荧光光谱检测设计与研究

长春理工大学 硕士学位论文 荧光光谱检测设计与研究 姓名：李卿硕 申请学位级别：硕士 专业：物理电子学 指导教师：赵振明;潘立华 20080401 摘 要 本论文以研究时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)解离增强体系(DELIFA)为基础，为 了克服液相TRFIA体系的不足，依据稀土荧光标记物的基本参数(荧光光谱、荧光寿 命、激发波长、发射波长)，提高在荧光光谱检测实验中微弱信号的接收灵敏度、低噪 声放大与准确检测，涉及光电转换器件、信号积分和前置放大电路、光电二极管门触 发等方面细节，期望解决在信号接收处理过程的问题，如降低噪声的干扰、提高器件 接收灵敏度、设计比较理想的接收系统，完成荧光标记物发光监测系统的部分总体设 计。采用脉冲取样技术，同步触发、设定延迟、实现数据采集和显示输出，并进行了相 关的光谱和荧光寿命测量实验。 关键词：时问分辨荧光免疫分析发射光谱荧光寿命激光激发 Abstract Thethesistakethestudiesollthetimeresolutionfluorescenceimmunityanalysis(TRFIA) todissociatetheenhancementsystemfDELIFA)asaf0岫dation，inordertoovercomethe shortageoftheliquidoha∞TR默system,Onthebasisofmreearthfluorescencemark basicparameter(fluorescence印咖m，fluorescentlifetime，stimulationWaVClength, launchwavelength)，Enhancesthedetailsoftheweaksignalreceivingsensitivity,thelow noiseenlargementandtheaccurateexamination,involvesthephotoelectricity transformationcomponent,thesignalintegralandthepre-amplificationelectriccircuit,the photoelectricitydiodegatetriggersandSOoninthefluoreseencesDectmmexamination experiment，expectestosolutetheprobleminthesignalrccciretreatingprocesses，suchas reductingthenoisedisturbance，enhancingthecomponentreceivingsensitivity,designinga quiteidealreceivingsystem,00mpletiⅡgthefluorescencemarktoshinethemonitorsystem partialsystemdesign．Usesthepulsesampletechnology,synchronizationtriggers，the hypothesisretards，therealizationdataacquisitionandthedemonstrationoutput，andhas earnedouttheexperimentsofrelatedspeiY／l'umandthefluorescentlifetimesurvevI Keywords：time·resolvedfluorescenceimmunoassay emissionspectrumfluorescencefifetimelaser．excited 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文《荧光光谱检测设计与研究》是本人 在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 作豁氢袭缈乒月羽 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士学位论文版权使用 规定”，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件 和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编学位论文。 作者签名：—≤鬓乡函；寥拶；—月么日 指导导师签名：辁窒匪坦3 磷年』月笪日 第一章绪论 §1．1引言 由于稀土勘“离子具有荧光特性，在医学上可利用其标记蛋白质、酶、DNA等。 通过光电手段可以检验分析标记的物质是否存在。妇“离子具有300～360nm的吸收光 谱，使用对应光源进行照射，可以使其受激辐射发出荧光。但是普通的稀土离子是不 会和蛋白质等有机化合物反应，需要一种可以连接两种物质的中介，我们选用的是螯 合剂，螯合剂一方面可以连接蛋白质，一方面又可以与稀土离子构成稳定的共价键。 实验是通过对反应后的样品进行分析检测，使勖“离子受激辐射，发出以612nm 为主峰的荧光光谱，通过对该光谱有无及其强弱的对比，可以判定化合物反应前是否 含有特定物质，含有该种物质的多少。由于激发的荧光非常微弱，在检测的过程中需 要利用荧光微弱信号检测的办法，设计这个实验。 。 荧光微弱信号的检测设计主要涉及，光电转换，脉冲电信号的放大与收集，降低 信号噪声，比较信号强度与被测物质浓度的关系，通过对设备的选用，研究如何使用 光电倍增管(PMT)，BoXCAR多点积分器。 §1．