产物的最大吸收值不产生影响。由 此确定检测时牛磺酸衍生物的最大吸收波长为 360 nm。 3．2 标准曲线的绘制 对配制好的标准溶液分别上机测定并计算 回归方程及相关系数，结果见表 1。 (101) 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 1 牛磺酸标 准曲线测定结果 牛磺酸质量浓度／nag·mL 色谱峰面积 0．01 0．02 0．03 0．04 0．05 110 418 219 063 330 791 442 951 552 108 根据表 1中的数据，由最小二乘法计算出 牛磺 酸 标 准 衄 线 的 线 性 回归 方 程 Y = 1107 27x一1 114．2，相关 系数 r=0．999 9。 色谱峰面积与牛磺酸含量呈正相关，线性关系 良好，可用于乳粉中牛磺酸含量的外标法进行 定量检测 。 3．3 衍生条件 的选择 针对 DNFB作为衍生剂 的特点 ，本研究通 过对衍生剂的浓度及使用量、试剂碱性条件和 缓冲溶液的使用量等衍生条件进行改进 ，保证 了牛磺酸和其他组分的有效分离，提高了分离 度和样品测试的重现性。牛磺酸标准品和乳粉 样品的色谱图见图 3、图 4。 图3 标准牛磺酸色谱图 图 4 样 品中牛磺 酸色谱 图 3．4 方法的精密度试验 以三鹿集团生产的婴幼儿配方乳粉为样 品，对同一样品进行 8次试验，结果见表 2。 (102) 表 2 精密度测试结果 由表 2中的数据可以得出，同一样品检测 结果 的相对标准偏差 (RSD)％ =2．79，重现性 较好，可以满足婴幼儿配方乳粉中牛磺酸含量 的分析要求。 3．5 方法的回收率试验 以三鹿集团生产的婴幼儿配方乳粉为样 品，加入已知含量的标准牛磺酸，按照确定的试 验步骤进行检测 ，结果见表 3。 表 3 牛磺酸 回收率 实验结果 20．81 31．21 41．62 52．02 62．43 20．03 31．96 42．97 51．33 62．56 96．25 lO2．4 lO3．2 98．67 1o0．2 从表 3中可以看出5次添加测定的回收率 在 96．25％～103．2％，其准确度可满足检测婴 幼儿配方乳粉中牛磺酸含量的要求。 3．6 线性范围的确定 根据仪器信噪比和调整牛磺酸标准溶液浓 度绘制的工作衄线，经过多次试验，结果表明当 牛磺酸的浓度在 0．02～150 mg／L的范 围内 时，工作衄线仍然具有良好的线性关系，相关系 数均能达到 0．999。因此可以确定牛磺酸线性 范围为 0．02～150 mg／L。 3．7 与国家标准方法测定结果的比较 采用本方法对乳粉中牛磺酸含量进行 4次 测定，并与国家标准方法 o¨J进行比较，结果见 表 4。从表 4中可以看出测定偏差均<3％，二 法测定结果无显著性差异，证明本法准确可靠， 可以用于乳粉中牛磺酸含量的测定。 颦 。 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 4 本方法与国家标准方法测定结果比较 4 结 论 (1)通过对柱前衍生条件(包括溶液的碱性 条件、衍生剂的浓度和衍生温度 )的试验 ，确定 了不受人为因素影响的最佳衍生条件，使测定 结果的准确度和重现性大大加强；同时对流动 相的条件进行了调整，保证了 C一18柱能够完全 将样品中的牛磺酸和其他组分分离，并且样品 处理方法简单，所以采用本方法能够进行乳粉 中牛磺酸含量 的检测。 (2)本方法标准曲线的线性较好，线性回归 方程 v=110 727x 一 1 114．2，相关系数为：r =0．999 9，完全满足分析需要。 (3)采用本方法不需配置专用的柱后衍生 系统——含溶剂泵和柱后衍生器，节约了分析 成本，易于推广。 (4)由于本方法具有较宽的线性范围(0．02 ～ 150 mg／L)，因此本 方法还可 以用于含 有牛 磺酸的一般制品及保健食品等。 参 考 文 献 1 郑建仙主编 ．功能性食品(第 2卷)[M]．北京：中 国轻工业 出版社 ，1999．188～190 2 Goodman H O．Shihabi Z K．Automated analysis for taurine in biolog~ical fluids and tissues[J]．Clin Chem ．，1987，33：835～ 837 3 Mou S，Ding X，Liu Y．Separation methods for tau～ rine analysis in biological samples[J]．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，781(1～2)： 251——67 4 W collard D C．Indyk H E．Taurine analysis in milk and infant formulae by liquid chromatography：collab— orative study[J]．J AOAC Int，1997，80(4)：860～ 865 5 Amiss T J，Tyczkowska K L，Aucoin D P．Analysis of taurine in feline plasma and whole blood by liquid chromatography with fluorimetric detection and con． firmation by thermospray mass spectrometry[J]．J Chromatogr，1990，526(2)：375～82 6 Lippincott S E， Fried man A L，Siegel F L er a1． HPLC analysis of the phenylisothiocyanate(PITC) derivatives of taurine from physiologic samples[J]．J Am Coil Nutr，1988，7：491～497 7 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_i萋曩 而成，能确保罐身强度。直接以罐头原型流通，能与传统铁罐一样可供自动销售机使用，回收处理方便， 可烧毁，无公害。该纸罐包装能保持高度密封性与杀菌性，比铁罐和玻璃瓶轻，能进行高温充填。采用铝 包装 ，能保护边缘 ，加强防氧，常温下保质期达 1a以上。 (103) 维普资讯 http://www.cqvip.com