嗜酸乳杆菌增菌培养基的优化

研究与探讨 嗜酸乳杆菌 Vo 1．23，No。6，2002 (东北农业大学食品学院 ，哈 尔滨 150030) 孟祥晨 李艾黎 霍贵成 擒 一 针对嗜酸乳杆菌的营养需要，采用正交实验优化基础培 养基及增殖因子的用量，得出最佳基础培养基配比是：大 豆蛋 白胨 0．6％，胰蛋 白胨 0．6％，蛋 白胨 0．6％，牛 肉浸 膏 1．2％，葡 萄糖 1％，低 聚糖 O 5％，乳 糖 O 5％，酵母 浸 出粉 O．5％；最佳 增 殖 因子 添加 量是 ：胡 萝 汁 15％，西红 柿 汁 15％，黄豆 芽汁 15％，11。啤酒 5％。最后使用优化 出的增 茵 培养基测 定生长 曲线 ，同时测 定 pH 和 滴定酸 度的 变化 。 确定增茵培养终止时间为 1Oh，通过平板茵落计数，此时 茵数 可这 6．8x10 cfu／ml。 关■诩 嗜酸乳杆菌 增茵 培养基优化 AI~ ract According to the nutritionaI needs of￡．ozidophil~ basis culture medIum and growth promoting factors were optimized by quadratic design The optimum basis culture medium composition was as following：0．6％ of soya peptone． 0．6％ tryptone， 0 6％ peptone 0 6％ beef extract 7％ gIucose． 0．5％ oligofructose． 0 5％ Iactose， 0 5％ yeast extract． The optimum g rowt h promoting factors were as following：1 5％ of carrot iuice， 1 5％ tomato iuice，1 5％ bean sprouts juice，5％ beer． Growt h curve with 0ptimized stimulated culture were determined by following the change Of DH and titratable acidity According to the growt h curve． the terminaI time was at 10 hours． ￡．exidophilus got to 6．8 X 1 09cfu／mI in this culture for 10 hours at 37~C y words ￡．acidophilus： g rowt h promoting： optimization of culture 中图分类号：TS201．3 文献标识码：A 文 章 编 号 ：1oo2—0306(2002)06一oo25一O3 嗜 酸 乳 杆 菌 制 品 多 为 发 酵 酸 乳 制 品 ， 但 此 类 产 品 活 菌 含 量 差 异 较 大 ，而 且 由 于 其 产 酸 性 强 ， 影 响 部 分 产 品 的 口 味 。 因 此 人 们 一 直 在 探 索 应 用 嗜 酸 乳 杆 菌 的 新 领 域 ，其 中 活 菌 制 剂 的 开 发 不 失 为 一 个 好 的 方 向 。 开 发 此 类 产 品 ，重 要 的 一 点 就 是 优 化 增 菌 培 养 基 。在 优 化 过 程 中 ，应 力 求 制 作 简 便 ，用 料 少 ，成 本 低 。 目前 在 国 外 ，已 经 有 商 业 化 产 品 ，但 其 配 方 组 成 都 属 于 专 利 文 献 资 料 ，因 此 优 化 、设 计 嗜 酸 乳 杆 菌 增 菌 培 养 基 是 一 项 十 分 重 要 的 基 础 研 究 工 作 。 收稿 日期 ：2oo2-03—15 作者简介 ：孟祥晨(1哪0_-)，女 ，在读博士研 究生，研究方向：畜产品加工。 基金项目：国家自然科学基金资助项 目(39879573)；黑龙江省 自然 科学基金资助项目(COO一19)。 