2课题研究的重要性及现实意义 微弱荧光信号的检测是继放射免疫分析“1、酶联免疫分析和化学免疫分析之后，在 传统荧光免疫分析基础上，于上个世纪80年代初问世的一种非放射性标记免疫分析技 术，最重要的特点是以稀土离子作为荧光探针，它量子产率高，Stocks位移大，发射 峰窄，激发和发射波长理想，荧光寿命长(10～1000us)。采用时间分辨技术，可消 除激发光源的光、电干扰及样品池和样品本身等发出的短寿命荧光(1～lOns)，极大 的提高了信噪比，成为最有发展前途的超微量分析技术讶。 §1．3微弱信号检测研究现状 对于弱光信号，由于电子技术的发展，一般均通过各种传感器傲非电量转换，使 检测对象变成电量，但是由于弱光本身的涨落、传感器本底与测量仪器噪声的影响， 表现的总效果是有用的电信号被噪声所淹没，使测量受到每一发展阶段的绝对限制， 这些噪声来源与两个方面，一是来自于测量系统的内部，诸如运动产生的自噪声、载 流子的复合与再生、电子倍增噪声、表面态引起闪烁噪声以及光的量子噪声等，二是 来源于系统的外部，例如市电干扰、温度涨落、机械震动、电磁感应与辐射以及宇宙 射线等天体噪声等，这些噪声都有一定的频率特性与量级，按传统概念，噪声就是测 量的极限。 自从1928年Johnson对热骚动电子运动产生的噪声进行研究以来，大量科学工作 者对信号检测做出了重要贡献，尤其是近三十年来，更取得了突飞猛进的进步，测量 的极限不断低于噪声的量级，1962年第一台锁相放大器问世，使检测信噪比提高到103， 1968年从大量二次电子中测得Auger电子，到七十年代后期，检测信噪比提高到106， 即平均每4～5年测量极限低于噪声限制近一个数量级，因此，过去视为不可测量的微 观现象或弱相互作用，现在已成为可能，这就大大地推动了物理学和其他科学的发展。 微弱信号检测的目的是利用电子学的信息论和物理学的方法，分析噪声产生的原 因和规律，研究被测信号的特点与相干性，检测背景噪声覆盖的弱信号，他的任务是 发展弱信号检测理论、探索新的方法、研制新的检测设备以及在各学科中的推广应用。 传统的频域抑制噪声的检铡方法是带通滤波。1，籍以滤除带通以外的噪声，但这有 很多的缺点，锁相放大是通过频谱的迁移，利用低通滤波消除噪声，达到较之带通滤 波更窄的带宽。一般来说，带通滤波的Q值为10～100，而锁相放大器的Q值可达到10'， 噪声几乎抑制殆尽。 ’ · 随着计算机的发展，有些原来需要硬件来完成的检测系统，可用软件来实现，因 此被噪声掩盖的弱信号，利用计算机进行曲线拟合、平滑、数字滤波、快速傅立叶变 换估计等方法处理，提高了信噪比。 §1．4研究的内容及创新点 本题目所建立的装置主要分为激发光源、光学系统、荧光信号检测系统。激发光 源采用氮分子激光器或者氙灯，通过透镜组使光汇聚到样品池，激发被测物质。以光 电倍增管和光电二极管作为接收与触发器件，采用脉冲取样和延时积分的方法进行荧 光信号检测。测量稀土离子及其螯合物的激发和发射光谱的特点，以及特定波长位置 的荧光寿命。 在这个实验中，通过对理论和实际的操作，使用不同组建系统，对比实验数 据，选择最好的检测方法，让整个系统更加完善。 2 第二章时间分辨荧光光谱技术 §2．1E““离子螯合物的荧光特性 2．1．1荧光的产生 在热平衡状态下，材料中的粒子遵循玻尔兹曼定律分布在不同的能级上。不同能 级上的粒子数满足如下关系式： 生．ex“生当 (2．1)o—exDl-—‘——‘} L厶lJ 。Ⅳ1 一船’。 k为玻尔兹曼常数。 在外界条件的激发下，粒子激发到较高的能级。当激发条件取消 后，被激发上去的粒子会很快以辐射或非辐射的方式释放出能量而返回到基态。根据 激发态的不同，发光一般可以被分为两大类：荧光和磷光。荧光就是当电子以同样的 自旋状态从高能的电子激发态返回到低能的电子态的过程中发射出来的光．对于固态 或者存在于溶液中的有机物质，观测到的荧光通常是由第一激发态返回到基态的过程 中发出的。显然，荧光只是电子返回较低能级时的一条路径，电子也可以经由其它路 径返回，比如经过系问跨跃叫(Intersystemcrossing)而到达三线态，再经由三线态 返回基态，从而发出磷光。 图2．1能级跃迁图 电子的激发和返回过程可以用能级跃迁图2．1来描述。处于基态氐的电子吸收一 定的能量后被激发到高能级的激发态S、是、⋯’，在极短的时间内(小于104s)，激 发态上的电子可以通过内转换到达第一电子激发态的最低振动能级。由于荧光寿命一 ● 。 般为10’8S左右，因而内转换过程在荧光发射前就早己完成，所以荧光发射一般被认为 3 是从第一激发态的最低振动能级开始的。 si ＆ 系间簿跃 J Tt Ir-三 吸光丸 嗷舰 图2．2系间跨跃 系间跨跃，指不同多重态间的无辐射跃迁，例如墨一互就是一种系间窜跃。通常， 发生系间窜跃对，电子由墨的较低振动能级转移至五的较高振动能级处。有时，通过 热激发，有可能发生正一墨，然后由墨发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 sI s， T． 磷光 图2．3磷光发射 磷光发射，电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻 跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激 发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发 射磷光，这个跃迁过程(互一墨)也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10。-10s。 因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。 根据材料的能级结构不同，主要有以下几种不同类型的荧光“o： ①共振荧光。发射的荧光频率与激发光频率相同。荧光检测时易受到激发光的干 扰，在高灵敏度的检测中一般不采用。②非共振斯托克斯荧光。包括碰撞辅助非共振 4 斯托克斯荧光。发射的荧光波长都大于激发光的波长。因避开了激发光的干扰，所以 常用它来做高灵敏度的检测。③非共振反斯托克斯荧光。反射的荧光波长短于激发光 的波长。适合作反斯托克斯荧光测量的粒子很少，所以应用也不广泛。 2．1．2稀土离子荧光 ‘ 在元素周期表中，从原子序数57的锅(La)到71的镥(Lu)15个元素加上位于同一 IIIB族的原子序数为2l的钪(Sc)和原子序数为39的钇(Y)，共17个元素称为稀土 元素。它们的许多特性与它们的电子构型密切相关，而发光性能与其关系更为密切。由 于镧至镥的15个元素在化学性质、物理性质和地球化学性质上相似，人们将这15个元 素又称为镧系元素卧o”。 、 ， ’ 镧系离子的电子排布为。1，ls2妇22p63s23p63d”4s24矿4d”4，4如25p6(n-o～ 14)，其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态，其基组态是4，‘(n=O～ 14)，下一个激发态是4，“5d。稀士元素的原子因4，‘电子受5s25p6的屏蔽，它们的 能级受外界的影响较小，但由于自旋耦合常数较大，能引起J能级分裂嘲一嘲：不同稀土 离子中4，4电子的最低激发态能级和基态能级之间的能量差不同，致使它们在发光性 质上有一定的差别。稀土离子根据其发光性能可分为3类：①不能显示荧光的离子， 有Sc“、】，“和幻“(4，。)、LⅡ“(4，14)，以及荧光极的离子，如G留“(4，7)。不过 这些离子容易形成L3一L发光的配合物。而且它们常常能导致S加。、甑，．、拍“、D’，“ 等配合物体系f3--f跃迁荧光强度大大增强，即发生所谓共发光效应 (co—luminescence)．在无机体系中上述离子一般用在发光材料的构成基质阳离子。 ②能发出强荧光的离子，有Sm“(4f5)、＆“(4，6)、乃“(4，8)、Dy“(4f9)等。 它们的最低激发态和基态间的f—f跃迁能量频率落在可见区，f—f电子跃迁能量 适中，比较容易找到适合的配体，使配体的三重态能级与它们的f—f电子跃迁能量匹 配。因此，一般可观察到较强的发光现象。尤其是助“和乃“，得到最广泛的研究w。 由此可见，稀土离子的发光性能是稀土离子电子结构的内因所决定的。对于此类有强荧 光效应的稀土配合物，一方面可以直接利用它的荧光特性制成荧光、激光材料，又可以 用稀土离子作光谱探针，进行物质结构的研究。③具有低荧光效率的离子，有Pr“、 ^W“、Ho“、Er“、Tm“、Yb“等。由此可见，把稀土离子引入聚合物基质会改善其 荧光跃迁，提高荧光强度。一方面可制得强荧光材料，另一方面也可开发弱荧光组稀土， 使我国丰富的稀土资源得到充分利用。 2．1．3Eu“螯合物的光谱特性 稀土元素作为有机络合物的中心原子其配位数丰富多变，通过稀土离子与丰富多 变配位体的相互作用，又可以在很大程度上改变、修饰和增强其发光特性，产生了十 分丰富的吸收和荧光光谱信息。EⅣ“离子有在可见光区发光的通道，如果选择适当的 配体，形成络合物，而其中的配体可将某一定波长的入射光吸收、存储、转换并传递 给中心离子，使络合物发出荧光⋯。这种稀土有机发光络合物发出的荧光兼有稀±离 子发光强度高、光色纯正和有机发光络合物所需激发能量低、荧光效率高等优点。稀 土离子的发光性质在配体作用下得到了增强和修饰。 ． 作为一个理想的发光体分子应具备下列条件：1．分子具有稳定的基态和激发态； 2．在适当的光谱区具有强的吸光能力；3．激发后的激发态不是发射态，而且发射态的 能量交换效率要高；4．发射态应具有适当的能量，且寿命要适中：5．在氧化还原过程 中，发射态作为反应物或产物，需具备适当的氧化还原特性。 竣长 图2．4Eu3．螯合物的吸收光谱 镧系发光络合物正具有上述特点，它在近紫外区和可见光区域显示强的吸收。最 低激发态布局完全，具有明显的氧化还原中心，发射态的寿命处在毫秒区，因此是理 想的发光体；同时通过选择合适的配位体还可以控制非辐射的衰减，增强光吸收的强 度，从而提高稀土络合物的发光效率。 能发出强荧光n“(4，6)螯合物的荧光发射光谱。其最高峰位于612nIIl。 筏长‘-) 图2．5EU“螯合物发射光谱 助“络合物荧光的能量跃迁过程，一般可分三步来说明咖： T～。需，竺D：磊寻蒂 l l l l I I l l l l 图2．6能量跃迁图 ①先由配体吸收辐射能，从单重态的基态晶跃迁至激发态s，，其激发能可以辐射 方式回到基态瓯(配体荧光)，也可以非辐射方式传递给三重态的激发态互或乏；②三 重态的激发能也可以辐射方式失去能量，回到基态(磷光)，或以非辐射方式将能量转 移给阳离子(图中是稀土离子)：③处于激发态的阳离子(稀土离子)的能量跃迁也有两 种方式，以非辐射方式或辐射方式跃迁到较低能态，再至基态，或以辐射方式跃迁到 较低能态，此时就产生荧光。 E““荧光谱一般为5D。一7F，(J=1，2，3，5，6)，的跃迁光谱，包括电荷转移跃 一赛耄一度 霎0．_o‰o暑●上工Xu_6》o=l_专。上●6I()&∞o；零上●¨{i¨。6(善：n1上黼～F 迁光谱和共振能量转移光谱，电荷转移跃迁光谱是配体向稀土离子的电荷转移态(4f壳 层内)发生电荷转移而产生的，5D。一7墨，7E，7F4的荧光波长分别为590～596姗， 610～620nIll，687～703nm。而当用卢一二酮体作肋“配位体时，与电荷转移跃迁不同， 配位体的三重态与勋“的5D，态发生共振能量转移，而不是电子密度的重新分配嘲_卅。 ￡b“依靠配位二酮体的能量转移，可以得到强烈的￡h。的5D．一7E(610～620nm)跃 迁荧光。这样激发波长取决于所用的配体，发射波长取决于荧光离子。． 2．1．4荧光量子产率和荧光寿命 ， 荧光量子产率和荧光寿命是荧光物种最重要的两个参数。其意义可以用简化后的 Jablonski图来说明。 ． 图2．7简化Jablonski图对荧光量子产率和荧光寿命的解释。 荧光量子产率是发射的光子在总共吸收的光子中所占的比例。实际上电子由第一 激发态回到基态可以有辐射和非辐射两种形式，其速率常数分别由r和／q，表示，因 此量子产率也可以被理解为以辐射形式由激发态返回基态的电子数占总的被激发电子 的比例，量子产率可以被表示为： 毋；—L (2．2)’ r+E， 假如辐射衰退所占的比例远大于非辐射衰退，荧光量子产率可以接近1，但是由于各种 能量的损失，荧光量子产率一般小于1。 荧光寿命是受激分子在返回基态前在激发态停留的平均时间。因而荧光寿命可以表 衲： 扣志 @·3) 因为荧光发射是一个随机的过程，所以只有极少数荧光分子的寿命等于t，对于单指 数的荧光衰减，有63％的荧光分子荧光寿命小于t。对于给定的荧光物种，荧光量子 产率越大或荧光寿命越长，在同样条件下荧光强度越强。 8 2．1．5Stokes位移 ． 虽然吸收和发射反映的都是基态和第一激发态之间能量的变化，但是荧光发射光 谱一般会出现在吸收光谱的长波一端，在最大发射和最大吸收波长之间会存在一个差 值，这个差值是一个表示分子发光特性的物理常数，被称为Stokes位移。它反映了分 子在回到基态以前，在激发态寿命期间能量的消耗，此位移常用下式表示，单位为锕-1 1 1 Stokesshift=107仁L一二) (2．4) ‘九屯。 ● 这里k和A。分别是校正后的最大激发波长和最大发射波长，单位为咖。 激发和发射间的能量损失非常普遍地存在于处于溶液中的荧光分子，并且这种能 量损失可以反映出溶液的某些性质。 ’ 2．1．4Kasha规则 荧光光谱的另外一个特点就是同一荧光物种的荧光光谱一般不依赖于它的激发波 长，这被称为Kasha规则。当分子被激发到高的电子振动能级时，通过内转换，过剩 的能量会被很快地散失，从而使分子回到第一激发态的最低振动能级。因为内转换的 时间远小于分子的荧光寿命，所以不管分子被激发到哪个能级，一般荧光总是从S的 最低振动能级发出的。 §2．2激发光源的选择 2．2．1激发光源 一般应用于荧光免疫分析的光源有激光器、高压氙灯和氙汞弧灯。 1J氮分子激光器：氮分子激光器具有波长短、脉宽窄、峰值功率高的特点，是目 前紫外波段较易得到较大功率的主要激光器之一。它被广泛地作为染料激光器泵浦源， 在激光医学(理疗和激光针灸)、种子处理、微量元素激光荧光分析、光化学反应、荧 光寿命研究等方面也具有重要的用途。主要应用其紫外波段和高峰值功率(兆瓦级)的 特性，其工作原理是通过横向激励腔内低气压氮气，而使其产生超辐射的紫外波长的 激光。 2．氙灯：氙灯是利用氙气放电发光的气体放电灯，高压氙灯是一种短弧气体放电灯， 外套为石英，内充氙气，室温时气压为0．5Mpa，工作时气压为2Mpa，在250～800nm波 长内光谱分布比较平滑。脉冲氙灯作为激发光源正在逐渐流行，脉冲氙灯能提供较大 相对发光强度的300nm以下波长的光束。球形超高压短弧氙灯是具有很高亮度的点光 源，是一种辐射紫外线和蓝绿色光的点光源。能辐射出从紫外到近红外的强烈连续光 谱的光，具有亮度高，发光体体积小，显色性好等优点，交、直流球形超高压汞灯适 用于荧光显微镜、光分析及光刻仪等光学仪器。管形长弧氤灯可作为码头、广场、体 9 育场的大面积照明光源，还可作为印刷照相制版，布匹颜色检验、塑料、橡胶、药物 的老化试验，人工气候室植物栽培，以及光化学反应的光源。 3．准分子激光器：准分子激光器采用由防卤索和紫外光侵蚀的铝合金制成的金属陶 瓷反向腔，和超快预电离技术将ArF、XeCl、XeF等气体激发，产生激光。 4．氦锈激光器：HeCd激光器波长输出为442nm或325nm，其产品广泛用于全息、快 速成型、荧光试验等应用中。主要特点：光束质量好、低噪音、长相干长度。是工业 以及科研应用的理想光源。 2．2．2激光作为光谱源的优点⋯ 1．多种类型的激光器都能达到很高的光谱功率密度，它常比普通的非相干光源高 出许多个数量级，因此，容易解决一些当信号较弱时(例如与探测器噪声或背景干扰 联系在一起时)的强度问题，不仅如此，由于强度高，还能进行一系列涉及到多光子 过程或分子跃迁饱和实验。 2．激光发射具有良好的空间成束性，能较容易地减弱由壁或窗的散射光引起的不 期望有的背景。 ’ 3．脉冲或模耦合激光器能产生高功率的短脉冲激光，这种脉冲的持续时间很短， 达到飞秒量级，因而可以用它来研究很短的寿命和高速弛豫过程。 2．2．3氮分子激光器原理 氮分子第二正带c‰。一B‰。能级振动态之间的激光跃迁。波长为337．1nm。带宽 约为0．1nm。 图2．8氮分子能级图 氮分子是一种三能级系统的激光工作物质。它是通过电子直接碰撞激励的。当氮 分子从基态x譬；激发至U激光上能级c‰，态后，在ck，态和激光下能级B3_之间形成 粒子数反转·当某些C‰。态的氮分子自发辐射产生光子而跃迁到下能级时，这些光子 与受激态的氮分子碰撞，产生受激发射。但是只有沿通道方向辐射的激光，增益长度 才最大，最后沿通道就产生一个强的激光输出。 因为氮分子上能级c‰．。态的粒子的寿命只有40ns，因此必须在短于这一时间内才 能建立粒子数反转。现在大功率的氮分子激光器都是通过横向高压快速大电流放电来 实现的。又由于氮分子激光下能级B3石．态的寿命很长，约为5～8ps，大量的粒子在 这一能级聚集，所以不能连续的实现粒子数反转。通过气体流动，粒子与管壁的碰撞 等办法，或一定的弛豫时间使它回到基态之后，再实现另一次激励。