嗜 酸 乳 杆 菌 除 基 本 的 营 养 需 要 外 ，某 些 天 然 添 加 物 (增 殖 因子 )对 提 高此 菌 的 活力 和活 菌 数 效 果较 好 。 现 在 认 为 ，西 红 柿 汁 、玉 米 浸 出 物 、胡 萝 卜汁 、低 聚 糖 等 物 质 对其 有 促 进 作 用 (葛 文 光 ，1989)；罗珍 兰 (1997)研 究 认 为 ，以 大 豆 为 原 料 的 发 酵 液 中 嗜 酸 乳 杆 菌 活 菌 数 比以玉 米 和西 红 柿 汁 为原 料 的 发 酵液 中 嗜酸 乳 杆 菌 活 菌 数 高一 个 数 量 级 ，这 证 实 大 豆低 聚 糖 可 以 促 进 该 菌 增 殖 ；顾 瑞 霞 (1992)考 虑 添 加 酵 母 代 谢 物 较 多 的 啤 酒 。 本 研 究 的 目 的 就 是 优 化 嗜 酸 乳 杆 菌 的 基 础 培 养 基 质 和 增 殖 因 子 ，以 提 高 嗜 酸 乳 杆 菌 的 活 菌 数 及 活 力 。 1 材料与方法 1．1 材料与设备 胰 蛋 白 胨 ，酵 母 浸 出 粉 ，大 豆 蛋 白 胨 ，蛋 白 胨 ，牛 肉 膏 ，各 种 糖 类 等 ；嗜 酸 乳 杆 菌 由 东 北 农 业 大 学 畜 产 品 加 工 研 究 所 提 供 。 Co：培 养 箱 ，超 净 工 作 台 ，压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ，显 微 镜 ，pH 计 等 。 1-2 方法 1．2．1 菌 种 活 化 、传 代 与 接 种 用 115oC，15min灭 菌 的 11％脱 脂 乳 37oC、24～48h活 化 、传 代 菌 种 ，MRS做 继 代 培 养 基 。 均 按 5％接 种 量 进 行 接 种 。 1．2．2 基 础 培 养 基 的 优 化 固 定 矿 物 质 、吐 温 -80的 用 量 ，采 用 正 交 实 验 设 计 (L。 (4 ))优 化 氮 源 (A)、碳 源 (B)和 酵 母 浸 出 粉 (C)的 用 量 ，结 果 见 表 1。 其 中 A 因 素 为 胰 蛋 白 胨 ：蛋 白胨 ：大 豆 蛋 白胨 ：牛 肉 浸 膏 ；B 因 素 为葡 萄 糖 ：低 聚糖 ：乳糖 ；C因 素 为 酵母 浸 出粉 的 添 加 量 。 1．2-3 增 殖 因 子 的 优 化 固定 1．2．2优 化 出 的最 佳 基 础 培 养 基 的 用量 ，采 用 正 交 实 验设 计 (L9(3 ))优化 增 殖 因 子 的 用 量 ，结 果 见 表 4。 1．2．4 菌 液 吸 光 值 (OD6oo)的 测 定 用 UV7500紫 外 分 光 光 度 计 在 600nm 条 件 下 比 色 ，测 定 菌 液 的 吸 光 值 。 1．2．5 菌 液 pH 的 测 定 用 pHS一3C 型 精 密 pH 计 在 室 温 下 测 定 pH。 — ： ．． ：．．：．． ．．：一一一一．．．一．．．． 窆 维普资讯 http://www.cqvip.com 1．2．6 菌 液 滴 定 酸 度 (。T)的 测 定 NaOH 滴 定 法 ，按 GB5409-89方 法 测 定 。 1．2．7 生 -K 曲 线 的 测 定 菌 种 活 化 扩 培 后 ，以 5％接 种 量 接 种 于 优 化 出 的 增 菌 培 养 基 中 ，37℃ 培 养 ，每 隔 2h取 样测 定 吸光 值 、pH 和 滴 定 酸度 的变 化 ，共 测 定 36h，以培 养 时 间 为 横 坐 标 ，相 应 的吸 光 值 为 纵 坐标 ， 绘 制 生 -K 曲 线 。 1．2．8 平 板 菌 落 计 数 样 液 采 用 10倍 梯 度 稀 释 ，选 取 适 当 稀 释 度 倾 注 平 板 ，使 其 均 匀 分 布 于 培 养 基 中 ， 37℃ 恒 温 培 养 24-48h后 计 菌 落 数 目 。 2 结果与讨论 2．