因此氮分子在第 二正带间只能处于脉冲工作状态。 氮分子激光增益高，不需要谐振放大，因此不需要严格的谐振腔。通道未端仅是 一个镀膜高反镜，出射窗为一个对紫外吸收小的石英片。 §2．3时间分辨荧光检测分析方法的原理 2．3．1荧光免疫分析各种方法 目前荧光免疫分析方法主要有：化学发光免疫分析、放射免疫分析、酶联免疫分 析、时间分辨荧光免疫分祈⋯1。 1．化学发光免疫分析：把化学发光物质与免疫学反应结合起来，用光反应表现被 测的免疫成分浓度，即把高灵敏的光反应与特异性的免疫学反应相结合的方法，称为 化学发光免疫分析技术(ChemiluminescentimmunoassayCLIA) 2．放射免疫分析(radioimmunoassay)：将放射性核素的标记物应用于实验分析的 免疫分析方法。它的主要特点是把放射性核素示踪技术的高灵敏性与免疫学的高物异 性相结合，对体液、细胞受体等超微量的生物活性物质进行有效的检测。 3．酶联免疫分析(enzymeimmunoassay)”；酶是生物体产生具有促化作用的蛋白， 是生物催化剂，免疫酶是从六十年代发展起来的一项新技术。由于它比较灵敏，不需 要特殊设备，可以进行定性分析，故发展很快。免疫酶微量分析技术，是采用现代分 析仪器，对经免疫酶标记的待测样品中某种微量物质进行定量和定性的分析的检测技 术。在此基础上发展衍化的免疫酶示踪显微技术，是一种在组织上及细胞微观水平上 的酶标免疫化学技术，可采用电镜和光镜，对经免疫标记的细胞内外的靶分子物质进 行定性，定位的示踪观察。 4．时间分辨荧光技术：(TRFIA)“”⋯是以稀土离子(镧系元素)标记抗原抗体、 细胞、核酸探针的新技术。解离一增强体系主要通过铕、镝、钐、铽的时间分辨激光 激发荧光光谱分析”“““”，应用于蛋白质定量分析：抗原抗体检测；如：乙型肝炎、 丙型肝炎的时间分辨荧光免疫分析；DNA探针核酸杂交分析；药物和食品的检测等，另 外通过时间门技术可以大大提高检测的灵敏度”“。由于稀土离子自身荧光信号极微 弱，在免疫分析复合物中加入酸性介质后，使稀土离子在免疫复合物中解离出来。在 PH=3．2的解离增强溶液中与B一萘甲酰三氟丙酮，(NTA)重新形成一种微胶囊螯合 物，这种螯合物会发出高强度的荧光(比原来增强100万倍)。微囊在340hm被激发时， 可以产生长寿命的极强的荧光信号，约为原来荧光强度的100万倍。较大Stokes位移 (约270r皿)，长寿命(10～1000弘s)的荧光。采用时间分辨技术，使测量的样品池和样品 中蛋白质等发出短寿命荧光(1～lOns)完全衰减后再进行检测。 比较以上三个方法，时间分辨技术利用螯合剂，代替同位素、酶、一般荧光染料 和化学生物发光剂等，这些方法都会破坏蛋白质核酸、细胞等的活性物质。利用固相 时间分辨的方法可以保留原有细胞的生物特性。 2．3．2荧光分析法建立基础 ’ 基态分子吸收光能受激后，处于S。态的分子通过振动弛豫和内转换过程衰变到S 态的最低振动能级，若再伴随着光子的发射返回到＆的各个能级，即由S返回到瓯的 跃迁过程则得到荧光。利用发射荧光强度与物质浓度之间的关系，建立了荧光分析法。 在一定的光源激发下，若保持激发波长不变，到的荧光强度对发射波长的关 系曲线，称为荧光发射光谱；反之若保持发射波长不变，记录到的荧光强度对激发波 长的关系曲线，称为荧光激发光谱。在一定激发波长和发射波长条件下测得的荧光强 度与发光物质的浓度成正比。 1I-kqvlIoecb (2．5) 式中，以为荧光量子产率；厶为激发光强度；b为样品池厚度；￡为发光物质的 摩尔吸光系数；e为发光物质的摩尔浓度I，一k'c。 测量仪器确定以后，k’为常数。用一个适当强度的某一特定的光去激发具有一定荧 光效率的物质，采用光谱涉滤光技术和高灵敏度光电检测就可以定量地测量出被测物 质的含量。荧光强度与物质的浓度里线性关系，这正是荧光分析的定量基础。 荧光分析法主要有如下优点：n玎 1．灵敏度高：荧光是从入射角的直角方向检测，即在黑暗背景下检测荧光的发射 强度；所以荧光分析法比通常的紫外和可见光分光光度法的灵敏度高2～3个数量级， 检测限可达10’12～10一g／ml。 2．选择性强：荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。在用荧光分析法鉴定物质时选 择性更强，因为分光光度法只能得到待测物质的特征吸收光谱，而荧光光谱法既能依 据特征发射又能利用激发光谱或依据特征吸收来鉴定物质。 3．取样容易，由于方法的灵敏度高，使试样的用量大大减少，特别是使用微量池 时，仅需几微升的样品。此外，荧光分析法还可用于对气体、固体和浑浊试样的分析。 4．能提供较多的物理参数：荧光分析法能提供包括激发光谱、发射光谱、荧光强 度、总荧光量、量子产率、荧光寿命、荧光偏振、谱带宽度和斯托克斯位移许多物理 参数。这些参数反映了被研究物质分子的各种特征，并且通过它们可以得到分子的更 多的信息，这是分光光度法不可比拟的。 ， 2．3．3荧光免疫分析㈣“” ’ 1．将待测血样加入到抗体固相表面上，形成抗原抗体复合物，进行洗涤，除去未 反应的待测抗原。 2．加入稀士离子螯合抗体，经过温育后，形成抗原一抗体一稀士离子螯合物抗体 复合物。 ‘ 3．加入酸性增强液，使稀士离子解离出来，形成新的免疫复合物，用光电检测的 手段，得到待测抗原的浓度。 图2．9免疫分析图 利用有增强荧光作用的分子结构如(BCPDA分子)和生物扩增技术(PCR)“”，则 无须加增强液，可直接检测稀土标记免疫复合物的荧光。这样我们的实验从液相转变 为固相，不需要加入酸性增强液，不破坏抗原抗体的细胞结构，可保存完好的生物信 息。 o籼． h乙謇睦．佟增 专 专m釉m o n 亘．up¨隅 2．3．4时间分辨技术原理㈣ 图2．10时间分辨技术的原理图 时间分辨荧光分析技术是用稀土离子络合物作为示踪物，代替同位素j酶、一般 荧光染料和化学或生物发光剂等，标记蛋白质、核酸或细胞等生物活性物质。当反应 发生后，如抗原抗体反应、生物素亲合素亲合反应、核酸杂交反应等，由于稀土离子 络合物的荧光寿命比其它荧光物质的荧光寿命要长得多，所以通过设定一定的延迟时 间，待其它信号消失之后，在某一选定的时间内测量荧光信号，大大提高信噪比。通 过测定荧光强度就可以分析待测物的浓度。 一 基于这种螯合物的特点，采用紫外光激发，确定适当的初始延迟及取样门宽，以消 除样品本身短寿命的蛋白质的荧光、瑞利散射和拉曼散射，从时间、空间域上提取信号， 极大地增强了分析灵敏度。 一 §2．4光电转换测量系统 2．4．1光电倍增管 当一个光子入射到光阴极K上，可能使光 阴极上以几率叩逸出电子称为量子效率。这个 光电子继续被更高的电压加速而飞向第二倍增 极。若每一前级光电子打出酽个次级电子，如 此下去，到达阳极时总电子数可倍增管的效益。 应当指出，只有在入射光很弱，入射的光 子流是一个一个离散地入射到光阴极上时，才 能在阳极回路中得到一系列分立的脉冲信号。 14 ‰。-r旷_唧 如} {bI 愀、0聃一r竹Ie} ‘ 罐} 图2．II不同光强F光电倍增管输出 图2．11是用示波器观察到的光电倍增管弱光输出信号经放大器放大后的波形。 当P一10“W时，光电子信号是一叠加有闪烁噪声的直流电平，如图(a)；当 P一10“w时，直流电平减小，脉冲重叠减少，但仍在基线上起伏，如图(b)；光流继 续下降达P一10出时，基线形如稳定，重叠脉冲极少，如图(c)；当P．10“时，脉 冲无重叠，直流电平趋于零。如图(d)。图2．11可知，当光流量降至P一10出时，虽 然光信号是持续照射的，但光电倍增管输出的光电信号却是分立的尖脉冲。这些脉冲 的平均计数率与光子的流量成正比。可见光子计数器在探测弱光时发挥其优越性。 2．4．2光子技术 单光子计数法利用在弱光下光电倍增管输出信号自然离散化的特点，采用精密的 脉冲幅度甄别技术和数字计数技术，可把淹没在背景噪声中的弱光信号提取出来。当 弱光照射到光电子阴极时，每个入射光子以一定的概率(即量子效率)使光阴极发射 一个电子。这个光电子经倍增系统的倍增最后在阳极回路中形成一个电流脉冲，通过 负载电阻形成。个电压脉冲，这个脉冲称为单光子脉冲。横坐标表示P婀输出的噪声 与单光子的幅度电平(能量)，纵坐标表示其幅度电平的分布概律。可见，光电子脉冲 与噪声分布位置不同。由于信号脉冲增益相近，其幅度相当好的集中在一个特定的范 ．围内，光阴极反射的电子形成的脉冲幅度较大，而噪声脉冲则比较分散，它在阳极上 形成的脉冲幅度较低，因而出现了”单光电子峰’。用脉冲幅度鉴别器把低于幅度的脉 冲抑制掉，只让高于幅度的脉冲通过就实现了单光子计数。 放大器的功能是把光电子脉冲和噪声脉冲线性放大，应有一定的增益，上升时间 <3ns，这就要求放大大器的通频带宽达到lOOMl-lz，并且有较宽的线性动态范围和较低 的热噪声，经过放大后的信号要便于脉冲幅度鉴别器的鉴别． 。 脉冲幅度甄别器的主要任务就是剔除噪声脉冲，把淹没在噪声信号中的光子信号 筛选出来，以达到真正的光子计数的目的。在脉冲幅度甄别器里设置有一个连续可调 的比较电压K。只有高于K的脉冲，才能通过甄别器得到输出。 在另外一种模式下(微分模式)，仪器提供两个鉴别电平，即K及砭。在该模式下， 仪器只对吒及K—K的值进行控制。即逐步增加圪的值，另外提供K一屹的一个常量， 在这里我们把K—K的这个常量称为道宽。它反应的是在某个信号高度，信号拥有脉冲 数的多少。灵敏度高；死时间小，建立时间短，脉冲对分辨率小于lOns，以保证不漏 脉冲。甄别器输出经过整形的脉冲。计数器的作用是在规定的测量时间间隔内将甄别 器的输出脉冲累加计数。 §2．5时间分辨微弱荧光信号检测 2，5．1取样积分器 2．5．1．1取样积分原理⋯ 为了恢复淹没于噪声中的快速变化的微弱信号，必须把每个信号周期分成若干个 时间间隔，然后对这些时间间隔的信号进行取样，并将各周期中处于相同位置(对于 信号周期起点具有相同的延时)的取样进行积分或平均。取样积分在物理、化学、生 物医学、核磁共振等领域得到了广泛的应用，对于恢复淹没在噪声中的周期或似周期 脉冲卓有成效。 ． 取样积分的基本原理： 图2·12取样积分基本原理图 周期为T的被测信号s(t)，叠加了干扰噪声n(t)，可测信号x(t)=s(t)+n(t) 经过放大输入到取样开关。R(t)是与被测信号同频的参考信号，也可以是被测信号本 身。触发电路根据参考信号波形情况形成触发脉{申信号，触发脉冲信号再经过延时后， 生成一定宽度t的取样脉冲信号，控制取样开关，完成对输入信号的取样。 2．5．1．2线性门积分器与门积分器 图2．13线性积分器电路 x(t)为被测信号，它包含有用信号S(t)和噪声信号n(t)，r(t)是参考信号，由它 触发取样脉冲产生电路，在被测信号周期中的指定部位产生宽度为L的取样脉冲，在t 期间，控制电子开关，以对被测信号取样。 当输入电压为蚝O)时，流过输入电阻R的电流为 ∽～掣=半 cz．e， 解得： 喇--舟∥矽，+匕。 ‰为初始电压，积分时间常数I=RC (2．7) 当输入电压雌(f)是幅度为K的阶跃电压，而且初始电压K。为0时，由式(2．7)，积分 器阶跃响应输出为： 啪)--Vo(t)-等 式(2．8)所表示的‰p)与t之间的关系如图2．14所示。 “o形 1 O 图2．14线性门积分器的阶跃响应 M懈擀筹 (2．8) (2．9) 设开关闭合的占空因子为△=睾，则平均积分电阻可以近似为芸，幅度为K的阶跃响应 近似为： 。 门积分的等效常数时间为； 啪卜等=器 T．