1 嗜酸乳杆菌的形态与菌落特征 在 MRS琼 脂 培 养 基 上 需 氧 培 养 48h后 ，菌 落 微 小 ，不 规 则 ，微 隆 起 ，有 光 泽 ，灰 白 色 ，呈 透 明 的 玻 璃 霜 花 样 。10倍 显 微 镜 观 察 表 面 凸 凹 不 平 ，边 缘 为 丝 状 或卷 发 样 。革 兰 氏染 色 后 可见 菌 体呈 短 杆 状 ，单个 或 短 链 状 排 列 ，革 兰 氏 染 色 阳 性 。 2．2 基础培养基的优化结果 测 定 结 果 见 表 1，相 应 的 极 差 分 析 见 表 2。由 表 2 表 1 基础 培养基优化的正交实验结果 (L。 (45)) 研究与探讨 1(1：1：1：2) 1 1 1 2(1：1：2：1) ' ' ' 3(1：2：1：1) 3 3 3 4(2：1：1：1) 4 4 4 1(1：1：1) 2(1：1：2) 3(1：2：1) 4(2：1：1) 1 ' 3 4 1 ' 3 4 1 ' 3 4 1(o、3) 2(0．5) 3(o．7) 4(0．9) ' 1 4 3 3 4 1 ' 4 3 ' 1 187．61 200．11 173．96 195．56 179．65 178．51 164．87 180．78 194．43 202-39 171．69 195．oo 182．49 191．02 159．18 169-41 表 2 基础培养基优化中各指标的极差分析结果 指 标 0D∞ pH 滴定 酸度(。T) A B C A B C A B C 表 3 验证实验结果 (A B,Cz) 帮 畚暑 可 以看 出 ，三 个 因素 对 菌 液 吸 光 值 的 影 响 是 ：A>C> B，即 氮 源 比 例 对 指 标 的 影 响 最 显 著 ，酵 母 粉 的 添 加 量 次 之 ，碳 源 比 例 对 指 标 的 影 响 最 小 ；对 pH 和 滴 定 酸 度 的 影 响 顺 序 均 是 B>A>C， 即 不 同 比 例 的 碳 源 对 指 标 值 的 影 响 最 显 著 。综 合 三 个 指 标 值 可 以看 出 ， A B4C：吸 光 值 最 高 ，滴 定 酸 度 最 大 ，pH最 低 ，说 明此 种 组 合 增 菌 效 果 最 显 著 。以 此 组 合 做 验 证 实 验 ，实 验 结 果 见 表 3。 由表 3可 以看 出 ，理论 值 与实 际 值 差 别 不 显 著 ，说 明用 正 交 实 验 优 选 出 的最 佳 组 合 符 合 实 际 情 况 。因 此 确 定 最 优 组 合 为 ：A B4C：，以 此 做 为 基 础 培 养 基 配 比 ，优 化 增 殖 因 -T-的 添 加 量 。 2．3 增殖因子的优化结果 测 定 结 果 见 表 4，相 应 的 极 差 分 析 见 表 5。 表 4 增殖因子优化正交实验结果 ( (3 )) A B C D 指标 葱 甄 需 OD~一pH~T 。 用量(％)用量 )量(％)用量 ) 由表 5可 以看 出 ，D因 素是 影 响三 个 指标 值 的最 主 要 因 素 ，各 因 素 对 菌 液 吸光 值 的影 响 次 序依 次是 D>A>C>B，即 黄 豆 芽 汁 的 增 殖 效 果 最 显 著 ，这 与 顾 瑞 霞 (1992)的 实验 结 果 一致 。 综 合 三 个 指标 值 可 以看 出 ，四个 因素 对指 标 值 的 影响 差 别不 大 ，尤 其是 对 pH 的影响 最 小 ，而对 滴 定 酸度 的 影响 差 异性 可 能是 滴 定 误 差造 成 的。分 析其 原 因 ，可 能是 由于 当基 础培 养 基 中营养 比较 丰富 时 ，增 殖 因子 的增 殖 效 果不 显 著 ，因 此 增 殖 因子 的增 殖 效 果 因 基 础 培养 基 的不 同而 有 变 化 。综 合 三个 指 标 值 ，优 选 出 四个 因素 的 最优 水 平 组 合 为 A，B，C D，，验 证 实 验 结 果 见 表 6。由表 6可 以看 出 ，理 论 值 与 实 验值 差 别 不 显 著 ，说 明 用正 交 实 验设 计 优 选 出 的最 佳 组 合 符 合 实 际情 况 。 