量：RC：RCr ‘ A A T- 可见：L越窄，等效时间常数t就越大。 (2．10) (2．11) 由于线性门积分电路的输出幅度受到运算放大器线性工作范围的限制，所以比较 17 适用于幅度较小的信号测量，如果信号幅度较大，为数不多的若干次取样积分就在可 能使运算放大器进入非线性区，导致测量误差，在这种情况下只能使用指数式门积分 器。 指数式门积分： x嘻警≈坤啪)’ ： Tc，7‰圈上 ， 图2．15指数门积分器电路 图2．16指数门积分器阶跃响应图 当开关始终闭合的情况下，输入输出关系表示为： x(1)-RC掣+uo(t) (2-12) 如果x(t)为幅度为K的阶跃电压，而．1lu。(t)的初始电压为0时，则由式(2．12)，可 以得到： ‘ ‘ uo(t)----Vi(1-e’”) (2．13) u。(t)与t之间的关系如图2．16中的点划线所示，110(t)由0上升到0．632Vi所需要的 时间为疋=RC，即为积分时间常数。当t=5Tc时，Ⅱo(t)可达到V；的99％以上。在取样 门的控制下，阶跃响应可近似表示为： Uo(t)=V(1-c1‘) (2．14) 此时u。(t)与t的关系如图中的虚线所示。该虚线可以看成是图中折线的平均值。令 Uo(t)由0上升到0．632v所需要的等效时间常数为t 则： t。罢=≯RFCr 弦㈣ 与线性门积分相比，指数式门积分，随着取样次数的增加，每个取样使积分输出上升 的值逐渐减少。经过5ToZ)吾接近稳定值，此后的取样对积分输出的影响很小，因此 不会因为积分时间太长而过载。另一方面，当积分时间大于2T,之后，每次取样使得 积分结果变化很小，而且会越来越小，肌积分的作用逐渐的降低。可见太长的增加测 量时间是没有意义的。 相比之下，对于线性积分器，信噪比的改善会随着积分时间的增加而增加，它不 受电路等效时间常数的限制，只受电路工作线性范围的制约。所以在信号幅度较小的 情况下，采用线性门积分更为有利。而在信号幅度较大时，为了防止电路进入非线性 区导致测量误差，必须采用指数式门积分器。 2．5．1．3取样过程频域分析 ， 利用取样脉冲序列p(t)从被测连续信号x(t)中抽取一系列的离散样值，取样脉冲 序列可以看作是取样脉冲p(t)与连续信号x(t)的乘积，即： tp)-p(f)x(0 (2．15) 设取样脉冲序列p(t)的幅度为A，周期为T，脉冲宽度为￡，这样的周期性脉冲序列 可以展开为傅里叶级数的形式： p(t)-Xc．exp(jna，,t) (2．17) 式中，q=2Ⅱ／T为取样脉冲序列p(t)的基波角频率，复数集c^称为p(t)的频谱， q。；弘e砸脚州争笔笋 汜m 令Az￡／T为P(t)的占空系数，考虑到用p(t)控制取样开关的情况相当于P(t)的幅 度A----1，而且q=2“／T，则 q一△警， (2．19)，啪 将(2．19)式代入(2．17)式得： 州t耄△警exp(jnw,r)(2．20) 对式(2．20)进行傅里叶变换得p(t)的频谱为： p@)-羹A堕挚∞一nq) (2．21) 燃=2Ⅱ／T为取样脉冲的角频率，P(∞)为包络线为取样函数兰竺生掣的一系列冲激 n．rg．△ 函数。 设输入信号x(t)的频谱为x(∞)，要据傅里叶变换的性质，式(2．21)所示的p(t讧(f) 相乘的过程在频域表现两者的频谱相卷积为： ． 置(妫-工(∞)×尸(∞) (2．22) 以(∞表示取样信号t(f)的频谱。将(2．21)代入(2．22)，可得： t(奶一x(砷x霎△专挚@一嗽) ．tAsin(n'ra)X(∞一疗q) (2．23)4 ⋯ “ 由(2．23)可见，取样过程的作用是将输入信号x(t)的频谱x(∞)平移到n峨各点，再 分别乘以相应的c^值。 电路频域分析： 学磐，。％(f)O——(==]—]——吣‰VJ 圭c 图2．17等效电路图 电路参数的相互关系可用下列微分方程来描述： 删·c掣‰伊圳 (2．24) ． 式中足O)-R／pq) (2．25) 称为等效电阻。 由(2．24)(2．25)两式可得： —auo—(t)+业2：丝2。塑：旦盟 (2．26) 对(2．26)进行傅里叶变换，得： jeoRCUo(埘)+【，o(co)xe(,o)一x(∞)×尸(∞)(2．27) 将(2．19)式代入(2．27)可得： 砜m去冀笔粤⋯咖壶妻鼍≯r加叫眨zs， ， 可见取样积分器的传输过程是在加‘各频率点的滤波过程，滤波时间常数Rc／△· 任何周期信号都可以表示为三角函数的组合，考虑输入被测信号中频率为w的单 一频率正弦信号分量⋯： ． 。 x(f)-‘cos[珊(t-O】 ． (2．29) 靠为该频率分量的幅度。 当x(t)的频率∞等于取样脉冲频率q-2Jr／T时(基波)，指数式门积分器的稳 态输出为； Ⅳ。(f)。工。掣cos(∞，f)【1一exp(一tA／Rc)](2．30) 当x(t)的频率∞等于取样脉冲p(t)某次谐波频率时，即∞·埠q(n≠1)，指数式门 积分器的稳态输出为： “。(f)．工。．sin(nz．rA)cos(露∞。f)【1一exp(一tA／RC)l(2．31) n．盯／t 可见，取样积分器的输出是沿着指数曲线逐渐积累的过程，时间常数为t-A／RC， 脉冲取样宽度越窄，占空系数就越小，所需积分时间就越长。稳态输出的衰减取决于 !!!I兰垒2，一般要求!!生鱼盟小于√j／2，此时衰减小于3dB，解得，砸小于 石A 万△ 1．392，￡小于0．4431T，同样，要使恢复的被测信号rt次谐波分量的衰减小于3dB， 则t小于0．4431T／n，取样宽度越窄，输出信号的分辨率就越高。 2．5．1．4工作方式 图2．18扫描式取样积分结构图 图2．18中，慢扫描时间宽度为互，用于产生覆盖很多个信号周期的锯齿波；时基 ’ 电路宽度为毛，用于产生覆盖被测信号周期中需要测量部分的锯齿波；比较器用于产 生逐渐增加的延时i门控电路用于产生脉冲宽度为I的取样脉冲。 图2．19扫描式取样积分各点波形 A为被测信号x(t)波形；B为参考信号产生的触发信号波形；C为由慢扫描产生的长周 期t锯齿波·以及覆盖被测信号周期中需要测量部分的时基疋锯齿波：D为不断增加 的触发脉冲延时，E为产控电路产生的逐渐后移的取样脉冲；F为复现波形。扫描式取 样积分过程是一种移动平均式的积分Ⅲ1，如图2．20所示； 口op) 图2．20扫描式移动取样积分示意图 x(tJ)是被测信号波形，取样积分器对t时段内(虚线框内)的x(t)进行积分，得到一 个‰(f)输出值，在信号的下一个周期虚线框向右移动一个小小的时段，再次积分。重 复上述过程直到扫描完要测量的时段，就像积分框沿着信号周期向前移动一样，所以 这种积分方式称为Boxcar积分。 任何信号都可以分解成不同频率分量的组合，设输入信号x(t)的频率为w的分量 为： 薯(f)-v．exp(j研) (2．32) 式中t屹为该频率分量的幅度，则在时为时刻t的积分平均结果为 。1‘ 嗽卜i，乏屹exp(∥∥ t 一‘ ，-坠亟i。oT鳢11一娃p(一J哆)】． - ．筹【1一傩(嘎)+，s叫岖)]，幔。 、“。、“1 ‘ 一‘(t)exp(一心／2)笔铲 (2．33) 取样积分的频率响倒”： ⋯I一斜一专筹竽 2．5．2光子技术脉冲甄别器‘缚Ⅲ1 脉冲幅度甄别器的主要任务就是剔除噪声脉冲，把淹没在噪声信号中的光子信号 筛选出来，以达到真正的光子计数的目的。在脉冲幅度甄别器里设有一个连续可调的 竺堂鹇K一 比较电压K。需要注意的是：当用单电平的脉冲高度甄别输出时，对应某一电平值V， 得到的脉冲幅度大于或等于V的脉冲总计数率，因而只能得到积分曲线，其斜率最小 值对应的V就是最佳甄别电平K，在高于最佳甄别电平K的曲线斜率最大处的电平K 后的一段为单光子峰。 §2．6荧光寿命测量方法 2．6．1荧光寿命测试原理⋯“” 当某种物质被激发光激发后，该物质的分子在吸收能量后将从基态跃迁到激发态， 停止激发后，再以辐射跃迁或交叉驰豫(非辐射跃迁)的形式在很短的时间内自跃迁 回基态。荧光体在激发光的激发下，一开始处于激发态的粒子数较多，发出的荧光较 强，随着时间的推移，激发态的粒子数越来越少，发光也越来越弱。这种发光强度下 降的过程称为光衰减。当分子的荧光强度降到激发时最大强度的1／e．时，所需要的时 间称为该荧光物质在测定条件下的荧光寿命，常用t表示。图2．2l所示为荧光强度 衰减曲线， 爱 先 程 艘 H0啦 O 时阀 图2．21荧光寿命衰减曲线 (雷中I(O)为初始荧光强度，I(t)表示荧光强度随着时间的变化曲线) 由于荧光很弱，在背景光的条件下很容易被湮没，再者探测器没有频谱分析特性，所 以必须把激发与探测分开交替进行。 2．6．2荧光寿命的测量方法 对于荧光寿命的测量，若用脉冲激发光激发时，可用时间相关单光子计数法和脉 冲取样法。其中时闻相关单光子计数法荧光寿命测量是一种时域时间分辨的弱光信号 的测量方法。时间相关单光子计数法的原理是基于周期性光信号的单光子探测，能对 单个光子的探测时间测量，重建出整个光信号的波形。此方法是依据这样的事实，即 探测很弱的高重复频率光信号时，这种光信号是如此的弱，以至于在一个信号周期内 探测到一个光子的几率小于l。探测器接受到的信号由一串随机分布的脉冲组成，每个 脉冲表示探测到了光子，有许多信号周期内没有光子，其他周期是含有一个光子的脉 冲，而含有几个光子的周期信号几乎是没有的。当探测到一个光子就记录下该光子对 应的探测器脉冲时间，并在该时间对应的计数存储器上加1。经过多次探测后，在时间 计数存储器内就记录了随时阊分布的光子数柱状图，柱状图又与荧光强度分布是相关 联的，从而构建出荧光光脉冲的波形⋯1。时间相关单光子计数具有超高时间分辨率(可 达25ps)，超高灵敏度(低于单个光子水平)、短的测量时间、高动态范围、高线性度、 非常好的信噪比和高增益稳定性。 第三章光电检测实验设计 §3．1可行性方法 在实际可运用的光源中，我们选择氮分子激光器和氙灯光源，由于氮分子激光器 具有窄带的337．Inm的紫外光源，它介于血“离子的吸收光谱内，并且激光光源的单 色性好，峰值功率高，单位面积的光斑能量高，平均功率>50mW。氙灯具有250～800nm 的带宽，如果选择紫外波段，就需要一套滤光片，这样在紫外300～360nm的波段内平 均功率必然会降低很多，而且氙灯光源工作期间产生大量热量，工作时间在3000小时 左右，这完全影响到灯的使用效率。比较两者，氮分子激光器具有更好利用率。 对微弱荧光信号的检测：①利用光电倍增管对弱荧光信号进行光电转换，现在光 电倍增管的种类很多，有很多多碱阴极材料吸收紫外波段，光电倍增管具有九个以上 的打拿级，能对电子信号进行放大。②光子计数器，其前端也是利用光电倍增管进行 光电转换以及放大，只是在其后部加入甄别器，给一个连续可调的电压进行调节输出。 这样的工作完全不用买一套完整的单光子计数器，我们可以通过电脑采集卡完成甄别 的工作，而且通过软件可以直接提取数据，形成立体三维图样，更直观的反应光谱和 荧光寿命的信息。 在比较了光源和信号放大系统的各种因素，和利用手头现有设备，我们决定利用 氮分子激光器作为光源，通过光栅单色仪和光电倍增管作为信号放大设备，通过Boxcar 积分器，对信号进行采集整理，设置延时、采样门宽、积分时间和积分常数，可以从 打印机上获得时间分辨荧光光谱图。对于计算荧光的寿命，可以采取直接读取，对放 大后的信号，利用数字示波器，存储信号，通过示波器上的电压和周期，计算荧光的 寿命。还可以通过RC电路拟合的方法计算荧光寿命。对于用数字采集卡代替积分器， 我们打算在这个方案可行性通过后立即展开，由于还需要编程人