因此 确 定 增 殖 因 子 的最 佳 组 合 为 A，B，C D，，以 此作 为 增 殖 因 子 的 添 加 量 。 2．4 嗜酸乳杆菌在最优增菌培养基中的生长特性 制 作 增 菌 培 养 基 ，5％接 菌 后 ，37~(2需 氧 培 养 ，间 隔 2h测 定 菌 液 的 吸 光 值 、pH 和 滴 定 酸 度 ，绘 制 生 长 曲线 ，见 图 1，增 菌 培 养 基 中 pH 和 滴 定 酸 度 的 变 化 见 图 2。 由 图可 以看 出 ，嗜 酸 乳杆 菌 在 优化 的增 菌培 养 基 中 迟 滞 期 非 常 短 ， 在 1Oh左 右 进 入 对 数 生 长 末 期 ， 此 时 通 过 平 板 菌 落 计 数 其 平 均 菌 数 为 6．8× 109cfu／m1．pH 为 4．07。 加 舳加 踮乃 " 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 9 0 8 8 1 2 6 3 6 7 0 4 9 6 9 7 的 甜勰m H n 盯 ∞ n 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m n n ：2 维普资讯 http://www.cqvip.com 研究与探罚 表 5 增殖 因子优 化中各指标的极差分析结果 Vo 1．23，No．6，2002 表 6 验证实验结果 (A3B3C D3) 3 结论 3．1 嗜 酸 乳 杆 菌 增 菌 培 养 基 配 比 为 ： 大 豆 蛋 白 胨 O．6％ ，胰 蛋 白 胨 O．6％ ，蛋 白 胨 O．6％ ，牛 肉 浸 膏 1．2％ ， 葡 萄 糖 1％ ，低 聚 糖 O．5％ ，乳 糖 O．5％ ， 酵 母 浸 出 粉 O．5％ ，胡 萝 卜汁 15％ ，西 红 柿 汁 15％ ，黄 豆 芽 汁 15％ ， 11。啤 酒 5％。 3．2 以 最 优 增 菌 培 养 基 培 养 嗜 酸 乳 杆 菌 ，增 菌 终 止 时 间 为 1Oh，此 时 活 菌 数 达 6．8×1O9cfu／ml。 参考文献 1 K．K．Grunewald．Serum cholesterol levels in rats fed skim milk fermented by LactobaciUus acidophilus． Food Science 1982f47)：2078-2079 2 葛文光译．大豆低聚糖的生理特性与在食品中的应用．食品 科学，1989(9)：23-28 3 顾 瑞 霞，罗珍 兰．提 高嗜 酸乳 杆 菌产酸 速 率的研 究．食 品科 -—-+一”—-+一-·—-+一··—-+一”—-+一一—-+一--—-+一-·—-+一”—-+一”—-+一”—-+一”—-+一”—-+一··—-+一··—-+一--—-+一-·—-+一”—-+一 (上 接 第 24 页 ) 3 §2 0 0 1 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 培养时间(h) 图 1 嗜酸乳 杆菌生长曲线 6 5 4 毛3 2 1 0 培养时间 (h) 图 2 生长曲线测定中 pH、酸度随时 间变化 曲线 学，1989(5)：10-13 4 罗珍 兰，等．双歧杆 菌和乳酸 茵在 不 同基质 中混合发酵 的情 况比较．食品工业科技，1997(4)：50-53 表 4 脱水荠菜和蕨菜在贮藏期间 的非酶褐变 (mg／100g，以干重计 ) 5 Onayemi．0．， Okeibuo． Budifu， G．I． Effect of blanching and drying methods on nutritional and sensory quality of leafy vegetables． Plant foods for human nutrition， 1987(37)： 291-298 6 无锡轻 工业学院，天津轻 工业学院合编．食品生物化 学．北 京：轻工业 出版社，1988．216，365 一 一 甾 烬 维普资讯 http://www.cqvip.com